耳叶水苋对乙酰乳酸合成酶抑制剂的抗性及其分子机制初探

近年来长江下游地区稻田耳叶水苋Ammannia arenaria H.B.K.危害十分严重。采用盆栽法首次测定了耳叶水苋对苄嘧磺隆等药剂的抗性水平,同时分析了其抗性和敏感种群间乙酰乳酸合成酶(ALS)基因的DNA序列及其RNA表达差异。结果表明:采自浙江嘉兴(JX110)、江苏苏州(JS039)、浙江宁波(NB0143-05)和安徽广德(AH014)的耳叶水苋生物型对苄嘧磺隆的抗性指数(RI)分别为67.90、17.59、44.63和8.37,对苄嘧磺隆表现出中高水平抗性的生物型对五氟磺草胺、双草醚及咪唑乙烟酸也产生了低水平的抗性。获得了耳叶水苋ALS基因全长核苷酸序列2235 bp,编码667个氨基酸,仅发现NB0143-05等3种抗性生物型ALS酶的氨基酸序列非保守区第93位的亮氨酸被脯氨酸取代。然而,NB0143-05的ALS酶对ALS抑制剂的敏感性大幅度降低(RI 37.04),且在苄嘧磺隆处理后4 d的ALS基因表达量是敏感生物型(HZ001)的1.86倍。这表明,ALS酶对药剂的敏感性降低以及被苄嘧磺隆诱导后ALS基因表达量显著增加,很可能是耳叶水苋生物型NB0143-05对ALS抑制剂产生抗性的原因。     

稻田耳叶水苋发生规律及生物学特性研究

为明确上海地区稻田新优势杂草耳叶水苋的发生规律,对上海地区稻田中耳叶水苋的发生情况进行了田间调查和定点观察,并在室内研究了其生物学特性。结果表明,耳叶水苋发生周期长,有两个明显的发生高峰,分别为水稻播种后第1周和第3周。水稻播种后45 d,耳叶水苋种群数量达到最大,随后,种群数量逐渐下降。耳叶水苋的种子在23～27 ℃条件下发芽最好。作为一种水生杂草,其种子在土壤含水量40％～60％的湿润或饱和状态下,发芽率较高,且耳叶水苋的种子对水层具有较好的适应能力,即使处于10 cm水层下也可以正常萌发。耳叶水苋种子极小,其顶土能力较差,覆盖0.5 cm土层能有效抑制其出苗。     

耳叶水苋田间发生消长规律及化学防除技术研究

耳叶水苋是上海地区稻田新优势杂草。田间定点观察结果表明,耳叶水苋发生周期长,有两个明显的发生高峰,分别为水稻播种后第1周和第3周。整地后播种前使用草酮、苄嘧.丙草胺或丁草胺进行土壤封闭处理,能有效控制耳叶水苋的危害。草酮持效期可达40 d,苄嘧.丙草胺和丁草胺持效期约20 d。对于已经出土的耳叶水苋可选用2甲.灭草松、2甲4氯钠或使它隆进行茎叶处理,适宜施药时期为水稻4~6叶期。     

多花水苋对苄嘧磺隆的抗性水平及靶标抗性机制

为明确水稻田杂草多花水苋Ammannia multiflora对乙酰乳酸合成酶 (ALS) 抑制剂类除草剂苄嘧磺隆的抗性水平和抗性分子机制,采用整株水平测定法,测定了采自江苏省扬州市田间的多花水苋疑似抗性种群 (YZ-R) 对苄嘧磺隆的抗性指数,并分析了YZ-R种群和相对敏感种群 (YZ-S)多花水苋ALS酶对苄嘧磺隆的敏感性差异,同时比较了YZ-R和YZ-S种群ALS基因的核苷酸序列差异。结果表明:YZ-R种群多花水苋对苄嘧磺隆已表现出高水平抗性,其抗性指数 (RI) 为40.6;苄嘧磺隆对YZ-R种群ALS酶活性的抑制中浓度 (I₅₀) 为0.087 μmol/L,对YZ-S种群的I₅₀值为0.0028 μmol/L,其抗性指数为31.1。通过PCR扩增获得了多花水苋ALS基因的部分序列,该序列包含了已报道的8个氨基酸突变位点。ALS基因序列比对分析发现,YZ-R种群多花水苋植株ALS基因第197 位氨基酸由脯氨酸 (CCT) 突变为丝氨酸 (TCT)。研究表明,ALS基因发生脯氨酸 (Pro)-197-丝氨酸 (Ser) 的突变,导致多花水苋ALS酶对苄嘧磺隆的敏感性下降,是多花水苋YZ-R种群对苄嘧磺隆产生高水平抗性的主要原因。     

反枝苋对咪唑乙烟酸抗性水平及分子机制

为初步明确大豆田反枝苋对咪唑乙烟酸的抗药性水平,并从分子角度对抗药性机制进行解释,以我国四川成都和黑龙江嫩江采集的反枝苋种子为材料,通过琼脂法检测了反枝苋对咪唑乙烟酸的抗药性水平,并分别对R(嫩江抗性种群)和S(成都敏感种群)的乙酰乳酸合成酶(ALS)部分序列进行扩增和测序。皿内生测结果表明,成都种群的GI50为11.20,嫩江种群的GI50为52.26,其抗药性指数RI为4.67。分子检测结果表明,与S种群相比,R种群反枝苋ALS位于高度保守区Domain B编码574位氨基酸的基因发生突变,TGG突变为TTG,导致色氨酸被亮氨酸取代。ALS保守区域氨基酸的替换可能是嫩江反枝苋种群对咪唑乙烟酸产生抗性的重要原因之一。     

玉米田反枝苋对烟嘧磺隆的抗性水平及靶标抗性分子机理

为明确玉米田主要杂草反枝苋对烟嘧磺隆的抗性水平及靶标抗性分子机理,采用整株水平测定法检测了黑龙江省玉米田反枝苋对烟嘧磺隆的抗性水平,通过靶标酶离体活性测定,分析了抗性和敏感种群反枝苋乙酰乳酸合成酶 (ALS) 对烟嘧磺隆的敏感性,并通过靶标ALS基因克隆测序进行了序列比对分析。结果显示:黑龙江省反枝苋疑似抗性种群 (HLJ-R) 对烟嘧磺隆已产生较高水平抗性,其抗性倍数达13.7;酶活性测定结果表明:烟嘧磺隆对HLJ-R种群ALS活性的抑制中浓度 (IC₅₀) 值是对敏感种群 (TA-S) IC₅₀值的43.9倍;与TA-S种群相比,HLJ-R种群ALS基因205位丙氨酸突变为缬氨酸,574位色氨酸突变为亮氨酸。研究表明,黑龙江省玉米田反枝苋对烟嘧磺隆已产生较高水平抗性,且靶标ALS基因的突变可能是其抗性产生的主要原因之一。     

辽宁省稻田野慈姑对苄嘧磺隆的抗药性

为明确辽宁省不同稻田区野慈姑对苄嘧磺隆的抗性水平,整株测定了辽宁省大石桥(种群R1)、海城(种群R2)、苏家屯(种群R3)和开原(种群R4)共4个水稻产区野慈姑对苄嘧磺隆的抗性水平,并离体测定了各种群叶片体内乙酰乳酸合成酶(ALS)对苄嘧磺隆的敏感性。结果显示,种群R1和R2的抗药性相对较高,抗性指数分别为76.99和49.94,种群R3和R4抗性相对较低,抗性指数分别为12.48和16.91;离体测定结果表明较高水平的ALS活性可能与是否产生抗药性无关,种群R1、R2、R3、R4的抗性指数分别为81.86、67.48、10.56、24.86;抗药性程度依次为R1R2R4R3。表明4个水稻产区野慈姑对苄嘧磺隆均产生了抗药性,而其体内ALS活性降低可能是产生抗药性的原因之一。     

稻田雨久花对苄嘧磺隆的抗药性

性指数达63.4;对德惠抗、感雨久花ALS活力的IC50分别为10 756.2和396.8nmol/L,抗性指数为27.1.表明两地稻田雨久花均对苄嘧磺隆产生了抗药性,而其体内ALS敏感性降低是产生抗药性的原因之一.     

黑龙江省大豆田反枝苋对氟磺胺草醚的抗药性机制研究

为明确反枝苋抗性种群对氟磺胺草醚的抗性机制,分别测定了氟磺胺草醚对反枝苋抗性和敏感种群体内原卟啉原氧化酶(PPO)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的影响。结果表明:氟磺胺草醚处理后,抗性和敏感反枝苋种群PPO活性均受到一定程度的抑制,但抗性种群活性受到抑制后能逐渐恢复,而敏感种群则不能恢复;施用氟磺胺草醚后,抗性和敏感反枝苋种群GSTs和SOD活性变化无明显差异,抗性和敏感反枝苋种群POD和CAT活性均受到一定程度的抑制,但抗性种群活性受到抑制后能逐渐恢复,而敏感种群则不能恢复。研究表明,反枝苋抗性种群体内PPO对氟磺胺草醚敏感性降低是其产生抗药性的原因之一,反枝苋POD和CAT对活性氧的抵御能力差异也可能与反枝苋对氟磺胺草醚的抗性有关。     

湖南稻区稗草对二氯喹啉酸的抗性研究

利用整株测定法,测定湖南省主要稻区29个稗草生物型对二氯喹啉酸的抗性。结果表明,湖南省隆回县的生物型稗草对二氯喹啉酸最敏感,其EC50为76.388 3 g a.i./hm2,为敏感生物型。湖南省益阳芷湖口镇和湖南省长沙望城县(直播田)的生物型稗草对二氯喹啉酸的EC50分别为1 567.164 g a.i./hm2和2 477.542 g a.i./hm2,抗药性指数分别达20.52和32.43,表明这两种生物型稗草的抗药性处于高水平抗性。其中10个生物型稗草的EC50为155.931 8～375.114 g a.i./hm2,抗药性指数为2.02～4.91,表明这些生物型稗草已产生抗性。而其余16个生物型稗草的EC50为84.020 3～151.596 g a.i./hm2,抗药性指数为1.10～1.98,表明这些地方稗草的敏感性正在下降。     

浙江省果蔬灰葡萄孢对啶酰菌胺的抗性

以2004—2006年从浙江、江苏等地采集的灰葡萄孢对啶酰菌胺的敏感性基线[EC₅₀ = (1.07 ± 0.11) mg/L]为依据,采用菌丝生长速率法连续监测了浙江省果蔬灰葡萄孢群体对啶酰菌胺的敏感性变化。结果表明:浙江省果蔬灰葡萄孢对啶酰菌胺的抗性发展迅速,2012—2013年和2017—2018年的平均EC₅₀值分别为 (5.23 ± 7.79) 和 (24.30 ± 49.33) mg/L。其中,2012—2013年的抗药性菌株频率为15.3%,且均为低水平抗性 (LR) 菌株;而2017—2018年的抗药性频率上升至53.2%,并出现了7.5%的中等水平抗性 (MR) 菌株和1.3%的高水平抗性 (HR) 菌株。啶酰菌胺抗性菌株的菌丝生长速率、产孢量、产菌核数和致病力与敏感菌株相比均无显著差异。抗药性分子机制研究表明:啶酰菌胺抗性菌株的琥珀酸脱氢酶B亚基 (SDH B) 均发生了点突变,共包括H272R、P225F和N230I 3种类型,其中H272R型突变占88.5%;其SDH A和SDH D均未发生点突变;而SDH C的突变 (G85A + I93V + M158V + V168I) 与对药剂敏感性之间无明显联系。     

广东省水稻田稗对五氟磺草胺的抗性分析

为明确广东省水稻田杂草稗Echinochloa crus-galli对五氟磺草胺的抗性现状及其可能的抗性机理,采用整株剂量反应法测定不同地区稗种群对五氟磺草胺的抗性水平,对不同稗种群的乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase,ALS）基因片段进行扩增测序,分析细胞色素P450酶（cytochrome P450 monooxygenase,P450）和谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase,GST）抑制剂胡椒基丁醚（piperonylbutoxide,PBO）和4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂噁二唑（4-chloro-7-nitro-1,2,3-benzoxadiazole,NBD-Cl）对不同稗种群抗性水平的影响,并对替代药剂进行筛选。结果显示,广东省水稻田多数稗种群对五氟磺草胺仍表现敏感,但采自湛江市的1个种群BC-7对五氟磺草胺产生了抗性,抗性倍数达6.5倍。与敏感种群BC-2相比,BC-7种群并未发生已报道的ALS靶标抗性相关突变。PBO和NBD-Cl均可显著提高BC-7种群对五氟磺草胺的敏感性,其干重抑制中量GR₅₀由31.1 g/hm²分别降为11.0 g/hm²和24.7 g/hm²。BC-7种群对氰氟草酯和噁唑酰草胺仍较敏感,但对二氯喹啉酸和双草醚产生了抗性。表明P450和GST介导的代谢抗性是稗BC-7种群产生抗性的重要原因,氰氟草酯和噁唑酰草胺适用于治理该抗性种群。     

水直播条件下黑龙江省不同稻区稻瘟病菌致病性分析

为明确水直播条件下黑龙江省不同稻区稻瘟病菌Magnaporthe oryzae的致病性分化情况,以24个抗瘟单基因系品种为寄主,来源于2017—2018年黑龙江省水直播稻田的242株稻瘟病菌菌株为接种体,采用离体划伤方法接种,记录病斑反应型,计算有效致病菌株率和抗性频率,并进行聚类分析。结果显示,在水直播条件下,2017年,黑龙江省南部和中东部稻区稻瘟病菌菌株对抗瘟单基因系品种的有效致病菌株率介于8.33%~95.83%和20.83%~95.83%之间,无毒基因出现频率分别为575次和622次;2018年,南部和中东部稻区稻瘟病菌菌株对鉴别体系的有效致病菌株率介于29.17%~95.83%和20.83%~91.67%之间,无毒基因出现频率分别为536次和571次。2017年,黑龙江省南部和中东部稻区稻瘟病菌菌株的致病性相似系数介于0.15~1.00和0.14~1.00之间,以致病性相似系数0.40为阈值,可将菌株分别划分为5个类群和6个类群;2018年,南部和中东部稻区菌株的致病性相似系数介于0.15~0.93和0.26~1.00之间,以致病性相似系数0.40为阈值,可将菌株分别划分为5个类群和4个类群。2017年,抗瘟单基因系品种对黑龙江省南部和中东部稻区稻瘟病菌菌株的抗性频率介于11.29%~88.71%和10.77%~86.15%之间,其中抗瘟单基因系品种IRBL9-W（Pi-9）和IRBLz5-CA（Pi-z5）抗性表现最好;2018年,抗瘟单基因系品种对南部和中东部稻区菌株的抗性频率介于10.34%~82.67%和15.79%~85.96%之间,其中抗瘟单基因系品种IRBL9-W（Pi-9）和IRBLz5-CA（Pi-z5）抗性表现最好。表明水直播条件下黑龙江省稻瘟病菌致病性分化剧烈,稻瘟病菌整体致病力较强,但仍有部分水稻种质抗性较好且相对稳定,基因聚合后抗性会得到进一步提升。     

安徽省稻田千金子对氰氟草酯和噁唑酰草胺的抗性及其靶标分子机制

为明确安徽省稻田杂草千金子Leptochloa chinensis对氰氟草酯和噁唑酰草胺的抗性,从安徽省12个市38个县（市、区）稻区千金子发生较严重的田块中共采集72个千金子种群,采用整株生物测定法检测其对氰氟草酯和噁唑酰草胺的抗性,筛选同时对噁唑酰草胺和氰氟草酯有疑似抗性的千金子种群并测定其对这2种药剂的抗性水平,同时利用分子生物学技术检测千金子高抗种群的乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase,ACCase）基因是否发生抗性位点氨基酸突变。结果显示,在72个千金子种群中,13个千金子种群已对氰氟草酯产生抗性,5个千金子种群已对噁唑酰草胺产生抗性;AH-1、AH-3、AH-7、AH-34和AH-72这5个千金子种群同时高抗氰氟草酯和噁唑酰草胺,其中对氰氟草酯的抗性指数介于21.98～65.52之间,对噁唑酰草胺的抗性指数介于11.76～27.19之间;这5个种群的ACCase基因片段均在2 027位点发生氨基酸突变,色氨酸突变为半胱氨酸;此外AH-3和AH-72这2个种群在1 999位点也由色氨酸突变为半胱氨酸,表明安徽省千金子已经对氰氟草酯和噁唑酰草胺产生交...     

2017—2019年江西省二化螟种群对四种杀虫剂的抗性

为明确近年来江西省二化螟种群对常用杀虫剂的抗性水平,提出合理化用药建议,本研究采用人工饲料浸药法测定2017—2019年江西省13个县(市)二化螟田间种群对氯虫苯甲酰胺、阿维菌素、三唑磷和杀虫单的抗性。结果表明,13个二化螟种群对氯虫苯甲酰胺的抗性水平整体为中等至高水平抗性,其中有11个二化螟种群对氯虫苯甲酰胺的抗性水平整体为上升趋势,在对氯虫苯甲酰胺抗性水平增加的种群中,都昌种群的抗性倍数从2017年的44.1倍上升至2018年的65.1倍,在2019年激增至高水平抗性,抗性倍数为283.5倍,为供试种群的最高抗性倍数。13个二化螟种群对阿维菌素的抗性水平整体为中等偏下,在对阿维菌素抗性水平增加的种群中,南昌种群的抗性倍数最高,2017—2019年分别为74.8倍、108.7倍和80.6倍。13个二化螟种群对三唑磷的抗性水平整体为中等偏下,其中新干、永修、万安、大余、上高和都昌这6个种群对三唑磷的抗性水平呈波动上升的趋势,而其他7个种群对三唑磷的抗性水平为波动性变化,偶有下降。13个二化螟种群对杀虫单的抗性水平整体为中等偏下并且有明显下降趋势,其中大余、永修、泰和、会昌、新干和上高这...     

华东部分稻区水稻田千金子对氰氟草酯的抗性

采用整株生物测定法检测了华东部分稻区水稻田千金子Leptochloa chinensis (L.) Nees对氰氟草酯的抗性水平并初步探讨了其抗性发生的分子机理。结果表明:与敏感种群 (LC-S) 相比,采自华东部分稻区水稻田的25个千金子种群对氰氟草酯均表现出一定的抗性,其中LC-17-276、LC-17-281、LC-17-282、LC-17-283、LC-17-289和LC-17-290种群的抗性水平较高,抗性指数分别为16、21、27、30、12和15。通过分子手段检测,首次发现在千金子抗性种群LC-17-276中,乙酰辅酶A羧化酶 (acetyl CoA carboxylase,ACCase) 的CT结构域中的色氨酸 (Trp)-1999被丝氨酸 (Ser) 取代,而其他9个被检测的千金子抗性种群却并未发现ACCase的CT结构域位点发生变异。研究表明,华东部分稻区水稻田千金子对氰氟草酯产生了广泛的抗性,其中LC-17-276中ACCase基因的W1999S突变很可能是导致该抗性种群对氰氟草酯产生抗性的重要原因之一。     

广东省不同稻区稻瘟病菌生理小种鉴定及无毒基因分析

为明确广东省不同稻区稻瘟病菌Magnaporthe oryzae生理小种与无毒基因的类型与分布,利用7个中国鉴别品种、11个抗稻瘟病单基因系及3个广东省优质抗源稻种三黄占2号、青六矮和珍桂矮,采用苗期喷雾接种方法对2018—2019年分别从广东省不同稻区感染稻瘟病的不同栽培稻品种上分离获得的368株稻瘟病菌单孢菌株进行生理小种鉴定与无毒基因分析。结果显示,利用中国鉴别品种共鉴定出 6 群 30 个生理小种,其中优势种群为 ZB 和 ZC,出现频率分别为 44.29% 和43.48%,优势生理小种为ZB13和ZC13,出现频率分别为26.90%和29.35%。利用11个水稻抗稻瘟病单基因系鉴定出测试菌株对含有Pi9、Pi1、Pik-h和Pi50这4个水稻抗稻瘟病单基因系的无毒性频率均大于80.00%;来自粤北、粤西和珠三角3个稻区的稻瘟病菌对抗源稻种三黄占2号的毒性频率低于11.76%,对珍桂矮的毒性频率大于69.41%。表明2018—2019年广东省稻瘟病菌群体生理小种结构复杂,多样性丰富,在粤北、粤西和珠三角稻区可利用的抗性基因一致,可推广使用含抗性基因Pi9、Pi50、Pik-h和Pi1的水稻品种;三黄占2号抗性好,抗谱较宽,可作为广东省抗稻瘟病种质资源加以利用。