12个梨品种S基因型的鉴定

应用PCR扩增技术, 根据目的S基因与GenBank中已知S 基因同源性100%原理鉴定了我国育成的12个梨品种的S基因型, 分别是: ‘红酥脆’为S₄S₃₆ , ‘新梨7号’为S₂₈S_d , ‘金水3号’为S₅S₂₉ , ‘八月酥’为S₃S₁₆ , ‘金水1号’为S₃S₂₉ , ‘龙泉酥’为S₃S₂₂ , ‘雪花’为S₄S₁₆ , ‘雪芳’为S₄S₁₆ ,‘雅青’为S₄S₃₄ , ‘新雅’为S₄S₃₄ , ‘德胜香’为S₃S₂₉ , ‘富源黄’为S₁₆S₃₃。通过对S基因的DNA序列分析, 确认S₁₆、S₃₁为同一S基因。本研究结果丰富了我国梨品种的S基因型信息, 为田间合理配置授粉品种提供了依据。     

京白梨等品种S 基因型鉴定及新基因S28 和S30 的核苷酸序列分析

 根据梨S基因高度保守区C1和C3区, 设计1对引物P1和P2, 对梨品种的基因组DNA进行S基因特异扩增、克隆、测序, 并在GenBank中BLAST比较, 确定S 基因特异性片段, 对京白梨等6个供试自交不亲和品种的S基因型比对结果为: 白梨中的‘库尔勒香梨’为S₂₁ S₂₈ , ‘苹果梨’为S₁₇S₁₉ ; 砂梨中的‘台湾蜜梨’为S₁₁ S₂₂ ; 西洋梨中的‘葫芦梨’为S_a S_b; 秋子梨中的‘京白’为S₁₆ S₃₀ , ‘早梨18’为S₄ S₂₈。其中S₂₈和S₃₀为首次登录的新S 基因, 在GenBank的登录号分别为AY562394 (库尔勒香梨) 和AY876945 (京白) 。     

‘鸭梨’芽变‘闫庄梨’自交亲和性分子机制初步研究

 通过‘鸭梨’（S₂₁S₃₄）及其芽变‘闫庄梨’自花授粉和相互授粉结实率和种子数调查发现,‘鸭梨’自花授粉结实率为9.1%,果实平均种子数为0,表现自交不亲和性;‘闫庄梨’自花授粉结实率为56.9%,果实平均种子数为8.64,表现自交亲和性;以‘闫庄梨’为母本,‘鸭梨’为父本,授粉结实率为39.3%,果实平均种子数为3.36,也表现亲和性,而以‘鸭梨’为母本,‘闫庄梨’为父本,授粉结实率仅为2.0%,果实平均种子数为0粒,表现不亲和性。因此,初步推断‘闫庄梨’自交亲和性可能是由于花柱突变所致。利用S₂₁和S₃₄等位基因特异性引物对‘闫庄梨’自交后代S-RNase基因型进行鉴定,结果发现S₂₁在所有后代中均有扩增条带,进一步证明‘闫庄梨’花柱S₂₁等位基因及其编码产物可能发生了突变。蛋白质印迹杂交分析结果表明,‘闫庄梨’花柱S-RNase缺失了一条带,而没有缺失的条带蛋白含量也比‘鸭梨’低。由此初步证明‘闫庄梨’的自交亲和性可能是由于花柱S-RNase的突变和表达量低所致。     

梨20个品种S基因型的鉴定及新S-RNases基因克隆

 为了鉴定我国梨品种和一些野生类型个体的S基因型,应用S-RNase特异PCR扩增、克隆和测序,对其S-RNases基因核苷酸序列进行分析,鉴定了20个梨品种和野生类型个体的S基因型。起源于我国的'奥连'(S_pS₃₂)、'吊蛋'(S_dS_e)、'沙疙瘩'（S₃₆S_d）品种和杏叶梨的一个类型（S₂₂S_c）个体中存在西洋梨的S-RNase基因,证明S-RNase基因分化是在东方梨种群和西方梨种群的各个种形成之前。在秋子梨的'麦梨'、'内蒙古山梨'中发现了2个新S-RNases基因,命名为S₄₀-、S₄₁-RNase（DQ903313、DQ988687）。S₄₀-和S₄₁-RNase基因推导的部分氨基酸序列分别与苹果属S₁₁-和S₆-RNase的同源性为100%和94.4%,这表明S-RNase的存在可能在梨属和苹果属形成之前。     

新疆野生樱桃李S-RNase基因分离与鉴定的初步研究

 从4对已报道的李属树种S-RNase基因引物组合中筛选出扩增效果较好的PruC2和PruC4R组合,首次对新疆野生樱桃李（Prunus cerasifera Ehrh.）的45个株系的基因组DNA进行S-RNase基因特异性PCR扩增,并对其PCR产物进行克隆测序。这些核酸序列及其相应的氨基酸序列在GenBank中进行比对, 皆与李属的S-RNase基因有最大同源性,为新疆野生樱桃李的4种S-RNase基因,分别命名为S₁ （511 bp）,S₂ （787 bp）,S₃ （1859 bp）和S₄ （464 bp）,在GenBank的登录号分别为EF638726、EF641276、EF661873和EF661874。45个株系中,43个株系的S基因型分别为S₁S₂、S₁S₃、S₂S₃、S₂S₄和S₃S₄,而10号和15号株系分别只鉴定了一种S-RNase基因,其S基因型组成有待于进一步研究。     

苹果新品种自交不亲和基因型的分子生物学鉴定

根据保守氨基酸序列FTQQYQ 和anti-¹/_M IWPNV 设计苹果自交不亲和基因引物P1 : 5′2 TT2TACGCAGCAATATCAG23′; P2 : 5′2 ACGTTCGGCCAAATA /CATT23′, 利用PCR - RFLP分析方法, 以河北省新引进的苹果品种美国8号、昂林、松本锦、华冠、南方脆幼叶为试验材料, 鉴定其自交不亲和基因型分别为S₉S₂₇、S₁S₉、S₉S ₉、S₂S₉、S₂S₉。     

白梨新S基因的克隆

 采用PCR - RFLP检测、DNA序列分析和田间杂交试验, 从白梨中分离鉴定了1个新的S-RNase基因。该S-RNase基因PCR扩增产物大小与S-RNase基因PCR产物相似, 为450 bp左右。但PCR -RFLP和DNA序列分析均表明, 它与S₈-RNase基因存在较大差异, 该基因内含子为252 bp, 而S₈-RNase的内含子为234 bp, 并在高变区中具有10个氨基酸出现替换, 有两个氨基酸出现缺失。而该S-RNase基因却与S₁₂-RNase基因具有较高的相似性, 在HV区中只有1处碱基被替换, 周边区中有10处出现碱基替换或缺失。因此, 继梨S18-RNase基因, 将它命名为S₁₉-RNase基因(AY250987) 。与S 基因型已确定的梨品种的杂交坐果率也说明了该基因是一个新的S-RNase基因。     

杏杂种一代群体S基因的遗传研究

 以4～5年生的凯特(自交亲和) 、新世纪(自交不亲和) 以及凯特×新世纪、凯特×红丰(自交不亲和) 、凯特×泰安水杏(自交不亲和) 等杏群体为试材, 采用田间授粉试验及S-allele-specificPCR扩增等方法对杏S基因的遗传进行了研究。结果表明: 如果按照自交坐果率≥6%为自交亲和的标准,上述3个杂交组合的F₁ 群体自交亲和与自交不亲和的比例分别为27∶25, 9∶12和15∶19, 经X² 检验, 均符合1∶1的分离比例, 证明凯特的自交亲和性是可遗传的, 并且其S 基因型是杂合的, 自交亲和对自交不亲和为显性; 对凯特( S_cS₈ ) ×新世纪( S₉ S₁₀ ) F₁ 群体38 个株系进行S-allele specific PCR, 共扩增出21(S_cS₈、S₈S₉ ) ∶9 (S_cS₁₀ ) ∶8 (S₈S₁₀ ) 4种基因型, 经X² 检验, 符合1∶1∶1∶1的理论比例; 但自交亲和性表现数量性状变异的特点, 并且相同S基因型的F₁ 自交亲和性强度存在明显差异, 如杂种8、14、16、20、22、27、33、34、38号的S基因型都为S_cS₁₀ , 但自交坐果率从1.1%到22.9%不等, 表明杏的自交亲和性是一个复杂的问题, 不仅与S基因及其基因型有关, 还可能受修饰基因等其它遗传因素的调控。     

新高系梨10个品种S基因型的鉴定

以亲缘关系极近的新高系梨10个品种及被视为‘新高’亲本的‘天之川’和‘今村秋’梨等为试验材料,对其基因组DNA进行了PCR-RFLP检测、DNA序列测定及生物信息学分析。结果表明：新高系梨10个品种即‘新高’、‘黄金’、‘水晶’、‘早生黄金’、‘早蜜新高’、‘天皇’、‘金秋’、‘晚大新高’、‘农家新高’和‘鲜黄’的S基因型分别为S₃S₉、S₃S₄、S₃S₉、S₃S₄、S₃S₉、S₃S₉、S₃S₉、S₃S₉、S₃S₉和S₃S₅;‘天之川’、‘今村秋’的S基因型分别为S₁S₉和S₁S₆,通过基因型判定‘今村秋’非‘新高’梨的父本。     

‘早酥’梨及其红皮芽变‘红早酥’梨类黄酮组分变化与合成模式研究

【目的】探讨不同发育时期‘早酥’梨及其红皮芽变‘红早酥’梨果皮类黄酮组成与合成模式。【方法】以‘早酥’梨与芽变‘红早酥’梨不同发育时期的果实为材料,通过HPLC-MS2法测定其果实发育过程中类黄酮组分的含量变化,通过实时荧光定量PCR测定相关合成基因表达水平的变化。【结果】‘早酥’梨和‘红早酥’梨果皮类黄酮组分与含量差异较大,差异主要集中在黄酮醇、原花青素和花青苷代谢支路。2个品种果实自然发育过程中的类黄酮积累模式基本一致,以酚酸、原花青素、黄酮醇和花青苷为主的多数类黄酮组分的合成高峰位于果实发育早期,随着果实发育成熟,酚酸类物质含量呈现不断下降趋势,大部分原花青素、花青苷和黄酮醇类物质在果实膨大期后含量维持稳定。‘早酥’梨葡糖糖苷类黄酮、原花青素组分儿茶素和原花青素B2在果实成熟期出现第二个积累高峰。类黄酮合成高峰期,大多数类黄酮合成基因表达水平达到峰值。果实发育后期,下游类黄酮合成基因DFR、ANR、ANS和UFGT表达量相应提高。【结论】‘红早酥’梨果皮比‘早酥’梨果皮含有更多类黄酮物质,特别是类黄酮糖苷衍生物的种类更为丰富,含量也显著升高。‘红早酥’梨和‘早酥’梨果皮中的类黄酮合成高峰均位于果实发育早期。随着果实的发育,‘红早酥’成熟果皮中类黄酮组分含量虽有下降,但仍含有较高水平的原花青素和类黄酮糖苷类衍生物。     

8个中国梨品种S基因型的分子鉴定

为鉴定8个中国梨品种的S基因型,使用梨自交不亲和基因(S-RNase)特异引物"FTQQYQ"和"anti-ⅡWP-NV",对8个梨品种的基因组DNA进行特异扩增,并对扩增片段进行回收、克隆、测序。使用生物信息学软件对各序列分析和经同源性搜索分析后,确定了各品种的S基因型。结果分别是:兰州花长把为S19S22,青面为S1S18,黄面为S1S12,早蜜为S19S29,大面黄为S1S19,无子黄为S28S16,大青皮为S34S19及金锤子为S16S19。     

八月酥等14个梨品种自交不亲和基因(S基因)型的鉴定

多数梨品种自花授粉不结实,生产上要合理配置授粉品种才能获得应有的产量。鉴定梨品种的S基因型,能为梨园合理配置授粉品种提供依据。以我国育成的梨品种为试材,利用特异引物PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及DNA序列分析,鉴定出了14个梨品种的自交不亲和基因型(S基因型),并通过统计部分品种的田间人工授粉的坐果率以及应用荧光显微镜观察异花授粉后花柱内的花粉管生长情况来验证鉴定出的梨品种S基因型的可靠性。这些品种的S基因型为:八月酥S3S16、绿云S3S29、谢花甜S29S34、香茌S1S21、脆绿S3S4、新雅S4S34、雅青S4S34、伊犁红句句S22S28、猪嘴酥S19S22、假直把子S5S19、青魁S1S3、德胜香S3S29、张掖长把S3S29、金坠梨S21S34。     

番茄抗病基因Tm-22及其等位基因氨基酸序列的比较

 从4个番茄栽培品种（Lycopersicon esculentum Miller）中获得了Tm-2²等位基因的同源克隆，进行序列分析，结果表明：'沙龙'、'渝抗2号'和'97-4'分别与'GCR-267'（Tm-2²）、'GCR-236'(tm-2)、以及'GCR-26'(tm-2)有100％的同源性, 而樱桃番茄（Lycopersicon peruvianum. var.cerasiforme）品种'樱红1号'与'GCR-26'（tm-2）仅有98％的同源性；在C-端的LRR结构域中，抗病基因 Tm-2²和Tm-2 编码蛋白的氨基酸序列与感病基因tm-2存在624和704两个位点的氨基酸差异，即624位点的脯氨酸（P）对应亮氨酸（L）、704位点的甲硫氨酸（M）对应异亮氨酸（I）； 在601-790个氨基酸的LRR结构域中，抗病基因Tm-2²、Tm-2及其秘鲁种（Lycopersicon peruvianum var. dentatum）lptm-2三者均与感病基因tm-2的编码蛋白存在23个氨基酸的差异；（4）樱桃番茄品种'樱红1号'与含有tm-2基因的栽培种之间具有同源性关系。     

槜李等15个李品种S基因型鉴定及其多态性分析

利用李属S-RNase基因特异性引物,对15个供试李品种进行PCR扩增,共获得30个目的条带。对这些目的条带进行测序鉴定出15个李品种的S基因型。通过与NCBI中利用BLASTn与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB等数据库中的序列比对,结果表明,其中9个为新S-RNases基因,对9个新S-RNases核苷酸序列进行分析发现,位于高变区内的内含子大小为141～1758bp,其同源性为33.9%(S-18～S-19)～81.6%(S-20～S-21),表现出丰富的长度和序列多态性;编码区的核苷酸序列比对结果,其同源性为73.3%(S-16～S-19)～91.7%(S-17～S-22);其推导氨基酸序列相似性为67.3%(S-16～S-19)～89.1%(S-17～S-22);包含李属S-RNase一级结构所共有的C2、C3保守区和高变区(RHV)。系统进化分析表明,9个新S-RNases与李属其它树种S-RNases聚类在一起,归属为李亚科(Prunoideae)。     

秋子梨等九个品种S基因型的鉴定

根据梨S基因高度保守区设计兼并引物,对各秋子梨品种的基因组进行S基因特异性扩增、连接、转化并测序,GenBank中比较后确定各品种的S基因型.9个供试品种的S基因型分别为:秋子梨中的'寒香'为S36Sx,'苹香'为S1S31,'南果梨'为S34S34,'金香水'为S1Si,'延边大香水'为S31S36,'寒红'为S27S34,'小香水'为S29S34,'花盖王'为S31S31S34S34,白梨中的'锦丰'为S19S34.