山羊神经肽Y基因外显子克隆及序列分析

采用PCR-SSCP 技术检测神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)基因全部3个外显子在高繁殖力山羊品种(济宁青山羊)、中等繁殖力山羊品种(波尔山羊)和低繁殖力山羊品种(内蒙古绒山羊和安哥拉山羊)中的单核苷酸多态性,分析该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响;并对济宁青山羊NPY基因3个外显子进行克隆测序,推导出编码的氨基酸序列,同时将济宁青山羊核苷酸和氨基酸序列与绵羊、牛、人、大鼠、小鼠和鸡6个物种的序列进行比较.结果表明,在4个山羊品种中未检测到NPY基因3个外显子的多态性;这7个物种的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为71.6%～99.7%和81.4%～100%;与牛、人等6物种相比,济宁青山羊NPY基因氨基酸序列38位存在特有突变(E38D).可见,物种间NPY基因保守性强,NPY基因可能不是影响山羊高繁殖力的主效基因.     

山羊UBA52基因多态性及其与繁殖性能的关系

根据牛UBA52基因序列,设计3对引物(U1～U3),分别扩增随机选取的济宁青山羊和辽宁绒山羊样本,PCR产物克隆测序,序列比对结果显示仅在U3的扩增产物中发现G63A和T181C突变。设计引物U4,利用PCR-RFLP技术分别在性早熟、高繁殖力品种(济宁青山羊、南江黄羊、马头山羊)和性晚熟、低繁殖力品种(辽宁绒山羊、内蒙古绒山羊、太行山羊)中检测上述位点的多态性,并分析2个突变位点对山羊性早熟和高繁殖力的影响。对于G63A位点,在济宁青山羊和南江黄羊中检测到GG、GA和AA3种基因型,在马头山羊、辽宁绒山羊、内蒙古绒山羊、太行山羊中只检测到GG和GA基因型;该突变位点不同基因型分布在性早熟品种和性晚熟品种间存在一定的差异;济宁青山羊GG、GA和AA基因型频率分别为0.53、0.44和0.03,AA型和GA型母羊平均产羔数分别比GG型多0.85只(P0.05)和0.49只(P0.05),AA型与GA型之间差异不显著(P0.05)。对于T181C位点,在南江黄羊和内蒙古绒山羊中检测到CC、CT和TT 3种基因型,在济宁青山羊、马头山羊、辽宁绒山羊、太行山羊中只检测到CC和CT两种基因型;该突变位点不同基因型分布在性早熟品种和性晚熟品种间没有明显差异;济宁青山羊CC和CT基因型频率分别为0.91和0.09,两种基因型个体间产羔数差异不显著(P0.05)。本研究结果初步表明,UBA52基因63位点与山羊的性早熟可能存在一定关联,A等位基因可能是提高山羊产羔数的一个潜在有效的DNA标记。     

山羊生长分化因子9基因外显子2 的PCR-SSCP分析

【目的】寻找与产羔数相关的遗传标记，为山羊高繁殖力的标记辅助选择提供科学依据。【方法】以控制Belclare绵羊和Cambridge绵羊高繁殖力的生长分化因子9（growth differentiation factor 9, GDF9）基因为候选基因，根据绵羊GDF9基因序列设计4对引物，采用PCR-SSCP技术检测GDF9基因外显子2在高繁殖力山羊品种(济宁青山羊)以及低繁殖力山羊品种(波尔山羊、文登奶山羊、辽宁绒山羊、北京本地山羊)中的单核苷酸多态性，同时研究该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响。【结果】山羊与绵羊的GDF9基因外显子2核苷酸序列同源性为99%(955/965)。引物1和引物4存在多态性。对于引物1扩增片段，5个山羊品种均检测到AA、AB和BB 3种基因型，测序分析发现外显子2第26 bp处有1个G→A的单碱基突变，但没有引起氨基酸改变；济宁青山羊A等位基因频率为0.9128，B等位基因频率为0.0872；AA基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比AB基因型的多0.54只(P<0.01)，比BB基因型的多0.63只(P<0.01)。对于引物4扩增片段，5个山羊品种均检测到CC、CD和DD 3种基因型，测序分析发现外显子2第792 bp处有1个G→A的单碱基突变并且导致缬氨酸改变为异亮氨酸；济宁青山羊C等位基因频率为0.9266，D等位基因频率为0.0734；CC基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比CD基因型的多0.57只(P<0.01)，比DD基因型的多0.62只(P<0.01)。【结论】初步表明GDF9基因可能是控制济宁青山羊多胎性能的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的分子标记。     

济宁青山羊MTNR1A基因外显子2的克隆与序列分析

对常年发情的山羊品种济宁青山羊和季节性发情的山羊品种辽宁绒山羊共20只母羊的褪黑激素受体1A(melatonin receptor 1A,MTNR1A)基因外显子2的824 bp扩增产物进行了克隆测序及序列比较分析.结果表明,济宁青山羊MTNR1A基因外显子2的核苷酸序列与已发表的山羊序列(GenBank登录号AF419334)完全相同.济宁青山羊与辽宁绒山羊MTNR1A基因外显子2的差异由11个核苷酸变化(A52G、T232C、T253C、A256G、T358G、T410A、A414T、C424T、A554G、T559C和C589A)组成,核苷酸同源性为98.7%.济宁青山羊与绵羊、母牛、猪、人、小鼠、挪威大鼠、西伯利亚仓鼠、鸡之间MTNR1A基因外显子2的核苷酸序列同源性为73.5%～98.4%,氨基酸序列同源性为79.2%～98.5%.     

山羊高繁殖力候选基因BMP15的RFLP分析

以控制R om ney Inverdale绵羊和R om ney H anna绵羊高繁殖力的骨形态发生蛋白15(BM P 15)基因为候选基因,采用PCR-RFLP方法检测BM P 15基因在高繁殖力山羊品种(济宁青山羊)以及低繁殖力山羊品种(内蒙古绒山羊、安哥拉山羊、波尔山羊)中的多态性,同时研究该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响。结果表明:BM P 15基因在济宁青山羊、内蒙古绒山羊、安哥拉山羊和波尔山羊中既未发生与Inverdale绵羊相同的V 31D突变,也未发生与H anna绵羊相同的Q 23T er突变。这表明BM P 15基因这2个突变位点对济宁青山羊的高繁殖力没有显著影响。     

6个山羊品种高繁殖力候选基因BMP15多态性研究

骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)基因为控制Belclare和Cambridge绵羊高繁殖力的主效基因.采用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术检测BMP15基因中与绵羊高繁殖力相关的两个突变位点在高繁殖力山羊品种济宁青山羊(130只母羊、20只公羊)以及低繁殖力山羊品种(波尔山羊30只母羊、文登奶山羊30只母羊、辽宁绒山羊30只母羊、内蒙古绒山羊50只母羊、北京本地山羊30只母羊)中的单核苷酸多态性,同时研究这两个突变位点对济宁青山羊高繁殖力的影响.结果表明,在6个山羊品种中都没有检测到BMP15的B2突变(C→T);检测到的BMP15的B4突变(G→T)在6个山羊品种中均呈现杂合子状态.这表明BMP15基因中影响Belclare和Cambridge绵羊高繁殖力的突变位点对济宁青山羊的高繁殖力没有显著影响.     

RIP140基因多态性及其与济宁青山羊产羔数关系的研究

根据牛RIP140基因mRNA序列,设计5对引物(P1～P5),利用每对引物分别扩增随机选取的济宁青山羊和辽宁绒山羊各5个个体,PCR产物克隆测序,获得山羊RIP140基因全部CDS序列。通过序列比对在此序列822位发现C→T的沉默突变。根据获得的山羊RIP140基因的CDS序列设计引物P6,采用PCR-RFLP技术检测C822T多态位点在高繁殖力品种(济宁青山羊、贵州白山羊)和低繁殖力品种(辽宁绒山羊、波尔山羊、内蒙古绒山羊)中的单核苷酸多态性,并研究该基因对山羊产羔数的影响。结果发现,引物P6扩增片段在济宁青山羊、贵州白山羊、辽宁绒山羊和波尔山羊中均检测到CC、CT和TT 3种基因型,内蒙古绒山羊中只检测到CT和TT两种基因型。济宁青山羊CC、CT和TT基因型频率分别为0.056、0.309和0.635,CC型和CT型母羊平均产羔数分别比TT型多0.81只(P0.05)和0.65只(P0.05),CC型比CT型多0.16只(P0.05)。研究结果初步表明,RIP140基因的C等位基因是提高山羊产羔数的一个潜在有效的DNA标记。     

孕酮受体基因多态性及其与济宁青山羊产羔数关系

 【目的】寻找与产羔数相关的遗传标记,为山羊高繁殖力的标记辅助选择提供科学依据。【方法】设计15对引物,采用PCR-SSCP技术检测孕酮受体（progesterone receptor,PGR）基因全部9个外显子在济宁青山羊、波尔山羊、辽宁绒山羊和安哥拉山羊中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对山羊繁殖力的影响。【结果】只有引物P1、P8与P9扩增片段具有多态性。对于P1扩增片段,济宁青山羊中检测到AA、AB和BB型,其余山羊中均检测到AA和AB型;测序表明BB与AA型相比有一处突变（31G→A）,并导致丙氨酸变为苏氨酸;BB基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比AB基因型多0.52只（P＜0.05）,比AA基因型多0.98只（P＜0.001）,AB基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比AA基因型多0.46只（P＜0.05）。对于P8扩增片段,济宁青山羊中只检测到CC型,波尔山羊中检测到CC和CD型,其余山羊中检测到CC、CD和DD型;测序表明DD型和CC型相比有一处突变（2810C→G）,未导致氨基酸改变。对于P9扩增片段,济宁青山羊和波尔山羊中检测到FF和FG型,其余山羊中检测到FF、FG和GG型;测序表明GG型和FF型相比有一处碱基突变（60128T→A）,未导致氨基酸改变;FF基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比FG基因型多0.32只（P＞0.05）。【结论】本试验结果初步表明,PGR基因可能是控制济宁青山羊多羔性的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的一个标记。     

山羊促甲状腺素β亚基基因(TSHB) cDNA克隆 与组织表达研究

促甲状腺素β亚基基因(TSHB)主要表达于动物垂体腺,其表达受到光照周期调控并且与动物季节性繁殖活动密切相关.本实验以济宁青山羊和辽宁绒山羊为研究对象,运用RT-PCR方法克隆获得山羊TSHB基因部分cDNA序列(GenBank No.:JQ937288),并使用RT-PCR与荧光定量PCR技术检测TSHB基因在济宁青山羊与辽宁绒山羊下丘脑-垂体-卵巢繁殖轴及其他组织的表达分布情况.结果表明,山羊TSHB基因编码区417bp,编码含有138个氨基酸的蛋白质;各哺乳动物间TSHB基因高度保守,山羊与绵羊、牛TSHB基因同源性最高,达99％;另外,两品种山羊TSHB基因均在垂体中高表达,在济宁青山羊下丘脑、卵巢及海马等组织低度表达,而在辽宁绒山羊下丘脑低度表达,两品种其他组织均没有表达.非繁殖季节济宁青山羊垂体TSHB基因表达水平是辽宁绒山羊的1.6倍(P=0.061),其对季节性繁殖的调控功能值得进一步研究.本研究首次对山羊TSHB基因cDNA序列进行了克隆和表达分析,研究结果对山羊繁殖调控具有重要意义.     

渤海黑牛H-FABP基因外显子2的序列测定与分析

[目的]为改良渤海黑牛地方品种及种质资源的保护提供技术依据。[方法]根据GenBank发表的牦牛心脏脂肪酸结合蛋白基因（H-FABP）的序列设计1对引物,利用PCR技术扩增出渤海黑牛H-FABP基因外显子2的DNA片段,测定其核苷酸序列并进行氨基酸序列的推导,同时将序列与牦牛、山羊、猪、人、小鼠和鸡的外显子2序列进行比较,并且进行系统发生树的构建。[结果]渤海黑牛的H-FABP外显子2核苷酸序列和氨基酸序列与牦牛、山羊、猪、人、小鼠和鸡各物种间同源性分别为100%、97.1%、94.2%、89.0%、83.8%、79.8%,100%、98.2%、94.7%、86.0%、86.0%、77.2%。系统发生结果显示,系统发生树总体分为两支,鸡单独为一支;渤海黑牛、牦牛、山羊、猪、人、小鼠聚在一起成为另一支。[结论]渤海黑牛H-FABP外显子2具有很强的保守性,H-FABP基因外显子2进化树符合物种进化规律。     

藏绵羊生长激素(GH)基因的克隆及序列分析

【目的】对藏绵羊生长激素(GH)基因进行了克隆和序列分析,以期为进一步开展藏绵羊GH基因与其生长发育性状的相关分析以及基因定位、表达调控等研究提供理论基础。【方法】用特定引物对藏绵羊GH基因进行PCR扩增、克隆和测序,使用DNAMAN4.0、BioEdit 7.0.0、DnaSP 4.10.1等生物信息学软件进行序列分析和比较基因组学研究。【结果】藏绵羊GH基因(GenBank登录号EF077162)由5个外显子和4个内含子组成,完整编码序列(Complete coding sequence,CDS)全长为654 bp。5个外显子大小分别为13,161,117,162和201 bp;4个内含子大小分别为246,227,229和275 bp;内含子与外显子的连接区序列遵循基因组成规则。信号肽由26个氨基酸组成,成熟肽由191个氨基酸组成。藏绵羊与已报道的其他绵羊GH基因编码区核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性均为99.0%~100%;而与山羊、普通牛、瘤牛、大额牛、牦牛、水牛各物种在GH基因编码区核苷酸序列上同源性分别为98.4%,98.0%,97.7%,97.5%,97.5%,98.1%;相应的氨基酸序列间同源性分别为100%,99.0%,99.0%,98.1%,98.6%,98.1%。【结论】成功地克隆了藏绵羊GH基因;牛科物种内,藏绵羊与已报道的其他绵羊以及与山羊、普通牛、瘤牛、大额牛、牦牛、水牛等物种在GH基因编码区核苷酸序列和推导的氨基酸序列上均具有较高的保守性。     

山羊抑制素α前体基因5'侧翼区及外显子的克隆与序列分析

[目的]弄清INHα前体基因与山羊繁殖季节性的关系,并研究INHα前体基因进化的保守性。[方法]对常年发情的山羊品种海门山羊和季节性发情的山羊品种安徽白山羊共20只母羊的抑制素0【前体基因（INHα）5’侧翼区和外显子进行了克隆和序列比较分析。[结果]与安徽白山羊相比,海门山羊INHα前体基因存在3个SNP,不存在氨基酸改变,核苷酸同源性为99．7％,氨基酸同源性为100％。在山羊、牛、猪、人、鸡、马、大鼠、狗之间INHα前体基因的核苷酸序列同源性为12．7％-96．5％。[结论]INHα前体基因在物种内趋于高度保守,任何核苷酸和氨基酸的改变都可能直接影响整个基因编码和基因调控能力的改变。     

济宁青山羊PRLR基因的多态性及其与主要经济性状的关联分析

采用PCR-RFLP技术检测济宁青山羊PRLR基因部分序列的单核苷酸多态性,并分析其对济宁青山羊产羔数、出生重的影响,有利于进行分子标记辅助选择从而培育具有高繁殖力的济宁青山羊。结果表明,此次引物所扩增的片段具有多态性,有AA、AB 2种基因型;经χ~2检验,该群体符合哈德-温伯格平衡。该基因位点对济宁青山羊产羔数没有显著效应(P0.05),但是AB基因型产羔数比AA基因型多0.16只;该基因位点对济宁青山羊出生重没有显著效应(P0.05),但是AB基因型出生重比AA型高0.38 kg。说明此次试验检测的PRLR基因的突变位点对济宁青山羊产羔数、出生重等性状的影响不显著。     

欧拉型藏羊生长激素基因部分片段的Sma Ⅰ-RFLP 分析及序列比较研究

对35只欧拉型藏羊生长激素(GH)基因部分片段进行Sma Ⅰ-RFLP分析,并对该基因片段进行PCR产物直接测序(GenBank accession NO.:EF030552).在此基础上,利用BioEdit 7.0.0、DnaSP 4.10.1和Mega 3.1等生物软件,将该序列与GenBank中山羊、普通牛、牦牛、水牛、赤鹿和长颈鹿6个物种相应基因序列进行比对分析,结果表明:该片段Sma Ⅰ-RFLP均为单态,表现为AA型;其核苷酸序列与山羊、普通牛、牦牛、水牛、赤鹿、长颈鹿的序列间同源性分别为97.3%、94.8%、94.6%、95.3%、91.2%和91.2%;根据外显子5和部分外显子4进行氨基酸序列预测和比对分析,欧拉型藏羊与山羊氨基酸序列完全相同,同源性达100%,与普通牛、牦牛、水牛、赤鹿、长颈鹿的序列间同源性均为98.8%.采用NJ法构建的物种间分子系统进化树进行聚类分析结果表明,欧拉型藏羊与山羊聚在一起;普通牛与牦牛聚为一类后,再与水牛聚在一起;最后这两类再与赤鹿和长颈鹿聚类,其结果与动物学分类一致.     

羊优异繁殖性状分子遗传标记研究取得重要进展

<正>由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所储明星研究员主持完成的"羊优异繁殖性状分子遗传标记筛选及应用"项目成果于2013年1月13日通过农业部组织的成果鉴定。该研究综合应用候选基因法、微卫星多态、抑制消减杂交、转录组测序等多种实验手段,并借助生物信息学方法对我国特有地方绵羊品种"小尾寒羊"和山羊品种"济宁青山羊"的优良种质特性——高繁殖力、常年发情和性早熟进行了深入分析。研究:①在下丘脑-垂体-性腺轴或性早熟状密切相关的基因和分子标记,预测了若干与绵羊常年     

山东省济宁青山羊种质资源调查与分析报告

济宁青山羊是我国乃至世界珍贵的裘皮用山羊品种,以其高繁殖力、轻柔薄暖的青猾皮和味美鲜嫩的肉质而著称。本文对山东省境内济宁青山羊的种质资源进行了调查,并对其产业发展进行了评价与分析。     

北京荷斯坦母牛BoLA-DRB3基因外显子2的克隆与序列分析

采用PCR技术扩增出北京荷斯坦母牛BoLA-DRB3基因的外显子2的267 bp大小的片段,将该片段克隆到pGEM-T Easy质粒中,重组质粒用PCR和酶切分析进行阳性克隆鉴定,然后测定核苷酸序列,并推导其氨基酸序列.北京荷斯坦牛、蒙古牛、人类、瑞典红白花牛、蒙古绵羊、西班牙山羊之间DRB3基因外显子2的核苷酸序列同源性为80.9%～95.5%,氨基酸序列同源性为75.3%～91.0%.     

山羊mtDNA多态性及其遗传结构的研究*

 对中国6个山羊品种（辽宁绒山羊,内蒙古绒山羊,西藏山羊,中卫山羊,济宁青山羊和龙陵山羊）的52个样本进行mtDNA的D-Loop区的全序列测定,用来研究中国山羊品种的线粒体DNA遗传多态性及系统发育。用NJ法构建单倍型系统发育树,结果发现6个山羊品种的线粒体DNA控制区聚类后得到了4个很明显的分支,即单倍型A,B,C,D.品种间遗传结构分析发现内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊两个绒山羊品种与西藏山羊、中卫山羊3个可产绒的山羊品种聚在一起,接着与产羔皮的济宁青山羊聚在一起,最后与产肉性能强的龙陵山羊聚在一起。     

牦牛心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的克隆及序列分析

【目的】对牦牛H-FABP基因进行克隆和序列分析，以期为进一步开展牦牛该基因与其肉质性状的相关分析，进行分子标记辅助选择以及基因定位、表达等研究提供理论基础。【方法】用特定引物对牦牛H-FABP基因进行PCR扩增并进行T-A克隆和测序，在此基础上使用RepeatMasker、DNAMAN4.0、BioEdit4.8.10、Clustal W1.81等生物信息学软件进行序列分析。【结果】牦牛H-FABP基因(已在NCBI上登录，登录号为DQ026674)由4个外显子和3个内含子组成，CDS序列全长为402 bp，前体氨基酸数为133个。4个外显子大小分别为73 bp、173 bp、102 bp和54 bp；3个内含子大小分别为3 460 bp、1 892 bp和1 495 bp；外显子与内含子的连接区序列遵循通常的基因组成规律。外显子和内含子个数与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种相同。牦牛H-FABP基因序列中，重复序列所占比率为13.07%。内含子Ⅰ含有5个重复元件，包括1个SINE/Artiodactyls元件、1个SINE/MIR3元件、1个SINE/Bov-tA1元件和2个SINE/MIR元件；内含子Ⅱ无重复元件；内含子Ⅲ有3个重复元件，其中SINE/MIR元件、LINE/L2元件、SINE/Artiodactyls元件各1个。SINEs短重复序列所占比率为11.85%，哺乳动物分散性重复序列MIRs比率为6.44%。LINEs所占比率为1.22%，小于SINEs元件。其中，LINE1、BovB/Art2、L3/CR1重复元件以及LTR类反转录元件和DNA转座子元件在牦牛该基因区域中不存在。不同物种间在该基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列上有较高的保守性。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种在H-FABP基因编码区核苷酸序列上同源性大小分别为99.8%、97.8%、97.0%、92.8%、88.8%、83.3%、83.1%、76.4%、68.7%；相应的氨基酸序列间同源性大小为100%、96.9%、96.9%、92.4%、88.7%、85.7%、85.7%、77.4%、69.9%。【结论】牦牛H-FABP基因由4个外显子和3个内含子组成，其中外显子I、外显子Ⅱ、 外显子Ⅲ 和外显子Ⅳ大小分别为73 bp、173 bp、102 bp和54 bp，内含子I、内含子Ⅱ和内含子Ⅲ大小分别为3 460 bp、1 892 bp和1 495 bp。牦牛该基因区域含有较为丰富的重复序列元件且外显子与内含子的连接区序列遵循通常的基因组成规律。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼9个物种在H-FABP基因编码区核苷酸及氨基酸序列上具有较高的保守性。     

山羊TGFB3基因的多态性及生物学信息分析

为了解山羊TGFB3基因的多态性,并为优秀山羊品种的选育提供理论依据,选择牛TGFB3基因组序列(NM_001101183)设计1对特异性引物,采用DNA池PCR直接测序法快速检测黔北麻羊、内蒙古白绒山羊和关中奶山羊3个山羊品种的TGFB3基因的多态性.结果表明,只在黔北麻羊TGFB3基因第1外显子212 bp处发现1...