马尾藻多糖对奥尼罗非鱼生长性能·血液生化指标和免疫调节的影响

［目的］研究马尾藻多糖对奥尼罗非鱼生长性能、血液生化指标和免疫调节的影响。［方法］采用 奥尼罗非鱼作为试验对象,在饲料中分别添加不同水平的马尾藻多糖（添加量分别为0、0.10%、0.15%和0.20% ）,饲养30日后测定奥尼罗非鱼的增重率、特定生长率、饲料系数、血液生化指标和非特异性免疫指标。［结果］浓度为0.10%的马尾藻多糖能极显著提高奥尼罗非鱼的增重率、生长速度和降低饲料系数（P〈0.01）,并能显著提高血液中红细胞数、总蛋白和血糖的含量 （P〈0.05）;浓度为0.15%的马尾藻多糖能极显著提高其总蛋白含量（P〈0.01）和显著提高血液中超氧化物歧化酶、溶菌酶和酸性磷酸酶活力（P〈0.05）;浓度为0.20%的马尾藻多糖能极显著提高其血液中总蛋白含量和酸性磷酸酶活力（P〈0.01）,并显著提高溶菌酶活力（P〈0.05）。［结论］马尾藻多糖能显著提高奥尼罗非鱼的生长性能和非特异性免疫水平,在奥尼罗非鱼饲料中马尾藻多糖的适宜添加量为0.10%-0.15%。     

尼罗罗非鱼CRTC2基因克隆及其表达规律分析

[目的]掌握尼罗罗非鱼活化环磷酸腺苷效应元件结合蛋白调节转录共激活因子2(CRTC2)基因的表达变化规律,并探究饥饿对其表达的影响,为研究尼罗罗非鱼CRTC2基因功能打下基础.[方法]采用RACE-PCR从尼罗罗非鱼肌肉组织中克隆CRTC2基因,对其进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析不同组织/器官中CRTC2基因的表达量.[结果]尼罗罗非鱼CRTC2基因全长6927 bp,其开放阅读框(ORF)2388 bp,5'端非编码区(5'UTR)343 bp,3'端非编码区(3'UTR)4196 bp,编码795个氨基酸,具有保守的CORC-N、CORC-M和CORC-C结构域.由基于CRTC2氨基酸序列同源性构建的系统发育进化树可知,尼罗罗非鱼与红鳍东方鲀的亲缘关系最近.尼罗罗非鱼的白肌、红肌、心脏、脾脏、肝脏、肾脏、脑组织和肠道等8个不同组织/器官中均有CRTC2基因表达,但以脑组织和白肌中的表达量较高;与正常投喂的尼罗罗非鱼相比,饥饿7 d的尼罗罗非鱼白肌CRTC2基因表达无显著变化(P>0.05),但饥饿15 d后CRTC2基因表达显著上调(P<0.05).[结论]尼罗罗非鱼各组织/器官中CRTC2基因的表达具有一定规律性,长期饥饿会影响CRTC2基因表达,即CRTC2可能与糖代谢密切相关,直接或间接影响尼罗罗非鱼的能量吸收和代谢.因此,尼罗罗非鱼CRTC2基因可作为信号转导调控糖代谢的候选基因.     

GM-CSF与生长抑素融合表达质粒对小鼠肌肉组织GHR和IGF-I mRNA表达的影响

选择70只小白鼠,随机分为7组,每组10只,雌雄各半。其中第1组为对照组,第2-4组分别肌肉注射pcS/2SS、pGM-CSF/SS和pGM-CSF+pcS/2SS DNA疫苗;第5～7组分别口服以减毒沙门氏菌为载体的pcS/2SS、pGM-CSF/SS和pGM-CSF+pcS/2SS DNA疫苗,以β-actin作为内参,利用相对半定量RT-PCR,检测小鼠肌肉组织GHR和IGF-I mRNA的表达。结果表明:第3、5和6组的GHR mRNA表达显著高于1组和7组(P<0.05),第5和6组的IGF-I mRNA表达显著高于1组、2组、4组和7组(P<0.05),GM-CSF与SS的融合表达质粒(pGM-CSF/SS)的GHR和IGF-I mRNA表达高于pGM-CSF+pcS/2SS共同免疫,同种DNA疫苗,口服免疫组的GHR和IGF-I mRNA表达总体上比肌肉注射组要高。这些结果证明,GM-CSF可促进SS DNA疫苗的免疫效果,提高肌肉组织中GHR和IGF-I mRNA的表达;pGM-CSF/SS效果优于pGM-CSF+pcS/2SS,口服免疫组要优于肌肉注射免疫组。     

牦牛MPC1和MPC2基因克隆及其组织表达特征分析

【目的】明确牦牛线粒体丙酮酸载体编码基因（MPC1和MPC2）的分子生物学特性及其组织表达特征,为揭示MPC基因在牦牛适应高原环境和能量代谢中的作用机制提供理论依据。【方法】选取麦洼牦牛为研究对象,PCR扩增牦牛MPC1和MPC2基因编码区（CDS）序列,利用在线生物信息学分析软件预测其蛋白结构及理化性质,并以实时荧光定量PCR检测MPC1和MPC2基因在不同年龄（0.5、1.5和2.5岁）牦牛各组织中的表达情况。【结果】牦牛MPC1基因CDS序列长330 bp,共编码109个氨基酸残基;MPC2基因CDS序列长384 bp,共编码127个氨基酸残基。基于MPC1和MPC2基因CDS序列相似性构建的系统发育进化树显示,牦牛分别与黄牛和水牛的亲缘关系最近,与绵羊的亲缘关系最远。牦牛MPC1和MPC2蛋白均为稳定的亲水性蛋白,丙氨酸和亮氨酸含量较高,有跨膜结构但无信号肽,均存在1个MPC结构域;其二级结构以α-螺旋为主（分别占57.80%和55.12%）,三级结构模型为5xpd.1.A。MPC1和MPC2基因在2.5、1.5和0.5岁牦牛心脏中的相对表达量均最高,其次是肾脏和肝脏,而在脾脏...     

尼罗罗非鱼P2X4R基因克隆及原核表达分析

[目的]克隆尼罗罗非鱼P2X4R基因,并构建原核表达载体进行诱导表达,为深入研究P2X4R在鱼类中的生物学功能打下基础.[方法]利用PCR克隆尼罗罗非鱼P2X4R基因的3个片段(G1、G2和G3),拼接获得目的基因后连接pCold II载体构建pCold II-P2X4R重组质粒,再转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以IPTG进行诱导表达.分别采用SDS-PAGE和Western blotting检测分析重组蛋白P2X4R的表达情况,并运用生物信息学在线分析软件对其理化性质、糖基化位点、跨膜区域、亚细胞定位及信号肽等进行预测分析.[结果]克隆获得的尼罗罗非鱼P2X4R基因大小为1108 bp,与pCold II载体重组后转化BL21(DE3)感受态细胞获得的原核表达载体经IPTG诱导可表达获得目的蛋白,在IPTG 1.0 mmol/L、37℃诱导4 h的条件下重组蛋白表达量高于在IPTG 0.1 mmol/L、16℃过夜诱导的表达量.重组蛋白P2X4R的分子量约43.0 kD,其氨基酸数量为354个,理论等电点(pI)为6.78,不稳定指数为37.62,属于稳定蛋白,脂肪族指数为74.35;重组蛋白P2X4R具有3个N-糖基化位点和1个O-糖基位点;该蛋白未见跨膜区,其蛋白几乎100%位于细胞膜内,不含信号肽.[结论]诱导表达获得的尼罗罗非鱼P2X4R蛋白具有3个N-糖基化位点和1个O-糖基化位点,推测其存在糖基化现象,可制备相应抗体用于揭示罗非鱼巨噬细胞的抗原呈递作用机制.     

木薯过氧化物酶基因序列分析及其乙烯和茉莉酸甲酯诱导表达特性

[目的]分析木薯Class Ⅲ过氧化物酶(POD)基因(MePOD)的序列特征,并检测乙烯(ET)和茉莉酸(JA)逆境信号对其表达的影响,为研究木薯对逆境胁迫的响应和调控模式及培育抗逆新品种提供理论依据.[方法]从木薯基因组数据库中获取MePOD基因序列并进行分析;以木薯品种华南8号悬浮培养细胞为材料,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测木薯MePOD基因在乙烯利和茉莉酸甲酯(MeJA)处理后的表达特性.[结果]MePOD基因编码区含4个外显子和3个内含子;转录起始位点位于起始密码子上游1061 bp处;启动子区域含多个顺式作用元件,但无ET和JA响应元件.MePOD蛋白由33 1个氨基酸组成,分子量为37.476kD,理论等电点为8.66;有一个含信号肽的跨膜结构,是一种阳离子分泌型Class Ⅲ POD.系统发育进化树分析结果表明,木薯MePOD蛋白与大戟科橡胶树(Hevea brasiliensis,ADR70870.1)的亲缘关系最近,且除两种裸子植物外,其他17种被子植物聚为一类,且同一科植物进一步相聚,此结果与进化地位一致.和CR检测结果表明,MeJA涛导0.5 h后,MePOD基因表达量整体上呈先升高后下降的变化趋势,而乙烯利诱导0.5h后其表达量呈缓慢上升的变化趋势,但整体上维持在本底水平之下.[结论]JA和ET逆境信号不直接通过相应响应元件上调MePOD基因表达,而与其他激素信号进行综合调控,并进一步参与植物体内的抗氧化过程.     

尼罗罗非鱼TIRAP基因克隆、组织表达及其在无乳链球菌、脂多糖和聚肌胞苷酸刺激下的免疫应答

为研究包含TIR结构域的接头蛋白(TIR domain-containing adaptor protein,TIRAP)基因在TLR信号介导的先天免疫中的调控作用,通过反转录-聚合酶链式反应和分段扩增获得了尼罗罗非鱼Oreochromis niloticusTIRAP基因的cDNA全长,并对其生物信息学进行分析,利用RT-qPCR法分析TIRAP在健康鱼各组织中的表达情况,以及在无乳链球菌Streptococcus agalactiae、脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激后不同组织不同时间点的表达量变化。结果表明:TIRAP cDNA全长2 900 bp,开放阅读框为816 bp,可编码291个氨基酸;系统进化分析显示,尼罗罗非鱼与快乐东方鲷Astatotilapia calliptera TIRAP的亲缘关系较近;TIRAP在尼罗罗非鱼11个组织(肝、皮肤、心脏、肾、胃、鳃、脑、脾、肠、血液和肌肉)中均有表达,其中肌肉中表达量最高(P<0.05),胃中表达量相对较低;人工感染无乳链球菌引起TIRAP基因在肠和肾中上调表达,均在注射后1 d时表达量达到最大值;LPS和Poly I:C刺激引起TIRAP基因在肝、脾和肾中上调表达,但在肠中表达量均低于对照组(0 h)。研究表明,无乳链球菌、LPS和Poly I:C均能诱导TIRAP基因表达,TIRAP基因参与了尼罗罗非鱼免疫应答反应,暗示TIRAP在先天免疫中发挥作用。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白的原核表达及其抗原性分析

根据GenBank中登录的PCV-2序列,设计1对特异性引物,PCR扩增PCV-2去除核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的Cap蛋白基因,经Bam HI和Xho I双酶切后将其插入到表达载体pEGX-4T-1多克隆位点,并转化到表达菌株Rossetta(DM3)中,采用IPTG进行诱导表达,采用SDS-PAGE薄层灰度分析表达情况,收集菌体,使用GST-Protein Purification Kit亲和层析纯化方法对表达的GST-Cap融合蛋白蛋白进行纯化,SDS-PAGE电泳检测纯化效果,Western blot分析纯化后的重组Cap蛋白(rCap)免疫学活性。结果表明,成功克隆了大小为579 bp去除核定位信号的ORF2基因,成功诱导表达出预期大小45.3 ku相一致的rCap蛋白,表达量占总菌体的25%,纯化后的rCap蛋白SDS-PAGE电泳分析纯度达到90%以上,Western blot分析表明纯化的rCap蛋白能与PCV-2阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫学活性。     

神经介素B及其受体在不同发育阶段山羊睾丸组织中的差异表达

[目的]本试验旨在探究神经介素B(NMB)及其受体NMBR[还包括胃泌素释放肽受体(GRPR)和蛙皮素受体(BRS3)]在山羊不同发育阶段睾丸组织中的差异表达,为解析哺乳动物睾丸发育及功能调节机制提供参考。[方法]选取系谱清晰和体况良好的雄性山羊12只(3月龄和9月龄,各6只)进行阉割并采集睾丸组织,在克隆NMB及其受体基因与分析序列的基础上,采用免疫组化技术检测NMB及其受体在睾丸组织中的表达定位,利用RT-qPCR和Western blot检测NMB及其受体在不同发育阶段山羊睾丸组织中的表达变化。[结果]NMB及其受体基因与绵羊和牛的进化关系最近,NMB及其受体基因编码区的核苷酸序列与牛和绵羊的同源性达96%以上,结构分析发现NMBR、GRPR和BRS3均属于7次跨膜受体。NMB及其受体在3月龄和9月龄山羊睾丸组织中广泛表达,其中在间质细胞、肌样细胞和精子细胞中呈高表达。与3月龄山羊相比,9月龄山羊睾丸组织中NMB与GRPR的mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.05),而NMBR与BRS3的mRNA和蛋白表达量显著增加(P<0.05)。[结论]NMB及其受体可能参与山...     

吉富罗非鱼组蛋白酶B基因克隆及无乳链球菌感染后的表达分析

【目的】探究组蛋白酶B基因（CtsB）在吉富罗非鱼感染无乳链球菌前后的表达差异,为深入研究罗非鱼抗无乳链球菌感染的免疫应答机制及后续通过SNP分子标记/基因组编辑技术快速获得吉富罗非鱼抗病新品种提供科学依据。【方法】通过RACE克隆罗非鱼CtsB基因cDNA全长序列,使用SMART、Splign、MEGA v6.0、BoxShade及MegAlign等在线软件进行生物信息学及系统进化分析,并以实时荧光定量PCR检测吉富罗非鱼CtsB基因组织表达谱及无乳链球菌感染后CtsB基因的表达变化规律。【结果】吉富罗非鱼CtsB基因cDNA序列全长1746 bp,包括161 bp的5’端非编码区（5’-UTR）、592 bp的3’端非编码区（3’-UTR）及993 bp的开放阅读框（ORF）,共编码331个氨基酸残基。基于CtsB氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,吉富罗非鱼与奥利亚罗非鱼的亲缘关系最近,而与鲤鱼、大菱鲆、牙鲆、半滑舌鳎等物种相距较远。CtsB基因在吉富罗非鱼的肝脏、脾脏、鳃、前肾、脑、肠道、皮肤和肌肉等组织中均有表达,且以鳃组织中的相对表达量最高,是其他器官组织的2.0～3...     

罗非鱼源Ia和Ib血清型无乳链球菌可溶性蛋白差异分析

前期研究表明,罗非鱼Oreochromis niloticus Ia和Ib血清型无乳链球菌Streptococcus agalactiae疫苗之间缺乏交叉保护力,为了从蛋白分子水平探讨其免疫原性差异的原因,在提取罗非鱼Ia和Ib血清型无乳链球菌可溶性蛋白后应用二维差异凝胶电泳(two dimension-Difference Gel Electrophoresis,2D-DIGE)分析其表达差异蛋白点,应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定这些差异蛋白,并使用DAVID生物学数据库预测经鉴定后获得的蛋白功能。结果表明:在2D-DIGE电泳上,Ia和Ib两种不同血清型无乳链球菌具有167个表达差异蛋白点,对这些蛋白点进行质谱分析获得32种蛋白,这些蛋白主要与氧化还原反应、代谢与能量前体物产生、糖代谢反应等生物学过程有关,主要参与糖解和糖异生作用、丙酮酸代谢与脂肪酸生物合成等通路;对蛋白功能的预测表明,GAPGH、半胱氨酸合成酶和锰依赖性锰超氧化物歧化酶的功能与免疫和疫苗研发相关。本研究首次证实,罗非鱼Ia和Ib血清型无乳链球菌存在较多的表达差异蛋白,部分表达差异蛋白的功能与免疫和疫苗研发相关,这可能与链球菌免疫原性有直接关系,但需要进一步地研究和证实。     

罗非鱼源Ia和Ib血清型无乳链球菌可溶性蛋白差异分析

前期研究表明,罗非鱼Oreochromis niloticus Ia和Ib血清型无乳链球菌Streptococcus agalactiae疫苗之间缺乏交叉保护力,为了从蛋白分子水平探讨其免疫原性差异的原因,在提取罗非鱼Ia和Ib血清型无乳链球菌可溶性蛋白后应用二维差异凝胶电泳(two dimension-Difference Gel Electrophoresis,2D-DIGE)分析其表达差异蛋白点,应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定这些差异蛋白,并使用DAVID生物学数据库预测经鉴定后获得的蛋白功能。结果表明:在2D-DIGE电泳上,Ia和Ib两种不同血清型无乳链球菌具有167个表达差异蛋白点,对这些蛋白点进行质谱分析获得32种蛋白,这些蛋白主要与氧化还原反应、代谢与能量前体物产生、糖代谢反应等生物学过程有关,主要参与糖解和糖异生作用、丙酮酸代谢与脂肪酸生物合成等通路;对蛋白功能的预测表明,GAPGH、半胱氨酸合成酶和锰依赖性锰超氧化物歧化酶的功能与免疫和疫苗研发相关。本研究首次证实,罗非鱼Ia和Ib血清型无乳链球菌存在较多的表达差异蛋白,部分表达差异蛋白的功能与免疫和疫苗研发相关,这可能与链球菌免疫原性有直接关系,但需要进一步地研究和证实。     

斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)肝脏表达的抗菌肽-2(LEAP-2)在E.coli中的融合表达

抗菌肽是存在于生物细胞中的一类具有强抗菌作用的天然小分子多肽,它们在机体免疫系统中发挥了重要作用,被认为是抗生素的理想替代品.本文通过RT-PCR法从斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的肝脏中分离到抗菌肽-2(LEAP-2)基因,该基因编码94个氨基酸残基组成的多肽;氨基端的信号肽由28个残基组成,成熟肽含有41个残基;对于鱼类和哺乳动物显示高度保守的4个半胱氨酸残基位于多肽的羧基端区域.通过对LEAP-2基因添加EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点和对pET32a进行双酶切处理,成功构建了"pET32a-IpL-2"重组表达质粒,并转化工程茵E.coli BL21(DE3).在工程菌对数生长后期加入诱导剂IPTG、经25℃培养后,可溶性的"trxA-IpL-2"融合蛋白得到高程度的表达.Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析表明,获得了高纯度的目的蛋白.     

鸡BRD2亚细胞定位及其组织表达特性分析

[目的]明确含溴结构域蛋白2(BRD2)的亚细胞定位及其表达特征,为后续研究BRD2基因调控鸡组织发育的作用机制提供参考依据.[方法]通过构建鸡BRD2基因重组真核表达载体pEGFP-BRD2,转染人胚胎肾细胞(HEK-293T)后检测重组蛋白EGFP-BRD2的表达情况及亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR分别检测鸡胚14胚龄(E14 d)、鸡出壳后1日龄(1 d)、7日龄(7 d)和14日龄(14 d)4个时间点各组织中BRD2基因的表达情况.[结果]重组真核表达载体pEGFP-C1-BRD2转染HEK-293T细胞获得的融合蛋白EGFP-BRD2约115.00 kD,且主要定位在细胞核.实时荧光定量PCR检测结果表明,鸡BRD2基因在E14 d和1 d肌胃中的相对表达量最高,在7和14 d肺脏中的相对表达量最高.BRD2基因在各组织的表达规律为:在眼球内E14 d到14 d的表达先下降后趋于稳定;在脑组织和心脏内的表达在E14 d至14 d间呈先下降后上升的变化趋势;在肝脏内E14 d表达稳定,1 d后开始逐渐增加,至14 d时达最高值;在肺脏中E14 d的表达下降,1 d后急剧上升,至14 d时达最高值;在肌胃和胸肌中,均在7 d时最高,1 d时最低,E14 d和14 d时有较高表达,整体上呈倒N表达模式;在腿肌中,从E14 d到1 d表达减少,而后略有增加,7 d后开始下降,至14 d时降到最低值.[结论]鸡BRD2基因重组真核表达载体能在HEK-293T细胞中正确表达,且融合蛋白主要定位在细胞核;BRD2基因在鸡不同发育阶段的各组织中均有表达,但其表达量呈现不同的变化趋势.     

GHR and IGF-Ⅰ mRNA Expression in Muscle Tissue of Mice after Immunization with Fusion-Expression Plasmid Contained GM-CSF and SS

选择70只小白鼠.随机分为7组,每组10只,雌雄各半.其中第1组为对照组,第2-4组分别肌肉注射pcS/2SS、pGM - CSF/SS和pGM - CSF+ pcS/2SS DNA疫苗;第5～7组分别口服以减毒沙门氏菌为载体的pcS/2SS、pGM - CSF/SS和pGM - CSF+ pcS/2SS DNA疫苗,以β- actin作为内参,利用相对半定量RT -PCR,检测小鼠肌肉组织GHR和IGF -Ⅰ mRNA的表达.结果表明:第3、5和6组的GHR mRNA表达显著高于1组和7组(P＜0.05),第5和6组的1GF -Ⅰ mRNA表达显著高于1组、2组、4组和7组(P＜0.05),GM -CSF与SS的融合表达质粒( pGM - CSF/SS)的GHR和IGF -Ⅰ mRNA表达高于pGM - CSF+ pcS/2SS共同免疫,同种DNA疫苗,口服免疫组的GHR和IGF -Ⅰ mRNA表达总体上比肌肉注射组要高.这些结果证明,GM - CSF可促进SS DNA疫苗的免疫效果,提高肌肉组织中GHR和IGF -Ⅰ mRNA的表达;pGM - CSF/SS效果优于pGM - CSF+pcS/2SS,口服免疫组要优于肌肉注射免疫组.     

奶山羊EGFR蛋白胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备

【目的】原核表达奶山羊表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)蛋白胞外区25-644位共620个氨基酸序列(ECD序列),纯化蛋白并免疫家兔,制备针对山羊EGFR蛋白的特异性多克隆抗体,为山羊EGFR蛋白功能研究奠定基础。【方法】以pMD19-T-EGFR为模板,采用PCR方法扩增得到EGFR胞外区(ECD)基因序列。将ECD序列连接pET-32a(+)质粒构建pET-32a(+)-ECD原核表达载体,将该重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。通过Ni-Charged MagBeads纯化重组蛋白后免疫2月龄白色獭兔,采用间接ELISA(iELISA)法测定抗体效价,Western blot检测抗体特异性。【结果】PCR扩增得到1 860bp的EGFR胞外区基因序列,成功构建pET-32a(+)-ECD载体。加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG,于37℃诱导表达6h成功得到重组蛋白,该蛋白分子质量约94ku,且为以包涵体形式存在的变性蛋白。iELISA检测抗体效价为1∶16 000;Western blot检测表明,制备的多克隆抗体能特异性识别原核表达的ECD蛋白及在山羊乳腺上皮细胞和HEK293细胞中的EGFR蛋白。【结论】成功制备山羊EGFR多克隆抗体,该抗体可以用于科研试验。     

罗非鱼源Ⅰa和Ⅰb血清型无乳链球菌可溶性蛋白差异分析

前期研究表明, 罗非鱼Oreochromis niloticus Ⅰa和Ⅰb血清型无乳链球菌Streptococcus agalactiae疫苗之间缺乏交叉保护力, 为了从蛋白分子水平探讨其免疫原性差异的原因, 在提取罗非鱼Ⅰa和Ⅰb血清型无乳链球菌可溶性蛋白后应用二维差异凝胶电泳(two dimension-Difference Gel Electrophoresis, 2D-DIGE)分析其表达差异蛋白点, 应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定这些差异蛋白, 并使用DAVID生物学数据库预测经鉴定后获得的蛋白功能.结果表明: 在2D-DIGE电泳上, Ⅰa和Ⅰb两种不同血清型无乳链球菌具有167个表达差异蛋白点, 对这些蛋白点进行质谱分析获得32种蛋白, 这些蛋白主要与氧化还原反应、 代谢与能量前体物产生、 糖代谢反应等生物学过程有关, 主要参与糖解和糖异生作用、 丙酮酸代谢与脂肪酸生物合成等通路; 对蛋白功能的预测表明, GAPGH、 半胱氨酸合成酶和锰依赖性锰超氧化物歧化酶的功能与免疫和疫苗研发相关.本研究首次证实, 罗非鱼Ⅰa和Ⅰb血清型无乳链球菌存在较多的表达差异蛋白, 部分表达差异蛋白的功能与免疫和疫苗研发相关, 这可能与链球菌免疫原性有直接关系, 但需要进一步地研究和证实.     

猫血管紧张素转换酶2的三维结构模拟与真核表达

家猫能自然及人工感染SARS病毒,本研究旨在探讨家猫ACE2潜在的SARS病毒受体功能。以人血管紧张素转换酶2(ACE2)序列为模板,用同源模建法模拟了家猫ACE2的三维空间结构,发现家猫ACE2与人ACE2结构十分相似,其结合严重急性呼吸综合症(SARS)病毒囊膜纤突(S)蛋白的关键氨基酸的同源性很高(15/18)。将家猫血管紧张素转换酶2基因N端1-367 aa对应的基因片段及其跨膜区克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-his( )B中,构建了表达质粒pcDNA-mA367,转染HeLa细胞,间接免疫荧光检测表明fACE2的N端片段已在细胞膜上成功表达。     

猪EIF2S3基因克隆测序及其组织表达谱分析

[目的]克隆猪EIF2S3基因mRNA全长,并进行生物信息学分析及检测其在猪各组织中的表达特征,为研究真核翻译起始因子2(eIF2)蛋白γ亚基的生物学功能打下基础.[方法]以荣昌猪胸腺mRNA为模板,采用RCAE-PCR克隆EIF2S3基因的mRNA全长序列,在线完成各种生物信息学分析后,利用实时荧光定量PCR分析猪EIF2S3基因的组织表达特征.[结果]猪EIF2S3基因mRNA全长1813 bp,其中蛋白质编码区(CDS)长1419 bp,5'UTR区、3'UTR区分别长14和380 bp,编码472个氨基酸.EIF2S3蛋白分子量51.1 kD,理论等电点(pI)8.62,包含58个带正电的氨基酸和52个带负电的氨基酸,其前体蛋白靠近N端区域有一个强疏水区;EIF2S3蛋白的空间结构由α-螺旋、β-折叠、延伸及无规则卷曲构成.EIF2S3蛋白氨基酸序列与狗和大白鼠的相似性最高(99.6%),其次是马、猫、牛、羊和人类(99.4%),与斑马鱼的相似性最低(96.6%).EIF2S3基因在猪的心脏、胸腺和淋巴组织中表达量较高,在脾脏和肌肉中呈中度表达,在肾脏中的表达量较低,而在肝脏中基本不表达.[结论]猪EIF2S3基因全长1813 bp,在核酸和氨基酸水平上与其他物种的EIF2S3基因高度同源,尤其与狗和大白鼠的遗传距离最近;其在猪心脏、胸腺和淋巴组织中的表达量较高,在肝脏中基本不表达,据此推测EIF2S3参与合成的蛋白更多地参与心脏泵血和免疫相关功能,基本不发挥能量代谢功能.     

弓形虫ROP2基因在大肠杆菌内高效表达条件的优化

采用SDS-PAGE方法检测弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白(Rhoptry protein)ROP2基因原核表达质粒在大肠杆菌BL21Codon Plus中的表达量。通过改变菌体密度、诱导剂浓度和诱导时间进行高效表达条件的优化。结果显示,在菌体密度D600nm为0·6、IPTG浓度为0·4mmol·L-1和诱导表达3.5h时,融合蛋白的表达量最大,达到159mg·L-1培养液。这为利用重组ROP2研究和制备弓形虫病的诊断抗原奠定基础。