伪狂犬病病毒gE囊膜糖蛋白主要抗原表位区基因的原核表达

参照GenBank上公布的伪狂犬病病毒gE基因序列设计1对引物,通过PCR方法扩增一段包含gE主要抗原表位编码区的564 bp的片段,扩增产物克隆于pMD18-T vector中,酶切后插入原核表达载体pET-32a的T7启动子下游,构建的原核表达质粒pET-gE在大肠杆菌BL21中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示:表达产物分子质量为38 ku,以包涵体的形式存在,表达产物用His亲和层析柱进行纯化。Western blotting分析表明:该蛋白能与标准阳性血清发生特异性反应。结果证明该表达产物具有生物学活性,可作为鉴别诊断的抗原。     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株gE基因原核表达质粒的构建

为给猪伪狂犬病病毒的诊断及防治提供科学依据,参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因序列,设计1对特异性引物,以PRV GZ-Z1株DNA为模板,进行gE基因的PCR扩增,扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经鉴定后测序。结果表明:目的片段为PRV gE基因完整开放阅读框,大小1 734bp,编码577个氨基酸,在pET32a(+)载体中位置正确,表明,pET32a-gE原核表达质粒构建成功。该基因与国内外其他18株PRV的gE基因推导氨基酸序列同源性为94.8%～98.6%;与国外分离株属同一个进化分支,遗传关系相对较近;而与国内Fa、Min、GDSH等毒株亲缘关系较远。     

广西猪伪狂犬病病毒GXA株的分离鉴定

从广西某猪场大批死亡的新生仔猪分离1株病毒，该病毒株在PK-15出现细胞病变，在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子，细胞培养物接种家兔出现伪狂犬病症状。进而用所分离病毒的DNA作为模板，应用特异性引物，通过聚合酶链式反应扩增出伪狂犬病病毒gp50基因中433-651之间217bp长的特异性片段。分离的病毒为猪伪狂犬病病毒，并将其命名为猪伪狂犬病病毒GXA株。     

猪伪狂犬病病毒HN株的分离鉴定

从河南省某猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑及内脏中分离到1株病毒并进行了鉴定。该分离毒株在PK15细胞上连传5代,出现典型细胞病变;在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子;能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;病毒接种于家兔和小鼠,均出现典型的伪狂犬病发病症状;提取所分离病毒的DNA作为模板,应用特异性引物,以PCR方法可扩增出伪狂犬病病毒gE基因的特异性片段。     

二株江西地区猪伪狂犬病病毒的分离与初步鉴定

从江西省两猪场流行病学、临诊症状及病理变化差异较大的仔猪病例中分离到两株有囊膜的正二十面体病毒（命名为ＧＮ９８０１和ＧＮ９８０２）,经鉴定均为伪狂犬病病毒。ＧＮ９８０１毒株对猪的致病性及致鸡胚成纤维细胞的病变作用均比ＧＮ９８０２毒株强。     

伪狂犬病病毒gE基因荧光定量PCR检测方法的建立

伪狂犬病病毒(PRV)野毒有gE基因,而其疫苗毒株无gE基因,这为检测有无PRV野毒感染提供参考。用PCR方法扩增PRV的gE基因片段,构建含有PRV gE基因片段的重组质粒。以系列稀释后的重组质粒作为模板,应用SYBR GreenⅠ来进行检测PRV gE基因的实时荧光定量PCR扩增。结果显示:在(6.9×107~6.9×101)copies/μL范围内,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物具有单一整齐的熔解曲线峰,标准曲线具有优良的线性关系。该方法最低可准确检测69copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2%,对PRV-gE基因缺失疫苗毒株和常见猪源DNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明,建立了1种特异性强、灵敏度高、重复性好的检测PRV gE基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可用于PRV野毒感染的定量检测。     

猪伪狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析

【目的】进一步了解猪伪狂犬病毒新流行株的遗传特征。【方法】对从安徽某猪场分离的1株猪伪狂犬病病毒(PRV)AH株进行遗传进化分析及主要糖蛋白gB、gC、gD、gE的序列分析。【结果】PRV AH株与国内2011年以来的流行毒株非常相似,但与Bartha株及其他国外毒株遗传关系较远;国内流行毒株与Bartha株及其他国外毒株相比,其主要糖蛋白均存在明显的连续氨基酸的缺失和插入,且部分突变位点位于这些糖蛋白的重要功能区。【结论】从分子水平上解析了PRV新流行株与疫苗株Bartha株的遗传差异,为进一步深入研究Bartha株疫苗免疫失败的原因提供了理论依据。     

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定

从山西某猪场发病猪的脑组织中分离到1株疑为猪伪狂犬病病毒(PRV)毒株,通过BHK-21细胞培养、病毒毒力滴定、中和试验、PCR检测病毒方法对该分离株进行了鉴定,结果发现:分离的病毒在BHK-21细胞培养盲传4代后出现典型细胞病变;用BHK-21细胞测定其毒价TCID50为10-8.042/0.1 mL;PCR体外扩增可见其扩增片段与预期目的条带相一致;据此分离病毒株的上述特征,鉴定该病毒为猪伪狂犬病病毒,并命名为SX09。     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建及表达

[目的]克隆小鼠白细胞介素-5（mIL-5）cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

小鼠p300-HAT真核表达质粒的构建

[目的]构建小鼠p300-HAT的真核表达质粒。[方法]利用PCR技术扩增p300的HAT域,然后构建p300的HAT域的真核表达质粒（p300-HAT—EGFP）,并通过PCR验证和酶切验证重组质粒的正确性;提取不舍内毒素的质粒,转染HepG2细胞,通过观测绿色荧光检测转染效率。[结果]PcR产物的电泳结果显示,成功扩增了小鼠p300基因HAT结构域,构建了小鼠p300基因HAT结构域的真核表达质粒,将其命名为m-p300-HAT-pEGFP—C1。重组质粒可以成功表达融合绿色荧光蛋白目的基因蛋白。[结论]p300-HAT—EGFP重组质粒的成功构建为后续开展巨噬细胞NF—kB信号通路的研究奠定了基础。     

猪Ghrelin基因真核表达载体构建(英文)

[目的]为研究转生长相关基因对猪的作用。[方法]采用RT-PCR方法,从13/17罗伯逊易位杂合子猪小肠组织中提取总RNA,将其纯化后作为PCR扩增模板,参考GenBank公布的猪Ghrelin的mRNA序列设计合成具有Nhe I和Hind III双酶切位点引物,扩增获得Ghrelin基因cD-NA全长序列。将准确的Ghrelin基因片段克隆于 pMD19-T simple Vector后进行序列分析,获得猪Ghrelin基因cDNA全长基因片段。经Nhe I和Hind III双酶切,将 Ghrelin基因cDNA片段连接到真核表达载体pEGFP-N1,获得真核表达载体的重组质粒pEGFP-Ghrelin。重组质粒转染猪成纤维细胞,观察标记基因荧光蛋白的表达。[结果]13/17罗伯逊易位杂合子猪的Ghrelin基因与已发表的序列相同,并成功获得具备猪Ghrelin基因全长cDNA序列的真核表达载体pEGFP-Ghrelin。[结论]构建的真核表达载体可以用于转基因猪的进一步试验,同时也为研究Ghrelin的调节机制奠定基础。     

安氏隐孢子虫肌动蛋白部分编码基因真核表达载体的构建

[目的]将安氏隐孢子虫肌动蛋白基因进行克隆并在Hela细胞中真核表达。[方法]根据筛选安氏隐孢子虫T7噬菌体展示文库获得的肌动蛋白(CA42)部分编码基因序列设计特异性引物,扩增目的基因CA42,构建重组真核表达载体pVAX1-CA42,将其转化入He-la细胞,用间接免疫荧光、SDS-PAGE、Western blotting检测CA42蛋白在转染细胞中的表达情况。[结果]重组质粒能在Hela细胞中表达,且表达产物具有反应原性。[结论]成功克隆并表达了安氏隐孢子虫肌动蛋白基因,并在Hela细胞中能够稳定表达。     

安氏隐孢子虫肌动蛋白部分编码基因真核表达载体的构建(英文)

[目的]将安氏隐孢子虫肌动蛋白基因进行克隆和在Hela细胞中真核表达。[方法]根据筛选安氏隐孢子虫T7噬菌体展示文库获得的肌动蛋白(CA42)部分编码基因序列设计特异性引物,扩增目的基因CA42,构建重组真核表达载体pVAX1-CA42,将其转化入Hela细胞,用间接免疫荧光、SDS-PAGE、Western blotting检测CA42蛋白在转染细胞中的表达情况。[结果]重组质粒能在Hela细胞中表达,且表达产物具有反应原性。[结论]成功克隆并表达了安氏隐孢子虫肌动蛋白基因,并在Hela细胞中能够稳定表达。     

牛轮状病毒结构蛋白VP4基因的真核表达

[目的]克隆获得牛轮状病毒VP4全基因,并进行真核表达。[方法]采用RT-PCR技术,从牛轮状病毒总RNA中扩增出VP4基因,将其重组到含有Flag标签的pcDNA3.1(+)载体中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,通过Lipofect2000TM转染293T细胞,细胞增殖后经RT-PCR和Western Blot检测VP4基因的表达。[结果]获得了VP4基因的阳性重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-VP4;转染293T细胞后经RT-PCR和Western Blot检测表明,该基因的重组表达载体构建正确,可在293T细胞内瞬时表达。[结论]VP4基因的重组真核表达载体构建成功并可在真核表达细胞内表达,该研究为VP4基因的DNA疫苗的研发及应用奠定了基础。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建

目的：构建HBVX基因与pCI-neo相融合的高效真核表达载体。方法：设计并合成HBVX基因的引物,以HBVDNA阳性血清PCR扩增得到HBVX基因全序列,将X基因连接到真核表达载体pCI—neo上后,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体。结果：以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBVX基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论：成功构建了HBVX基因的真核表达载体,为进一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。     

小鼠NF-κB p65亚基真核表达质粒的构建

[目的]构建小鼠NF-κB p65亚基真核表达质粒。[方法]扩增NF-κB p65亚基,然后构建其真核表达质粒(m-NF-κB-p65-p EGFPC1),并通过PCR和测序验证重组质粒中p65亚基的正确性;然后提取无内毒素的质粒,转染Hep G2细胞,通过观测重组蛋白所融合的绿色荧光蛋白,检测目的蛋白表达情况。[结果]PCR产物的电泳结果显示,成功扩增了小鼠NF-κB p65亚基,成功构建了小鼠NF-κB p65亚基的真核表达质粒,将其命名为m-NF-κB-p65-p EGFP-C1。在真核细胞中,重组质粒可以成功表达小鼠NF-κB p65亚基融合绿色荧光蛋白的目的蛋白。[结论]重组质粒NF-κB-p65-p EGFP构建成功,为后续开展NF-κB信号通路的相关研究奠定了基础。     

微小隐孢子虫miR-2980真核表达载体的构建及初步鉴定

[目的]构建微小隐孢子虫的miR-2980真核表达载体,并进行鉴定。[方法]从微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)基因组DNA扩增cp-miR-2980前体,克隆到pMD18-T载体上,经测序鉴定正确后亚克隆到pVAXⅠ载体上,转染HCT-8细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR检测cp-miR-2980的表达。[结果]成功构建了cp-miR-2980真核表达载体pVAX-miR2980,RT-PCR检测证实其能在真核细胞HCT-8中表达。[结论]构建的真核表达载体pVAX-miR2980能在HCT-8细胞中成功表达cp-miR-2980,为后续研究cp-miR-2980的功能奠定了基础。