柑桔黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)检测

为了建立黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)快速检测体系,丰富柑桔黄龙病的高效简便检测方法,以黄龙病菌株psy62全基因组中的单拷贝tufB-secE-nusG-rplKAJL-rpoB基因簇序列和5拷贝核糖核苷酸还原酶β亚基基因(nrdB)序列设计并筛选特异性引物,经灵敏度比较和检测特异性验证,建立该病的RPA检测体系,并经PCR、RPA和实时荧光PCR对87份柑桔样品的黄龙病菌进行对比检测,验证RPA检测体系的适用性。结果表明,建立的黄龙病菌RPA检测方法能特异性检测柑桔黄龙病;灵敏度与实时荧光PCR相当,是PCR的100倍;扩增过程只需20 min,大幅提高检测效率;对田间疑似柑桔黄龙病的送检样品检测结果与实时荧光PCR一致,比PCR的检出率高。     

重组酶聚合酶扩增技术在番茄黄化曲叶病毒检测中的应用

番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）是引起番茄黄化曲叶病毒病的病原,在生产中造成严重危 害,开发快速准确的检测方法对该病害的防控具有重要意义。依据番茄黄化曲叶病毒DNA-A 基因序列,设计用于重组酶聚 合酶等温扩增（RPA）检测的特异性引物,建立了TYLCV 的重组酶聚合酶等温扩增检测方法,并分析该方法的特异性和灵 敏度。结果表明,建立的TYLCV-RPA 方法可从TYLCV 阳性的番茄样品中扩增出343 bp 的特异性条带,反应条件为37 ℃ 恒温下40 min,扩增时间短,对设备要求低,且与番茄其他病毒无交叉反应,特异性好,灵敏度可达到PCR 方法的10 倍, 适用于TYLCV 的快速检测。     

基于重组酶聚合酶扩增技术（RPA）的柑橘溃疡病菌检测方法

根据柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri ssp. citri,Xcc)基因组的保守序列设计特异引物,通过对引物浓度、反应温度和反应时间条件优化,建立了柑橘溃疡病菌重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)检测方法。该方法无需PCR仪等复杂设备,在39℃恒温反应30 min即可完成检测过程,快速简便。该检测方法与其他柑橘病原无交叉反应,特异性强;检测灵敏度是普通PCR的100倍,与实时荧光定量PCR基本一致。对71个柑橘样品进行检测,RPA检测出溃疡病阳性样品22个,与PCR、实时荧光定量PCR检测结果一致。     

葡萄炭疽病可视化LAMP检测体系的建立及应用

【目的】建立葡萄炭疽病LAMP检测方法。【方法】在葡萄炭疽病菌ITS序列片段设计LAMP特异性引物,优化反应条件,建立葡萄炭疽病LAMP检测体系,并利用荧光显色剂(0.05 mmol·L-1钙黄绿素和0.5 mmol·L-1氯化锰混合液)实现检测结果的可视化;同时对该体系进行特异性和灵敏度的验证,对采集自5个地区的田间样品进行实测。【结果】除染病的待检样品有特异性反应,观察到亮绿色荧光信号外,其他供试菌株均无特异性扩增反应;对葡萄发病组织总DNA的检测灵敏分别是定量PCR和常规PCR的1/10和100倍,检测限达到了5×10-4mg·L-1;对来自福建等5个地区的样品进行实测,结果表明待检样品中有81.5%感染葡萄炭疽病菌,该检测结果与定量PCR的检测结果完全一致。【结论】本研究建立了一种基于荧光显色的可视化LAMP检测体系,该体系可用于葡萄炭疽病的田间样品检测。     

杏鲍菇枯萎病菌PCR检测方法的建立与初步应用

以杏鲍菇枯萎病菌侧耳泛菌(Pantoea pleuroti)为试材,采用PCR引物设计的方法,通过分析P.pleuroti基因组的测序结果,设计合成并筛选出可检测P.pleuroti的引物,并研究其检测效果,以期建立P.pleuroti的高效PCR检测体系,并为科学防控杏鲍菇枯萎病提供分子基础。结果表明:K3143F/R和K37F/R 2对引物特异性强,仅P.pleuroti基因组DNA作为模板时,PCR扩增产物分别呈现1条660 bp和1条666 bp的特异性条带,15株Pantoea属细菌和3株食用菌常见病原菌的基因组DNA及阴性对照作为模板扩增产物均无条带;基于这2对引物建立的检测体系均不受杏鲍菇组织液的干扰,灵敏度高,可检测出最低3.6 pg·μL^-1的P.pleuroti基因组DNA;应用这2种体系对接种P.pleuroti 48 h后的杏鲍菇样品进行了检测,最低可检测出子实体内100 cfu的杏鲍菇枯萎病菌;此外,整体上,引物K3143F/R比K37F/R的检测效率更高。     

基于SRAP的松茸与假松茸特异性分子标记

从300对SRAP引物组合中分别筛选出一对对松茸(Tricholoma matsutake)有特异性的引物(ME6,EM26)与一对对假松茸(Tricholoma bakamatsutake)有特异性的引物(ME9,EM7),并将这两对引物扩增的特异条带进行克隆、测序;在此基础上重新设计引物后成功地构建了松茸特异性分子标记(Tm1/Tm2)和假松茸特异性分子标记(Tb1/Tb2)。Tm1/Tm2在所有供试松茸样品中均能扩增出243bp的条带,Tb1/Tb2在所有供试假松茸样品中均能扩增出389bp条带。这两种标记可在分子水平上快速、准确地鉴定出松茸和假松茸。     

柑橘褪绿矮化相关病毒LAMP检测体系的建立

根据GenBank登录的柑橘褪绿矮化相关病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)的移动蛋白(MP)基因序列设计了一组特异性引物,经体系优化,建立了CCDaV的环介导等温核酸扩增(LAMP)检测方法。结果显示该方法能特异扩增CCDaV,与其他5种柑橘病原物(柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒和柑橘黄龙病菌)不发生反应;灵敏度为PCR的100倍,与实时荧光PCR的灵敏度相同。用LAMP方法对50个田间样品进行检测,与PCR和实时荧光PCR的检测结果一致,证明该方法可用于田间样品的检测。该LAMP检测方法可特异、灵敏、快速地对CCDaV样品进行检测。     

基于SRAP的松茸特异性分子标记

为了准确鉴定松茸,确保消费者品尝到货真价实的松茸,该研究基于SRAP(sequence-related amplified polymorphism分子标记,从300对引物组合中分别筛选出1对松茸特异性引物(ME10、EM6),并将这对引物扩增的特异条带进行克隆、测序和设计引物后,成功地构建了松茸特异性分子标记(304 bp)。松茸在特异性分子标记(304 bp)均能扩增出条带,该标记在分子水平上可准确、快速地鉴定出松茸,并可有效地保证松茸的品质。     

红掌根腐病病原鉴定及其PCR 检测方法

 利用真菌通用引物ITS1 和ITS4 扩增红掌根腐病菌转录间隔区并进行序列测定,通过序列 比较,设计了1 对红掌根腐病菌的特异引物SF1/SR2,对30 个红掌根腐病病原菌、8 种其它真菌和2 种 细菌基因组DNA 进行PCR 扩增。结果表明,只有红掌根腐病菌获得572 bp 的特异带。使用引物SF1/SR2 对华丽腐霉进行PCR 扩增,其检测灵敏度在DNA 水平上可达1 pg。运用设计的引物从红掌根腐病菌基 因组DNA 以及人工接种和自然发病的红掌植株中扩增到572 bp 的特异片段,实现了对红掌根腐病菌的快 速可靠的检测。     

甘肃地区番茄细菌性斑点病菌的鉴定与检测

从番茄病果上分离纯化的细菌菌株,经致病性测定、形态特征、培养特性观察及16S rDNA
序列测定,鉴定为番茄细菌性斑点病菌Pseudomonas syringae pv. tomato（Okabe）Young,Dye et Wilkie。
利用特异性引物对已鉴定菌株及番茄发病组织进行PCR 扩增,均扩增出530 bp 左右的特异性片段,印证
了可利用特异性引物MM5F/MM5R 对分离菌株或番茄发病组织进行PCR 扩增以检测番茄细菌性斑点病菌。     

美味侧耳ITS序列直接测序与克隆测序比较分析

用CTAB法提取美味侧耳基因组DNA，利用引物ITS1和ITS4扩增其核糖体DNA的ITS片段，凝胶回收试剂盒纯化目的片段。通过PCR产物双向直接测序和克隆测序分别获得其rDNA ITS序列，对两种测序方法所得序列及GenBank中美味侧耳ITS片段的序列进行比较分析。结果显示，三条序列的差异非常小，两种测序方法所得序列仅在两端出现差异，序列内部完全一致。     

白菜类作物ITS序列分析

以不同地理来源的18份不同类型的白菜类作物（Brassica campestris L.）为试材,对其ITS区进行扩增、测序和序列比对,构建NJ系统树,研究白菜类作物ITS序列的变异情况。结果表明：白菜类作物中不同类型材料的ITS序列没有明显变异,序列非常保守;白菜类作物与芸薹属其他种间存在明显变异。芸薹属中的基本种内的变种间没有明显变异;复合种内的变种间有明显变异,分别倾向于禹氏三角（U-triangle）假说推测的父母本。     

2个不同来源真姬菇子实体同源性的分子鉴定

为了研究2个真姬菇子实体的同源性,应用ERIC—PCR图谱分析和ITS序列分析对其进行了详细的研究。ERIC—PCR结果显示2个真姬菇存在条带多样性差异,应为不同品种或不同菌株（品系）;ITS序列测定结果显示2个真姬菇样品仅存在3个碱基差异,属于同一品种。2种分子方法结合分析表明,这两个真姬菇子实体来自同一个品种的不同亚种或不同菌株（品系）,拥有独立知识产权。     

块菌rDNA的ITS序列分析试验条件的初步研究

以我国云南和四川产的5个块菌菌株为试验材料，提取块菌DNA并对rDNA的ITS序列分析试验条件的初步研究，结果表明：运用常规CTAB法提取块菌子实体DNA．获得的DNA产量高，可以满足本试验的要求：明确了rDNAITS区域的适宜PCR扩增和克隆条件：获得4个长度为650bp、1个长度为800bp的PCR产物：将PCR产物连接到PMD18-T载体上．转4LE．coliJM109．获得了阳性克隆．供进一步序列分析用。     

不同地区松茸ITS序列分析及系统发育研究

对吉林省延吉市和云南省昆明市松茸子实体的ITS序列进行遗传多样性研究。提取两个地区松茸子实体的基因组DNA,应用特异引物对其ITS序列进行PCR扩增及测序,并对云南省昆明市松茸样品进行克隆及测序。之后从GenBank上获取5个地区7条松茸ITS序列,并利用MEGA、BLAST、DNAMAN和ClustalX软件进行对比分析和构建系统发育树。对云南松茸样品克隆发现,ITS序列中有A与G、T与c的颠换,并插入1个碱基T。序列对比发现,松茸ITS序列长度在600bp～604bp范围内,G＋C含量在43．0％～44．2％之间,共有41个变异位点,ITS2变异位点数要多于ITSl的变异位点数。同时,多个位点存在着转换、颠换、插入和缺失,表明不同产地松茸ITS序列在进化过程中存在差异,为真菌分类、鉴定等研究提供了重要的资料和依据。     

葡萄SNP 标记的CAPS 和TSP 分析

 为了建立起葡萄SNP 标记分析的一般方法和探索EST-SNP 标记在葡萄中的应用，对前期开 发的葡萄EST-SNP 位点进行了筛选，设计了28 对CAPS（cleaved amplified polymorphic sequences，酶切 扩增多态性序列）标记引物和22 对TSP（Temperature-switch PCR，温度转变PCR）标记引物，并在31 份葡萄材料中进行了分析，其中20 对CAPS 引物和10 对TSP 引物电泳条带较清晰，多态性较好。基 因分型统计显示：所有的SNP 位点均含有2 个等位基因，平均多态性信息含量（PIC）为0.336，平均 Shannon’s 信息指数为0.511。基因分型和葡萄材料聚类结果均显示这两种方法所获结果提供的信息量大且 结果可靠。本方法简便、成本低，可作为SNP 分型有效方法用于葡萄品种鉴定、基因分型和遗传多样性 分析等。     

RFLP在鳞翅目蛹虫草菌鉴别中的应用

本文应用RFLP技术鉴别两未知菌株S1001和S1002是否系鳞翅目蛹虫草菌(Cordyceps milicaris)。试验以ITSl,TTS4为引物,PCR扩增rDNA的5.8S+ITS区段,扩增产物纯化后用DNA限制性内切酶酶切,获得DNA的RFLP图谱,并同ATCC模式菌株的RFLP图谱相比较。结果表明:三个作为对照的ATC菌株具相同的RFLP图谱,而两待鉴定菌株之间存在差异,且明显不同于ATCC模式菌株,从而证明,两待鉴菌株与ATCC菌株之间在rDNA区域具有明显的结构差异,故推断两待鉴定菌株不隶属于鳞翅目蛹虫草菌。     

基于ITS序列的胭脂萝卜亲缘关系分析

以胭脂萝卜为试材,采用PCR扩增其ITS1-5.8SrRNA-ITS2序列,研究了序列同源性并构建系统发育树,以期为胭脂萝卜亲缘关系分析提供参考依据。结果表明:胭脂萝卜ITS1-5.8SrRNA-ITS2序列总长度为655bp,ITS1(G+C)含量为51.4%,长度为220bp;5.8SrRNA(G+C)含量为53.4%,长度为217bp;ITS2(G+C)含量为55.1%,长度为218bp。胭脂萝卜与台北的Mei-Hwa、南京的Cd-03、台北的Mei-Nong、南京的Yanghua、杭州的Baiyuchun、渥太华的SW77的同源性最高(99%),归为同一种。由系统发育树可得20个样品的总平均遗传距离是0.134,结合形态学特征表明待测胭脂萝卜可能由白皮白心萝卜进化而来。     

中国兰属植物种间及品种间亲缘关系的RAPD分析

 利用RAPD分子标记分析中国兰属(Cymbidium ) 的28个原生种和部分种的不同品种及3个杂交种共50个材料间的亲缘关系。获得250条可明显区分的DNA扩增片段, 除S143-850 bp 1条带为全部材料共有外, 其余带均为多态性位点。这些带最大的为2 100 bp, 最小的为200 bp, 以集中在1 031～300 bp的带居多。UPGMA进行聚类分析显示: RAPD的聚类树状图所呈现出的亲缘关系大体与ITS系统发育树一致。建兰亚属可能为一自然类群。大花亚属并非自然类群, 其成员之一文山红柱兰(C. Wenshanense Y.S. Wu et. ) 偏离出去而与兰亚属聚在一起。兰亚属则为一高度异质性的类群, 分散成互不关联的3支。本结果和ITS系统发育分析表明, 有必要对经典分类的兰属属下分类, 特别是兰亚属进行修订。对3个亚属中各组的划分基本与传统分类的一致。春兰品种间的多样性高于其它测试品种。     

Development of DNA markers for hybrid identification in Leucadendron (proteaceae)

A rapid and reliable method to accurately identify hybrids at an early age is essential to the success of Leucadendron breeding programs because identification based on morphology can be difficult or impossible when the seedlings are young. DNA based PCR-RFLP and random amplified microsatellite polymorphism (RAMP) markers were developed for this purpose. Unexpected non-parental fragments appeared during the PCR-RFLP analysis of the nuclear ITS region of L. uliginosum 05 × L. procerum 04 hybrids. Mixing DNA from both parents in a single PCR also produced the non-parental fragment, suggesting that PCR recombination had introduced a novel restriction site into the products from the hybrids. Sequencing of individual amplified ITS products from the hybrids confirmed this conclusion. To avoid this complication, RAMP markers were developed for accurate hybrid identification in Leucadendron. RAMP analysis generated a considerable number of polymorphic products, and showed more discrimination in identifying Leucadendron hybrids than did PCR-RFLP.