体外转录法制备小反刍兽疫病毒荧光定量RT—PCR检测标准阳性模板

针对小反刍兽疫病毒的F基因设计了一对荧光定量RT—PCR的引物和探针,在正向引物的5’端加上T7启动子后与反向引物扩增小反刍兽疫病毒株Nigeria75／1细胞培养液RNA．切胶回收目的条带作为体外转录模板．体外转录后测RNA浓度以及OD值。线性试验和特异性试验结果表明,该模板具有良好的线性范围和特异性。当稀释度为4．9×10^8-4．9×10^3拷贝／μL时,相关系数为0．999。该模板稳定性好。-80℃保存一个月后无显著变化。对起始浓度为4．9×10^6、4．9×10^5、4．9×10^4拷贝／μl的标准品分别检测10次,变异系数分别为1．09％,1．47％,1．34％,表明以此模板进行荧光定量PCR具有较好的重复性。     

体外转录法制备新城疫病毒荧光定量RT-PCR标准阳性模板

本研究针对新城疫病毒M基因设计了1对荧光定量RT-PCR引物和Taqman探针,在上游引物的5′端引入T7启动子,采用RT-PCR方法获得了体外转录模板,并对转录产物RNA的浓度及D值进行了测定。线性试验和特异性试验结果表明,该模板具有良好的线性范围和特异性,模板稀释度为2.95×104～2.95×108拷贝/L时,相关系数为0.998。该模板稳定性好,-80℃保存30 d后无显著变化。浓度为2.95×104～2.95×108拷贝/μL的标准品的变异系数分别为0.20%、0.28%、1.00%、0.54%、0.52%,表明以此模板进行荧光定量PCR具有较好的重复性。     

一步法实时定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立

建立了检测小反刍兽疫病毒的快速、特异的基于Taqman的一步法实时定量RT-PCR方法。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析,设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反刍兽疫病毒RNA样本进行检测,都获得了特异性扩增,但是,不与牛瘟病毒、海豚麻疹病毒等其他种的麻疹病毒属病毒发生交叉反应。本方法具有高度灵敏性,最低可检测到810拷贝的RNA模板。在模板浓度为8.1×102到8.1×108拷贝范围内,都呈现良好的线性关系,而且无论是组内和或组间重复的变异系数都很低。     

小反刍兽疫实时荧光PCR检测方法的建立及应用

以小反刍兽疫病毒N基因序列为靶基因,通过设计引物及TaqMan探针建立快速检测小反刍兽疫的荧光PCR方法.在线BLAST分析结果表明:所设计的引物特异性强,可区分小反刍兽疫病毒及牛瘟病毒感染;所建立的方法检测线性范围为1～1×106拷贝质粒DNA,灵敏度可达10拷贝质粒DNA,是常规PCR法的100倍.应用所建立的方法对32份采自西藏疫区的组织样品进行检测,说明疫情在西藏没有扩散.     

小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒多重荧光RT-LAMP鉴别检测方法的建立及应用

旨在建立一种可视化多重荧光RT-LAMP方法用于检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的核酸,并初步应用于小反刍兽疫和蓝舌病临床样品的检测。比对GenBank中小反刍兽疫N基因和蓝舌病NS3基因保守区域,设计2套LAMP引物,在每条内引物FIP的5′端标记荧光基团。对反应条件进行优化,验证方法的特异性、灵敏度和干扰性,同时应用该方法检测168份临床样品。结果表明,该方法对小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒高度特异,与口蹄疫病毒、鹿流行性出血热病毒、牛瘟病毒、山羊痘病毒等其他反刍动物病毒均无交叉反应,检测灵敏度为200 copies/μL,干扰性小,可同时检测两个不同浓度的模板。对168份样品的检测结果显示,小反刍兽疫病毒的感染率为3.6%,蓝舌病病毒的感染率为13.1%,无两种病毒混合感染;与荧光RT-PCR方法相比,此多重荧光RT-LAMP方法敏感性为91.7%～100%,特异性为100%。表明建立的多重荧光RT-LAMP可快速、准确地检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒,具有较好的临床应用价值。     

HoBi瘟病毒一步法荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测HoBi瘟病毒的方法,根据GenBank提交的HoBi基因序列,使用软件设计2对引物和1条探针,通过体外转录获得定量标准品RNA。通过对荧光定量PCR将各反应条件进行优化,建立了HoBi瘟病毒一步法荧光定量PCR检测方法。该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,对牛病毒性腹泻病毒-1(BVDV1)-NADL、BVDV2-JN、猪瘟病毒(CSFV)、羊边界病毒(BDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、牛轮状病毒(RV)和伪狂犬病病毒(PRV)核酸检测为阴性;最低核酸检测量为103拷贝/μL;组内变异系数和组间变异系数均小于2%。结果表明,所建立的HoBi瘟病毒一步荧光定量PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好和快速等特点,可用于HoBi瘟病毒感染的流行病学调查和早期诊断。     

RT-PCR鉴别小反刍兽疫病毒疫苗株与强毒株方法的建立

根据GenBank中公布的小反刍兽疫病毒的H基因或全基因序列,利用软件Primer Premier5.0设计引物,扩增片段长度为477bp,建立区分小反刍兽疫疫苗毒与基因4系野毒的RT-PCR检测方法,并用于临床检测。结果表明,建立的RT-PCR鉴别诊断方法能特异性区分疫苗株Nigeria75/1与基因4系PPRV,与基因3系、牛瘟病毒、犬瘟热病毒等同属病毒无交叉反应;最低可以检测到浓度为7.7×10-5ng/μL的RNA模板;该方法操作简单,耗时短,可以初步用于临床鉴别诊断。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）北美型毒株和欧洲型毒株N蛋白基因保守序列,设计1对特异性引物和1条探针,以ABI公司PRRSV RNA为标准品,优化了PRRSV实时荧光定量RT-PCR检测方法,25μL反应体系引物prrsv-f/prrsv-r（20μmol/L）各0.5μL,探针prrsv-p（10μmol/L）0.5μL为反应最佳工作浓度,标准曲线Ct值和模板启始浓度的log值之间具有良好的线性相关性。特异性、敏感性和重复性检测结果显示,该方法能特异的检测PRRSV北美型毒株和欧洲型毒株,与其他主要猪病病原检测无交叉反应;针对PRRSV RNA标准品检测,灵敏度可以达到10拷贝;重复性检测Ct值变异系数为0.74%～1.52%。用建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法,对40份临床样品检测,与商品化试剂盒检测结果完全一致。     

小反刍兽疫实验室诊断

为了对小反刍兽疫疑似病例进行实验室确诊,采集疑似小反刍兽疫病羊材料,用实时荧光定量RT-PCR检测方法以及一步法RT-PCR检测方法进行检测,并针对小反刍兽疫N基因序列设计引物扩增N基因并进行克隆测序及序列分析。试验结果可见,疑似小反刍兽疫病羊临床剖检表现为胃肠道及肺部出现坏死,肠道出现线状出血。实时荧光定量RT-PCR和一步法RT-PCR方法检测结果显示均为小反刍兽疫病毒(PPRV)核酸阳性。N基因测序结果 China-GZ株与小反刍兽疫4个支系毒株序列比对显示,核苷酸同源性为89.0%~97.3%。本试验通过临床症状表现和实验室分子生物学诊断确诊该病例为小反刍兽疫病毒感染所致。     

小反刍兽疫灭活抗原RT—PCR检测方法的建立及其相关序列分析

以灭活的检测用抗原为材料,抽提灭活小反刍兽疫病毒的基因组RNA作为模板,根据参考文献及GenBank下载的序列,设计3对位于F基因的引物（2对为套式引物）,进行RT-PCR扩增及扩增片段的T载体克隆、序列分析。结果显示,所设计引物单独或套式RT—PCR对模板均有预期大小的片段扩增;扩增片段经核苷酸序列测定和分析,表明所扩增片段为小反刍兽疫病毒的F基因片段。且所设计引物对同属牛瘟病毒、犬瘟热病毒无扩增,证明所用引物为小反刍兽疫病毒特异性引物,此3对引物可用于小反刍兽疫与牛瘟等同属病毒的鉴别诊断。     

蜜蜂遗传多样性研究的RAPD-PCR反应体系的正交优化

利用正交设计L16（45）对蜜蜂基因组DNARAPD-PCR反应体系的5个因素（Tag酶,引物,Mg2＋,dNTP,模板）在4个水平上进行优化试验,筛选出各个反应因素的最佳水平,建立蜜蜂模板DNARAPD-PCR反应的最佳体系（25L）：10×PCRbuffer3.0L,Tag酶0.5U,引物浓度0.4mol/L,Mg2＋浓度3.0mmol/L,dNTP浓度0.5mmol/L,模板40ng。对蜜蜂DNARAPD-PCR最佳反应体系的退火温度进行了梯度试验,最佳退火温度为54℃。     

白羊草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验与单因素、双因素设计结合的方法,对白羊草ISSR-PCR反应体系的Mg2+、dNTP、模板DNA、Taq DNA聚合酶及引物5种主要因素进行优化。确立了白羊草最佳反应体系及扩增程序:25μL体系中dNTP 0.2mmol/L、Taq酶1.0U、引物0.6μmol/L、Mg2+2.5mmol/L、DNA模板30ng、10×PCR Buffer 2.5μL;扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性45s,50～60℃(退火温度随引物不同而定)退火60s,72℃延伸90s,共35个循环,72℃后延伸5min。     

体外转录法制备西尼罗河热病毒RNA片段

目的通过体外转录获得西尼罗河热病毒保守区基因的RNA片段,为核酸快速检测方法的建立和改进提供阳性定量标准品。方法设计西尼罗河热病毒基因保守区克隆引物,PCR从合成的基因DNA获得相应片段,连接至质粒PGEM-T-easy上并筛选阳性重组质粒,测序鉴定后酶切线性化,用T7RNA聚合酶进行体外转录,得到固定长度的RNA片段,DNase酶处理后测定浓度,梯度稀释后用RT-PCR验证。结果获得含西尼罗河热病毒靶基因序列的准确定量拷贝数的RNA片段,质量浓度分别为352.6ng/μL,RT-PCR验证均扩增出相应目的条带。结论获得的RNA片段可作为西尼罗河热病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。     

灰色家鸽ISSR反应体系的建立与优化

本研究旨在通过正交优化得出灰色家鸽的ISSR-PCR反应的最佳体系。以灰色家鸽为试验材料,使用引物ISSR807,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg²⁺、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板进行了体系优化,同时对引物的最佳退火温度进行了选择,建立了适合灰色家鸽的ISSR-PCR分析的最佳体系。结果表明,灰色家鸽ISSR-PCR反应的最优体系为:25 μL总体积中包括10×PCR Buffer 2.5 μL, Mg²⁺ 2.6 mmol/L, dNTPs 0.2 mmol/L, 引物0.4 μmol/L,Taq DNA聚合酶0.5 U,DNA 模板1.2 ng/μL,最佳退火温度为56.2 ℃。通过对ISSR-PCR反应体系的优化,能为利用该技术进行灰色家鸽遗传多样性评价、不同种源鉴定及亲缘关系分析奠定基础。     

珍稀濒危植物裸果木RAPD反应体系优化研究

以裸果木新鲜叶片为材料,采用改进CTAB法提取基因组DNA,在参考一般RAPD分析反应程序的基础上,研究了裸果木RAPD分析过程中的影响因素Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、模板DNA浓度、变性时间等,建立了适于裸果木RAPD反应的PCR体系:模板DNA为4ng/μL,引物浓度为0.3μmol/L,dNTP浓度为0.5mmol/L,Mg2+浓度为2.0mmol/L,Taq酶用量为1U,ddH2O补足25μL;94℃预变性5min,94℃变性45s,36℃退火40s,72℃延伸1min,共30个循环,最后72℃延伸10min,扩增结果稳定。     

猪细小病毒SYBR Green Ⅰ模式实时定量PCR检测方法的建立

根据GenBank猪细小病毒(PPV)的NS1基因序列,设计一对特异性引物,采用SYBR Green Ⅰ随机结合渗入法,建立实时定量PCR检测方法,构建了检测PPV的标准DNA模版,循环阈值(Ct)与标准质粒DNA模板在7.8×101～7.8×108拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.997。该方法用于猪细小病毒的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍,可以用于猪细小病毒的快速检测。     

绵羊BMP15基因B2突变可视化检测技术的建立

骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15,BMP15）基因突变对绵羊排卵率、产仔数以及繁殖力有很大影响,本研究旨在建立快速可视化检测BMP15基因B2突变的技术。将改良的扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS）与核酸染料SYBR Green Ⅰ结合,针对BMP15基因B2突变设计ARMS特异性引物,使引物下游3'端的最后一个碱基为A,并在下游引物3'端的第3位碱基处设计额外的错配,以提高引物的特异性;经ARMS PCR扩增后,向产物中加入SYBR Green Ⅰ,通过肉眼观察PCR管内的颜色变化来检测BMP15基因的B2突变。经测序发现所采集的样本均为野生型,因此,利用重叠延伸PCR构建BMP15基因B2突变型模板,测序结果显示BMP15基因B2突变型模板构建成功。ARMS PCR结果显示,ARMS特异性引物能够只扩增突变型模板,而不会扩增野生型模板,且扩增效果良好。ARMS PCR扩增后加入SYBR Green Ⅰ发现已知野生型模板与阴性对照一致,呈SYBR Green Ⅰ原始颜色橙黄色,而已知突变型模板呈亮绿色,且色差明显,肉眼可辨。用建立的可视化检测BMP15基因B2突变的技术检测50个小尾寒羊基因组DNA （随机向其中20个样本中加入构建的BMP15基因B2突变型模板）,将可视化检测的突变型样本编号与混合样本时记录的编号对比,结果表明该技术能够准确检测绵羊BMP15基因的B2突变,且准确率高达100%。将构建的BMP15基因B2突变型的模板进行梯度稀释,对本试验可视化检测体系的灵敏度进行检测,发现ARMS可视化检测技术的灵敏度达到0.006 ng/μL。因此,本研究建立的技术能够可视化地检测绵羊BMP15基因B2突变,且准确率高,有望为高繁殖力绵羊的选育提供技术支持。     

血清3型鸭甲型肝炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用

通过对GenBank公布的鸭甲型肝炎病毒全序列比对,在3型鸭甲肝炎病毒（DHVA-3）5’非编码区的保守区,设计了一对检测引物和一条特异性TaqMan探针,以构建的阳性重组质粒经体外转录合成的RNA作为标准品绘制标准曲线,建立了一种快速检测DHAV-3的实时荧光定量RT—PCR方法。该方法能特异性地检测出DHAV-3,而与血清1型鸭肝炎病毒（DHAV-1）、鸭瘟病毒、新城疫病毒、禽流感病毒（H9）、呼肠孤病毒、传染性支气管炎病毒无交叉反应。在1．8×10^3～1．8×10^8copies／μL的检测范围内标准曲线线性关系较好,R2为0．992。敏感性试验表明,最低检测限为36拷贝数RNA。用该方法和胚半数致死量法对尿囊液中病毒含量进行检测,表明二种方法检测结果呈正相关。本研究所建立的检测方法特异性好,灵敏度高,且操作方便,可为该病毒的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。