黄瓜根际土壤及根系的AMF菌群多样性研究

从昆明学院种植基地随机采集黄瓜根系及根际土壤样品,采用巢式PCR技术分别扩增菌根及土壤丛枝菌根真菌(AMF)部分18S rRNA基因区域,利用该产物构建AMF克隆文库,并结合ARDRA筛选、DNA测序和系统发育树分析对黄瓜AMF菌群组成进行研究.结果表明:根际土壤检测到7种AMF:摩西球囊霉(Glomus mosseae)、根内球囊霉(G.intraradices)、地表球囊霉(G.versiforme)以及其他4种未知的Glomus属类型,而根系除发现了G.mosseae、G.intraradices和G.versiforme外,仅检测到了其他2种未知Glomus属种类.     

应用克隆文库构建法研究番茄根系AMF多样性

从昆明学院种植基地随机采取番茄根系样品,CTAB法提取DNA,运用巢式PCR扩增目的片段,获得产物连接转化入大肠杆菌JM109构建AMF 18S rRNA部分基因克隆文库,随机挑选50个克隆子,从中排除6个假阳性,经ARDRA分析产生了13个差异图谱,测序分析最终确定11个AMF序列。结果表明:文库的Coverage C值高达95.2%,且Rarefaction曲线亦趋于饱和;11个序列与免培养的Glomus属克隆序列相似度较高,代表了本属的不同AMF种类;其中seq1和seq9所代表的地表球囊霉Glomus versiforme和摩西球囊霉Glomus mosseae是侵染番茄根系的优势AMF类型;seq3、seq10和seq11均与Glomus属免培养克隆子聚集在一起;而seq2、seq4、seq5、seq6、seq7和seq8间亲缘关系较近,共同聚集在一个分支上。     

用16S rDNA克隆文库法分析患病刺参幼苗的菌群结构

采用16S rDNA克隆文库法对某刺参养殖场患病刺参Apostichopus japonicus幼苗(体长为3⁵ cm)表皮的菌群结构进行分析。结果表明:化皮参苗病灶组织和未明显化皮参苗表皮菌群均由γ-变形菌纲、β-变形菌纲和α-变形菌纲组成,优势菌为γ-变形菌纲,主要包括志贺氏菌Shigella sp.、不动杆菌Acinetobacter sp.和假单胞菌Pseudomonas sp.;化皮参苗病灶组织中志贺氏菌、不动杆菌和假单胞菌比例分别为49%、17%和5%,未明显化皮参苗表皮中3类菌的比例分别为20%、26%、9%。将该养殖场育苗池海水作为对照并进行菌群结构分析,结果显示,水中菌群同样由γ-变形菌纲、β-变形菌纲和α-变形菌纲组成,优势菌也为γ-变形菌纲,主要包含弧菌Vibrio sp.(75%)与志贺氏菌(12%)。此外,对化皮参苗病灶处进行细菌分离培养,得到一株优势菌,经16S rDNA初步鉴定为弧菌。研究表明,采用16S rDNA克隆文库法所得结果与传统的病原分离培养法存在差异。     

华南主要树木丛枝菌根真菌物种多样性调查研究

为调查华南地区丛枝菌根（arbuscular mycorrhiza,AM）真菌的物种多样性与资源分布状况,本研究对该区域红花羊蹄甲（Bauhinia blakeana）、黄梁木（Neolamarckia cadamba）、构树（Broussonetia papyrifera）、尾叶桉（Eucalyptus urophylla）和杧果（Mangifera indica）5种主要树木AM真菌侵染状况进行研究,通过形态学特征及核糖体18S rRNA基因序列分析鉴定AM真菌种类。结果表明:1）5种树木均能形成丛枝菌根,红花羊蹄甲和尾叶桉为疆南星型（Arum-type）,杧果、构树和黄梁木为重楼型（Paris-type）。红花羊蹄甲和杧果的菌根侵染率高、孢子密度大,构树、黄梁木和尾叶桉的AM真菌侵染率和孢子密度相对较低。2）鉴定出AM真菌5属8种,分别为无梗囊霉属（Acaulospora）的浅窝无梗囊霉（Acaulospora lacunosa）和刺无梗囊霉（Acaulospora spinosa）,斗管囊霉属（Funneliformis）的摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae）,根孢囊霉属（Rhizophagus）的根内根孢囊霉（Rhizophagus intraradices）,以及球囊霉属（Glomus）的3种Glomus spp.和硬囊霉属（Sclerocystis）1种Sclerocystis sp.。3）球囊霉属的AM真菌广泛分布在红花羊蹄甲、杧果和构树根际,刺无梗囊霉分布在杧果和尾叶桉根际,摩西斗管囊霉为优势种,分布在构树和黄梁木根际;而浅窝无梗囊霉和硬囊霉只分布在1种树根际,表明其宿主专一性相对较强。结果显示华南树木根际土壤中AM真菌物种多样性较高,同时本研究为深入研究该地区林木根际AM真菌功能多样性提供了初步科学依据。     

玉米叶片cDNA文库构建及Cah墓因克隆

从玉米叶片中提取总ＲＮＡ后，再利用ｏｌｉｇｏ（ｄ７）－纤维素亲合层析往，从中分离出ｍＲＮＡ，然后以ｏｌｉｇｏ（ｄ７）－ＸｂａＩａｄａｐｔｏｒ作为引物，ｍＲＮＡ作为模板，合成相应的ｃＤＮＡ．并定向克隆进λＧＥＭ－４载体，构建出滴度为２×１０５ｐｆｕ的玉米叶片ＣＤＮＡ文库、最后，利用寡核苷酸探针，从ｃＤＮＡ文库中筛选到８个阳性克隆。     

大白菜抗霜霉病同源基因的筛选与亚克隆文库的构建

根据植物抗霜霉病基因保守区设计简并引物,利用三维PCR方法对大白菜(Brassica campestris ssp.pekiensis)‘85-1'BAC文库进行筛选,从19 200个BAC克隆中筛选到含有目的基因的10个阳性克隆.利用HindⅡ对其中的94一G-17克隆进行酶切,回收1～5 kb的DNA片段并连接到载...     

马铃薯纺锤块茎类病毒山西分离物侵染性克隆的构建

马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viriod,PSTVd)侵染马铃薯会严重影响薯块的产量和品质。根据PSTVd的同源序列设计引物,以山西省马铃薯感病块茎中提取的总RNA为模板,经RT-PCR方法扩增出全长cDNA片段,将其克隆到质粒pBS-T载体上,进行序列分析。结果表明,该类病毒全长359 nt,能通过分子内序列互补形成致密的二级结构。以该序列作为种子序列进行Blast搜索,该序列与PSTVd荷兰分离物(GenBank登陆号:AY372400.1)的序列一致性为100%。将该序列与东北株系、河北株系及已公布的弱株系(GenBank登陆号:M14814.1)、强株系(GenBank登陆号:U23058.1)、中间株系(GenBank登陆号:AY937179.1)比对,有12个核苷酸具有多态性,其中有5个发生在致病区。将线性化的质粒pBS-PSTVd及其PSTVd的体外转录产物接种番茄矮红宝的无毒苗,20 d后接种株轻微显症,RT-PCR检测均呈阳性。将RT-PCR产物测序,其结果与接种的PSTVd原序列完全一致,证实构建的PSTVd山西分离物的克隆具有侵染性。     

产胞外淀粉酶极端嗜盐古菌CY的16S rRNA基因的克隆、测序及系统发育分析

从云南省一平浪盐矿采集盐矿样品,采用丰富的嗜盐培养基富集,平板划线分离,淀粉平板检测,分离到1株产胞外淀粉酶的极端嗜盐古菌,暂时命名为CY。采用通用的引物,对其16S rRNA基因进行PCR扩增、克隆和测序,并对16S rRNA基因序列进行系统进化分析,从16S rRNA基因序列的同源性比对发现CY菌株属于嗜盐古菌Halorobrum属。     

暗纹东方鲀线粒体DNA16S rRNA基因克隆、测序与在分子系统发育分析中的应用

以暗纹东方鲀（Takifugu fasciatus）肝脏线粒体DNA为模板,按照红鳍东方鲀线粒体DNA序列设计合成特异引物进行PCR扩增,获得了暗纹东方鲀线粒体DNA 16S rRNA基因（1667bp）及3′端上游的tRNALeu基因（73bp）的全序列。16S rRNA碱基组成分别为：胸腺嘧啶（T）22．1％,胞嘧啶（C）23．6％,腺瞟呤（A）35．2％,鸟嘌呤（G）19．0％。运用DNA分析软件对暗纹东方鲀与GenBank中鲀形目其他23种鱼类的mtDNA 16S rRNA序列进行核苷酸同源性比较分析,分别在鲀形目和东方鲀属水平上利用多种鱼类DNA 16S rRNA序列构建分子系统树。结果显示,同目不同科间的16S rRNA序列核苷酸相似性在73．6％～87．4％之间,同属间的核苷酸相似性高达约99．0％。在属间、科级、亚目级水平上,利用较长的16S rRNA序列构建的NJ树和MP树在拓扑图总体趋势相似,各枝的支持率较高。而在东方鲀属内中选取同源性较高的16S rRNA部分序列构建分子系统树拓扑结构虽一致,但各枝的支持率不太高。因此认为,16S rRNA基因较适合于研究鲀形目鱼类中属间、不同种间以及分化较早的种间、科级、亚目级的系统发育分析。本研究结果有助于进一步利用线粒体基因研究分析鲀形目鱼类系统进化关系。     

马铃薯块茎低温反应抑制差减文库的构建及鉴定

本研究以4℃(Tester)和20℃(Driver)处理的马铃薯野生种Solanum berthaultii的无性系CW2-1块茎为材料,构建马铃薯块茎低温反应抑制差减文库以进一步筛选差异表达基因。通过PCR鉴定后,获得了含有2 112个阳性克隆的差减杂交文库。采用反向Northern方法对差减文库进行筛选鉴定,得到274个含有显著表达差异基因（P/N>3）的阳性克隆。从274个克隆中挑选了53个克隆进行测序和同源比对分析,合并后获得29个代表不同基因的非重复序列片段,表明文库具有较高质量。并随机选取了其中4个EST进行基因表达分析,结果显示,在耐低温糖化的S. berthaultii块茎中,4℃下贮藏的块茎基因表达强度高于20℃贮藏的块茎;同在4℃贮藏条件下,S. berthaultii和易低温糖化栽培种E1的块茎中基因的表达量亦存在差异,证明所构建的差减文库富集了马铃薯块茎对低温响应的基因。     

不同陈化期烤烟叶表细菌的多样性及发育分析

为了全面了解陈化烟叶细菌多样性,以进一步挖掘其中的有益微生物,利用16S rRNA 克隆文库测序分析技术,鉴定和比较了曲靖烟区陈化时间分别为24、36、48 个月的烤烟烟叶上的细菌多样性。结果在陈化24、36、48个月的烟叶上分别鉴定得到55、60、23 个细菌的操作分类单元（OTU）,其中肠杆菌科、假单胞菌科和黄杆菌科的细菌占优势。在不同陈化阶段,菌群的多样性和优势菌有所不同,烟叶上细菌的多样性在陈化后期逐渐减低。研究结果展示了烟叶陈化期间细菌的菌群结构和动态变化,发现了一些能够减少烟叶有害物质的细菌,是烟叶上的有益细菌筛选的重要参考。     

不同陈化期烤烟叶表细菌的多样性及发育分析

为了全面了解陈化烟叶细菌多样性,以进一步挖掘其中的有益微生物,利用16S rRNA克隆文库测序分析技术,鉴定和比较了曲靖烟区陈化时间分别为24、36、48个月的烤烟烟叶上的细菌多样性.结果在陈化24、36、48个月的烟叶上分别鉴定得到55、60、23个细菌的操作分类单元(OTU),其中肠杆菌科、假单胞菌科和黄杆菌科的细菌占优势.在不同陈化阶段,菌群的多样性和优势菌有所不同,烟叶上细菌的多样性在陈化后期逐渐减低.研究结果展示了烟叶陈化期间细菌的菌群结构和动态变化,发现了一些能够减少烟叶有害物质的细菌,是烟叶上的有益细菌筛选的重要参考.     

福州左海湖细菌群落的季节性变化特征及典范对应分析

为揭示福州左海湖细菌群落的季节变化及其与环境因子的关系,通过构建16SrRNA基因克隆文库对全湖水体细菌群落进行了调查,应用典范对应分析(Canonical correspondence analysis,CCA)探讨影响细菌群落季节性变化的环境因素。结果表明:左海湖细菌群落组成中β-变形菌门β-Proteobacteria和蓝细菌门Cyanobacteria为优势类群,α-变形菌门α-Proteobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes和放线菌门Actinobacteria为亚优势类群。细菌群落结构具有明显的季节性变化特征,春、夏季Cyanobacteria为优势类群,秋、冬季β-Proteobacteria为优势类群。春季水体细菌群落结构主要受pH、叶绿素a(Chla)、透明度(SD)和总氮(TN)的影响,夏季水体受pH、Chla、SD、总磷(TP)影响较大,秋季水体受TP、Chla、TN影响较大,冬季水体则受水温(WT)、pH、SD影响较大。本研究发现,左海湖细菌群落结构的季节动态与水温及营养状况密切相关。     

块茎形成期浇灌稳态铁盐对马铃薯生理和产量的影响

为研究铁盐对马铃薯生理和产量的影响及作用机制,在块茎形成期对盆栽种植马铃薯浇灌不同浓度(10 μmol/L、100 μmol/L、1 000 μmol/L)稳态铁盐,测定叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、叶绿素相对含量、叶绿素荧光动力学参数（PSⅡ最大光化学量子产量Fv/Fm）、单株产量、单株块茎干物质重量和块茎干物质铁含量等。研究表明：施加稳态铁盐能够促进马铃薯生育后期株高生长,提高叶片SOD活性和叶绿素相对含量;铁盐施入初期叶片MDA含量显著升高,而在生育后期显著降低;在铁盐施入初期Fv/Fm显著降低,而生育后期则相反。施加中、低浓度（100 μmol/L、10 μmol/L）铁盐有利于提高单株产量,100 μmol/L铁盐可分别显著提高东农310和东农311单株产量39.6%和37.3%,10 μmol/L铁盐可显著提高东农312单株产量37.8%。100 μmol/L铁盐可提高单株块茎干物质重量12.4%~31.9%,而高浓度（1 000 μmol/L）铁盐则会降低单株块茎干物质重量。施加不同浓度的铁盐均可提高块茎干物质铁含量,中、高浓度（100 μmol/L、1 000 μmol/L）铁盐作用效果显著。     

两种抗病性不同的水稻种子固有细菌群落的多样性研究

通过构建细菌16S rRNA基因克隆文库,对相同生长环境中两个抗病性不同的北方水稻品种"越富"和"津稻305",连续两年跟踪研究了其种子的固有细菌群落结构,2008年从文库"越富"和"津稻305"中分别得到211个和174个阳性克隆,22个和25个OTUs,2009年分别得到164个和137个阳性克隆,11个和19个OTUs。检测到固有细菌分属于α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria和Actinobacteria,其中α-Proteobacteria和γ-Proteobacteria均为优势类群。并发现抗病性较强的"津稻305"种子中固有细菌的多样性比"越富"丰富,且群落结构比较稳定。     

转mapk双链RNA干扰表达载体黄瓜对根际土壤细菌多样性的影响

随着RNA干扰技术的发展,通过植物表达病原物特异的dsRNA来防治植物病害的转基因作物越来越多.转根结线虫mapk双链RNA表达载体的黄瓜能够通过RNA干扰作用沉默线虫的mapk基因,对根结线虫具有良好的防治效果.为了评价该转基因黄瓜的安全性,明确mapk双链RNA干扰表达载体转基因黄瓜植株对根际土壤细菌多样性的影响,采用16S rRNA基因克隆文库方法对非转基因黄瓜和转基因黄瓜土壤细菌群落多样性进行分析.结果表明,非转基因黄瓜土壤细菌文库包含124个OTU(可操作分类单元),转基因黄瓜土壤细菌文库包含122个OTU.2个文库共同拥有的OTU为115个.2个文库都包含1 3个类群细菌,Acidobacteria、Actinobacteria、Armatimonadetes、Bacteroidetes、candidate division BRC1、Chloroflexi、Firmicutes、Gemmatimonadetes、Nitrospira、Planctomycetes、Proteobacteria、Verrucomicrobia、unclassified_Bacteria. 其中 Proteobacteria、Bacteroidetes 、Chloroflexi和Acidobacteria是优势菌群.其他细菌类群数量相对较少.在纲分类水平上,两个文库包含的细菌类群一致,且各类群细菌比例差异不大.在Acidobacteria门中,Acidobacteria_Gp6为优势菌群.在Bacteroidetes门中,Sphingobacteria纲细菌数量最多.在Chloroflexi门中,unclassified Chloroflexi细菌最多.在Proteobacteria门中,其中Betaproteobacteria纲的细菌数量最多.从多样性指数角度分析,两种土壤细菌群落的Shannon、Simpson和Chao值差异不大.总体来看,两种土壤细菌类群差异不显著,转基因黄瓜未对根际土壤细菌群落产生明显影响.     

热带雨林土壤真菌18S rRNA基因多样性分析

[目的]探讨热带雨林土壤真菌群落结构,阐释微生物与植物之间的互作关系,以期为开发利用热带雨林这一特殊生态环境中丰富的微生物基因资源提供理论依据。[方法]运用扩增18S rDNA限制性分析(Amplified 18S ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA)和18S rRNA基因序列分析技术,分析了热带雨林土壤真菌物种丰度、优势种群和进化关系等群落结构特征。试验采用PVPP洗涤-CTAB-溶菌酶-蛋白酶K-SDS热处理等方法,提纯微生物总DNA,构建真菌18S rRNA基因克隆文库,对阳性克隆进行ARDRA分析,选取有代表性的克隆测序,利用DOTUR软件将真菌序列按照97%相似性的标准分成若干个可操作分类单元(Operational taxonomic u-nit,OTU)。[结果]构建的克隆文库包含21个OTU,其中以子囊菌和担子菌为主,各占克隆文库的64.7%和15.5%。子囊菌中以盘菌为主,占到整个克隆文库的47.4%;担子菌中以伞菌为主,占到整个克隆文库的10.4%。接合菌和壶菌均有少量克隆出现在文库中。首次从海南岛热带雨林土壤中发现牛肝菌。研究显示该环境真菌多样性极其丰富,涵盖了真菌主要门的绝大多数。[结论]该研究结果为揭示热带雨林土壤真菌群落结构多样性、挖掘该环境样品的真菌基因资源提供了参考依据。