猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 APX Ⅱ基因特异片段的克隆和表达

将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APXⅡ的一段毒素基因克隆到原核表达载体pET-28a( )的多克隆位点中,经鉴定后得到重组质粒pET-APXⅡ,并将其转化到受体菌BL21中,诱导剂IPTG进行诱导表达,4 h后达到高峰。经12%SDS-PAGE电泳检测,表达得到的融合蛋白大小约为31 kD。经Western blotting分析,表达蛋白能与APP阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应,说明该表达蛋白具有免疫原性,这为下一步用此表达蛋白作为抗原,对APP进行诊断试剂的研制和基因工程疫苗的研究提供科学依据。     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白基因的原核表达

经PCR从含有OML基因片段的重组质粒App-OML-1中扩增出mAppOML-1基因,同时对目的基因和表达载体pPRoEX HTb进行酶切、连接、转入E.coliBL21,构建重组质粒pPRoAppOML-1.阳性克隆用IPTG进行诱导,经SDS-PAGE电泳鉴定,表达的融合蛋白分子质量约为45 ku,Western-blotting分析表明表达的目的蛋白具有良好的反应原性.     

猪胸膜肺炎放线杆菌Ⅱ型分泌蛋白结构与功能的研究

猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起猪传染性胸膜肺炎,是猪的最重要呼吸道传染病之一。通过筛选APP 3～8 kb随机基因组文库,获得1株阳性克隆。测序拯救质粒得到序列,通过BLAST分析确定此片段为APP Ⅱ型分泌蛋白基因,预计成熟蛋白分子量为45.716 KD。根据序列设计特异性引物PCR扩增该基因,分子克隆表达该Ⅱ型分泌蛋白。Western blot结果表明,该蛋白与APP康复期血清发生反应;研究还发现,纯化的Ⅱ型分泌蛋白能结合C3。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定

从江西省猪场病死猪肺脏中分离到三株胸膜肺炎放线杆菌。本试验对分离菌株的理化特性进行了测定，并用分离菌株制备了灭活疫苗，有效控制了菌株分离场的猪传染性接触性胸膜肺炎。     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白型的研究

对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）12个血清的外膜蛋白型进行了测定。用N-十二烷酰肌氨酸法提取其主要外膜蛋白（OMPs）,经SDS-PAGE电泳后,用考马斯亮兰法进行染色,结果APP 12个血清型的OMP可以分为6个OMP型,表明APP的OMP具有多样性。     

猪放线杆菌性胸膜肺炎的诊治

猪放线杆菌性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌引起的一种伴有胸膜炎的出血性坏死肺炎．可发生于仟何年龄的猪只，呈世界性分布。     

猪胸膜肺炎放线杆菌基因组文库的构建

由猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）引起的猪传染性胸膜肺炎是猪最重要的呼吸道传染病之一。为研究该细菌表面蛋白的结构与功能,选取APP代表菌株,提取其基因组DNA,用TSPS091随机消化成3～8kb的片段并回收,连接到预先消化的入ZAPⅡ载体上,经过包装、扩增和滴定后,成功地构建了APP基因组文库。     

鲁西地区猪胸膜肺炎放线杆菌流行病学调查

[目的]为调查鲁西地区猪传染性胸膜肺炎病的流行状况,建立了检测胸膜肺炎线杆菌（Aetinobacillus pleuropnemunoniae,APP）的PCR方法。[方法]利用PCR方法对186头病死猪的病变组织及545头无临床症状健康猪群进行了APP的流行病学研究。[结果]186份病料中APP阳性率占43．0％（80／186）,545份猪血清APP阳性占7．9％（43／545）。[结论]该PCR方法可作为APP临床诊断的重要手段之一。     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白对小白鼠的最适免疫剂量

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型外膜蛋白为试材,分别用1、4、7、10、13、16、19、22、25μg/只的剂量对80只30日龄的小白鼠进行攻毒试验,结果其对小白鼠的最适免疫剂量为16μg/只。     

猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅣ表达蛋白单克隆抗体的制备

将APP apxⅣ N端基因克隆于pET-28a载体中.转化大肠杆菌,并进行诱导表达.收获融合表达的apxⅣ蛋白,按50μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化后,经腹腔接种BALB/C小鼠,免疫3次后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用apxⅣ表达蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA方法筛选阳性克隆,获得了3株能稳定分泌抗apxⅣ蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为4H3,1D11和4C1.亚型鉴定结果显示,3株单克隆抗体为IgG1型.经Western blot分析证实,3株杂交瘤细胞上清液能与apxⅣ表达蛋白特异反应.本研究获得的融合蛋白单克隆抗体为今后建立该菌的免疫胶体金诊断技术,分析apxⅣ蛋白的抗原表位等提供有益价值.     

鲁西地区猪胸膜肺炎放线杆菌流行病学调查

1材料与方法 1．1材料 1．1．1病料及鼻拭子。疑似传染性胸膜肺炎猪的肺病料186份以及545份无临床症状健康猪鼻拭子均来自鲁西地区的22个猪场。     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白基因（0MP-1）的克隆、表达及其ELISA方法的建立

猪传染性胸膜肺炎由猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）引起,是猪最重要的呼吸道传染病之一。通过筛选APP3～8kb随机基因组文库,获得1株阳性克隆。测序拯救质粒得到其DNA序列,通过BLAST分析确定此片段为APP外膜蛋白基因,预计成熟蛋白质的分子量为48．766kD。根据序列设计特异性引物,用PCR扩增该基因,分子克隆表达该外膜蛋白。Western blot结果表明,该蛋白与APP康复期血清发生反应。纯化该重组蛋白,并将其作为抗原包被ELISA酶标板,对已知阳性血清、阴性血清和临床送检血清样品进行ELISA检测,为最终建立APPELISA检测方法奠定了基础。     

Cloning and Expression of Actinobacillus pleuropneumoniae Gene Coding for TbpA and Development of an Indirect TbpA-ELISA

This study presents the cloning and expression of gene encoding transferrin-binding protein A from Actinobacillus pleuropneurnoniae in Escherichia coli expression system and the development of an indirect TbpA-ELISA. The gene coding TbpA was amplified from the A. pleuropneumoniae serotype 2 genome using polymerase chain reaction and cloned to pET-28b expression vector under the control of strong, inducible T7 promoter. The recombinant plasmid was expressed in E. coli BL21 （DE3）. The expressed fusion protein was analyzed using SDS-PAGE and Western blotting. The diagnostic potential of recombinant TbpA （rTbpA） was evaluated through an antibody-detection indirect ELISA based on the purified rTbpA. The TbpA antibodies were detectable in mice on day 7 after vaccination with purified rTbpA protein or infection with A. pleuropneumoniae serotype 10 with the TbpA-based ELISA. In addition, the TbpA-ELISA was able to detect 12 serotyping rabbit antisera postinoculation （PI） with A. pleuropneumoniae 12 serotypes experimentally. The comparable result was obtained by detecting the 117 clinical serum samples using, respectively, the TbpA-ELISA and indirect hemagglutination test （IHA） based on multiplex antigen. The result indicates that the TbpA-ELISA was the more sensitive method compared with the Mix-IHA method because of its consistent presence in A. pleuropneumoniae serotypes. In conclusion, the conserved TbpA of A. pleuropneumoniae can be used for the development of a cross-serotype diagnostic method for the detection of antibodies against A. pleuropneurnoniae.     

应用噬菌体随机十二肽库筛选猪传染性胸膜肺炎菌体抗原模拟表位

利用猪传染性胸膜肺炎灭活菌苗免疫日本大耳兔得到猪传染性胸膜肺炎抗血清,将血清用饱和硫酸铵粗提IgG后,经DEAE-sephadex-A50低压层析系统纯化,以此得到IgG作为配基包被酶标板,对噬菌体随机十二肽库进行3轮不同条件的富集筛选,通过改变筛选条件,噬菌体的回收率从5.76×10-5增加到了1.69×10-2,P/N值逐步提高;随机挑取10个噬菌斑进行扩增,用ELISA检测其免疫活性,结果有6个阳性克隆与纯化的IgG有较强的特异性结合能力;对筛选到的6个阳性克隆提取ssDNA进行测序,并分析其氨基酸序列,其中5个克隆所递呈的序列一致,用Blastp软件进行分析,2种类型的氨基酸序列之间无同源性,且未发现同源性50%以上的序列,提示该短肽可能模拟了猪传染性胸膜肺炎菌体的特异的抗原表位。     

Cloning, Expression of apxI Gene of Actinobacillus pleuropneumoniae and Development of ELISA

Based on the published nucleotide sequence of the apxICA of Actinobacillus pleuropneumoniaein Genbank(S4074), a pair of primers were designed. A 3 640 bp(4 687 -8 326 bp)gene fragment was ampli-fied by PCR from the isolated strain of A. pleuropneumoniae serovar 1. Then, it was cloned into pMD18-T,identified by both restriction endonuclease and sequence analysis, and inserted into pET-28a expression vectorto yield the expression plasmid. SDS-PAGE result indicated expression of apxICA in BL21 (DE3), Westernblot analysis showed the protein's immunogenicity. Using the expressed protein, ELISA was established to de-tect serum antibody against ApxI. The feature of ELISA to detect highly virulent A. pleuropneumoniae strainsinfection was proved by primary clinical application.     

胸膜肺炎放线杆菌ApxIA N端基因的克隆与原核表达

[目的]为猪接触传染性胸膜肺炎的诊断和基因工程疫苗的研制提供理论依据。[方法]以胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清10型菌株为材料,采用PCR技术对其ApxIA的N端基因进行扩增,将扩增产物转入克隆载体和表达载体中进行克隆和表达,用重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,利用免疫印迹分析鉴定ApxIAN端基因表达产物的免疫活性。[结果]ApxIA N端基因PCR扩增产物与标准10型ApxIAgene（D16582）的同源性为99.7%。NcoI和HindⅢ双酶切鉴定结果表明,目的基因已成功转入原核表达载体pET-32a中。含重组质粒的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后表达了相对分子量为779 kDa的目的蛋白,该蛋白分子量与标准ApxIA蛋白（Marker）相同。[结论]SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测结果表明,ApxIAN端基因在表达载体中得到高效表达,且表达产物具有免疫活性。     

用PCR检测猪胸膜肺炎放线杆菌

为了快速诊断猪的传染性胸膜肺炎，试验设计合成了1对引物，建立了检测猪胸膜炎肺放线杆菌的PCR方法，猪胸膜炎肺放线杆菌Ⅰ型菌血清2、5、6、9、10型均能扩增出预期片段；大肠杆菌，猪痢疾蛇形螺旋体、多杀性巴氏杆菌、鸡葡萄球菌和支气管败血性波氏杆菌的扩增结果均为阴性，用该方法检测了自猪肺脏分离的30个菌株，有11株为阳性，19株为阴性，结果证实，本方法可以用于猪胸膜肺炎的快速诊断。     

猪蓝耳病和传染性胸膜肺炎混合感染的病例报告

猪繁殖与呼吸障碍综合征是由繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种猪接触性传染病,又称"蓝耳病";而猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种接触性传染病,他们都是猪的重要呼吸道疾病,在许多养猪国家流行,且经常混合感染,给养殖业造成重大的经济损失。本试验通过对山东某猪场送检病料进行细菌的分离纯化、PCR鉴定等实验室诊断,结果发现其为蓝耳病和传染性胸膜肺炎混合感染。