白菜花药特异基因BcACT 的克隆与表达分析

    根据GenBank 数据库中已发布的肌动蛋白基因序列设计全长扩增引物,分别从白菜混合花蕾cDNA 和叶片基因组DNA 中克隆到各自的全长,其基因命名为BcA CT ,并利用RT‐PCR 技术研究该基因在白菜3个材料的不同器官以及保持系花蕾各部位的表达模式.结果表明:BcA CT 的DNA 全长为1704bp ,具有3个内含子,编码区长度为1134bp ,编码377个氨基酸;基因表达结果显示,BcA CT 基因在保持系Bcaj h97‐01B和Polima不育Bcpol97‐05A 的花蕾中表达,但表达模式存在差异,而在Ogura不育系Bcogu97‐06A 中未检测到;此外,BcA CT 基因的表达具有花药特异性,并且在花药发育过程中上调表达.     

青花菜钙依赖蛋白激酶基因BoCDPK1的克隆与表达

钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPK)为Ca²⁺传感蛋白,在植物生长发育和逆境响应中起着重要作用。在克隆青花菜BoCDPK1基因的基础上,开展序列分析、系统发育分析和表达分析,为后续的基因功能鉴定和抗逆育种奠定基础。该研究以青花菜为材料,利用PCR法克隆1个CDPK 基因,利用生物信息学对序列进行分析,并采用qRT-PCR研究该基因在霜霉菌和核盘菌侵染下的表达模式。测序结果表明,BoCDPK1的基因组DNA全长为2 414 bp,具6个内含子,编码区全长为1 647 bp,编码548个氨基酸;BoCDPK1有1个S_TKc和4个EF手性结构域。多序列比对结果表明,BoCDPK1与芸薹属植物同源序列的相似性最高,仅个别氨基酸残基存在差异,它们在系统发育树上聚于一组。qRT-PCR结果表明,BoCDPK1的表达受霜霉菌和核盘菌的诱导,表达量均呈现先上升后下降的规律。在霜霉菌的诱导下,BoCDPK1的表达量在72 h达最大值,为对照的3.4倍;而在核盘菌侵染下,BoCDPK1的表达量在36 h达最大值。该研究明确了青花菜BoCDPK1基因的序列特点、系统发育关系和表达特征。     

白桦抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因克隆及表达分析

从白桦（Betula platyphylla Suk．）cDNA文库中获得一个抗坏血酸过氧化物酶（APX）基因全长cDNA序列,该序列去除polyA后长1049bp,其ORF全长750bp,编码250个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量为27712．7,理论等电点6．08,保守区分析确定其含有APX蛋白保守序列,属于植物POD超家族。利用实时定量RT—PCR进一步分析白桦苗木在0．8％NaCl胁迫处理下不同时间点APX基因的表达情况。结果表明,盐胁迫处理诱导了APX基因在白桦叶片中的表达,说明APX基因与植物抗盐相关。     

青花菜C3H型锌指蛋白基因BoCCCH2的克隆与表达

以青花菜为材料,在克隆C3H型锌指蛋白基因BoCCCH2的基础上,研究该基因在不同器官及霜霉菌和灰葡萄孢菌侵染叶片中的表达模式。测序结果表明,BoCCCH2没有内含子,编码区全长为1 740bp,编码579个氨基酸,推导的蛋白质具2个ANK结构域和2种CCCH锌指结构,锌指结构的类型分别为C—X8—C—X5—C—X3—H和C—X5—C—X4—C—X3—H.反转录聚合酶链反应表明:BoCCCH2在根、叶、花茎、嫩角果、花蕾和花中均有表达,其中在根中的表达量最高;经霜霉菌和灰葡萄孢菌侵染后,该基因表达量均有不同程度的增加,其中在霜霉菌侵染下,表达量在24h后开始增加,72h时下降,而在灰葡萄孢菌侵染下,6h时的表达量最大,12h时开始缓慢下降。聚类结果表明,BoCCCH2与其他十字花科植物的同源序列聚为一类,支持率达100%,而与豆科、大戟科和蔷薇科等植物的序列处于不同分支。对BoCCCH2基因的克隆和表达分析为该基因功能研究奠定了基础。     

青花菜BoBURP2基因的克隆与表达分析

BURP是植物特有蛋白,在生长发育和抗逆反应中起着重要作用。本研究以青花菜为材料,利用PCR克隆到1个BURP基因,命名为BoBURP2。测序结果表明,BoBURP2的基因组DNA全长为1 218bp,具1个内含子,编码区全长为840bp,编码279个氨基酸;序列比对结果表明,该基因与BURP家族成员RD22具有较高的同源性。系统发育分析结果表明,BoBURP2与甘蓝、芜菁和甘蓝型油菜的同源序列相似性最高,在发育树上聚为一组,与醉蝶花的相似性最低,亲缘关系最远。RT-PCR结果表明,BoBURP2的表达受NaCl和干旱胁迫的诱导,表达量分别在24h和48h时达到最大值,暗示该基因与这2种逆境响应相关。青花菜BoBURP2的克隆与表达分析,为后续基因功能的鉴定和抗逆分子育种奠定了基础。     

青花菜查尔酮合成酶基因BoCHS的克隆、表达及序列分析

根据NCBI数据库中发布的查尔酮合成酶基因序列设计PCR简并引物,以青花菜(Brassica oler-acea var.italica)子叶cDNA为材料,克隆到了青花菜查尔酮合成酶基因,基因命名为BoCHS,序列已提交到NCBI数据库,登录号为GU266209。该基因的编码区全长为1182bp,编码393个氨基酸。序列比对结果表明,BoCHS基因编码的氨基酸序列与其他十字花科植物之间的同源性很高,仅存在个别氨基酸残基的差别。RT-PCR检测表明,经霜霉病菌(Hyaloperonospora parasitica)侵染后,子叶中BoCHS的表达量增加,其中以72h和96h的表达量最大。     

青花菜病程相关蛋白基因 BoPR2 的克隆与表达

病程相关蛋白基因以家族形式存在于植物中,在抗病反应中起着重要作用。以青花菜为试材,利用PCR法克隆到1个PR2基因,定名为BoPR2。测序结果表明,BoPR2基因组全长1188bp,具1个内含子,编码区全长1092bp,编码351个氨基酸;序列比对和系统发育分析结果显示,BoPR2与野甘蓝、甘蓝型油菜和白菜PR2的相似度最高,在发育树上聚为一组,与亚麻荠、荠菜的相似度最低,亲缘关系最远;实时定量PCR结果表明,BoPR2的表达受芸薹根肿菌诱导,在10d时的相对表达量最大,约为对照的6倍;但BoPR2的表达不受核盘菌的诱导。BoPR2基因的克隆与表达分析,为青花菜抗病机理研究及开展分子育种奠定了基础。     

多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因的克隆及分析

以盐胁迫处理的多枝赖草(Leymus multicaulis)植株新鲜叶片为材料,根据其他植物谷胱甘肽还原酶(GR)氨基酸保守区序列设计简并引物,通过RT—PCR扩增到1个408 bp的cDNA片段(Genbank注册号为 AY781786);利用DNAMAN软件将5’和3’RACE获得的5’和3’端序列,拼接成1个全长1 580 bp的cDNA序列,其包含1个1 140 bp的开放阅读框架,该阅读框架编码380个氨基酸;多枝赖草谷胱甘肽还原酶氨基酸序列与其他植物的同源性为77％～92％,定量PCR结果表明,GR基因的表达随着盐胁迫时间和盐浓度的增加而加强。     

青花菜SKIP基因的克隆与表达分析

SKIP(SKI-interacting protein)在植物的生长、发育和逆境响应中起着重要作用。以青花菜为材料,在克隆SKIP基因的基础上,利用生物信息学方法进行序列分析,并通过实时荧光定量PCR研究其在生物(寄生霜霉菌、野油菜黄单胞菌)、非生物(NaCl、PEG6000)胁迫下的表达模式。结果表明,青花菜SKIP基因全长为1 836 bp,没有内含子;BoiSKIP编码611个氨基酸,具1个SNW/SKI结构域,位于推导蛋白质序列的188-347处;该蛋白质的分子量为69.22 ku,理论等电点为9.15,平均亲水性指数为-1.12,为亲水性蛋白质。系统发育分析结果表明,芸薹属植物的SKIP聚为一组,支持率达100%,BoiSKIP与甘蓝SKIP的关系最近,它们处于同一分支。基因表达分析结果表明,BoiSKIP的表达受NaCl和PEG6000的诱导,表达量分别在诱导24、12 h达到最大;BoiSKIP受寄生霜霉菌和野油菜黄单胞菌的诱导,分别在处理24 h和72 h达到最大值。青花菜SKIP基因的克隆与表达分析,为后续开展该基因在抗逆反应中的功能研究奠定了基础。     

黄瓜基因组中抗霜霉病候选基因的生物信息学及其表达特异性

【目的】寻找黄瓜抗霜霉病基因,研究黄瓜抗霜霉病机制。【方法】利用拟南芥和甜瓜抗霜霉病蛋白质序列,搜索黄瓜基因组数据库;通过生物信息学分析候选基因特征,以黄瓜抗霜霉病自交系M801-3-1为试材,分析候选基因在叶片组织中的表达状态。【结果】共获得187个黄瓜抗霜霉病候选基因;确定了候选基因染色体位置和排列特点、序列相似性特征以及系统进化关系;大部分黄瓜R基因在未接种霜霉病菌的抗病自交系和感病叶片组织中都有一定的表达量,在接种霜霉病菌后在抗病自交系M801-3-1中Csa001907和Csa002921表达量下调,感病自交系M302-3 中Csa001907和Csa002921变化不明显。【结论】在黄瓜基因组中存在185个与拟南芥抗霜霉病基因同源的R基因,2个与甜瓜的抗霜霉病基因At1和At2同源的eR基因,通过聚类分析这些基因可以分为6类,初步认定Csa001907和Csa002921为黄瓜抗霜霉病的R基因,这2个基因在叶片组织中有一定表达量,其表达量减少可诱发抗病黄瓜品种的抗病反应。     

黄瓜霜霉病和白粉病病原菌的rDNA-ITS序列分析

为了应用分子特征确定黄瓜霜霉病和白粉病的病原菌种类,扩增、测定了上海地区黄瓜霜霉病菌和白粉病菌的核糖体DNA内转录间隔区(rDNA-ITS)序列,依据rDNA-ITS序列特征分析了两种病原菌种类,以及与近缘种的差异性。结果显示,黄瓜霜霉病菌的rDNA-ITS1和rDNA-ITS2长度分别为141和406 bp,rDNA-ITS1 GC含量为41.13%,rDNA-ITS2 GC含量为46.80%(闵行区株和金山区株)或46.55%(浦东新区株),rDNA-ITS序列在种内保守性很高,种间差异性与亲缘关系呈正相关,分子特征证实研究的黄瓜霜霉病病原菌为古巴拟霜霉菌;黄瓜白粉病菌的rDNA-ITS1和rDNA-ITS2长度分别为136和89 bp,GC含量分别为59.56%和66.29%,rDNA-ITS序列在研究材料中保守,与瓜类单囊壳(Sphaerotheca cucurbitae)完全相同,但与形态鉴别的结果Sphaerotheca fuliginea差异高达4.5%,提示黄瓜白粉病病原菌的种类需进一步澄清和确定。     

基于BSA-Seq技术的甜瓜抗霜霉病InDel标记开发

目的 获得与甜瓜抗霜霉病基因连锁的分子标记或功能标记,用于甜瓜分子标记辅助选择育种。为进一步克隆甜瓜抗霜霉病主效基因奠定基础。方法 以野生高抗霜霉病资源DM-4和感病自交系DM-2为亲本,构建F₂代分离群体,利用BSA-seq对甜瓜抗霜霉基因进行QTL定位,开发InDel分子标记,并在双亲及其F₂群体单株进行筛选验证。结果 甜瓜抗霜霉病主效QTL位于第9号染色体。在候选区间开发了37个InDel分子标记,有9个PCR产物大小在抗、感双亲表现出差异,用F₂单株验证,结合田间表型鉴定结果,引物InDel 15和InDel 20准确率分别为95 %和98 %,引物InDel 15和InDel 20在抗病亲本中扩增产物大小分别为251和349 bp,在感病亲本中分别为231和324 bp。结论 引物InDel 15和InDel 20可以作为分子标记进行抗霜霉病辅助选育,加快了甜瓜抗霜霉病育种速度。     

中国野生华东葡萄抗霜霉病抑制消减文库构建及初步分析

 【目的】分离和获得中国野生华东葡萄抗霜霉病相关基因片段的EST序列。【方法】以高抗霜霉病的中国野生华东葡萄（V.pseudoreticulata）白河-35-1 株系为材料,以田间接种葡萄霜霉菌的幼嫩叶片为处理,以田间自然生长的未接种幼嫩叶片为对照,分别提取RNA,采用抑制消减杂交技术构建抗霜霉病基因的消减正交和反交两个文库,在文库中,选择3个EST序列,用半定量PT-PCR检验构建文库中EST片段的表达情况。【结果】构建的文库中EST片段的大小在150～900 bp,经筛选文库,得到正交库有效的ESTs 85条,反交库ESTs 29条,所获序列经过BLASTn和BLASTx网上序列比对,其中有78条ESTs与GenBank中其它植物相关基因序列有较高的同源性,31条为未知功能序列,已登录GenBank 114条ESTs,登录号:FG106789-FG106902。进一步利用半定量RT-PCR 对文库中3个基因的表达情况进行了分析,证明这些EST序列是可以表达的。【结论】经初步分析这些序列的功能,涉及抗病信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、光合作用及膜运输和代谢等方面,其中获得与抗病直接相关的ESTs 23条,下一步是通过对获得的EST序列进行末端快速分析（RACE）技术,获得抗霜霉病基因全长序列,并进行原核和真核表达研究验证基因全长序列功能,为研究葡萄抗霜霉病的基因提供依据。     

rDNA-ITS sequence analysis of pathogens of cucumber downy mildew and cucumber powdery mildew

To determine the pathogens of cucumber downy mildew and cucumber powdery mildew by molecular marker, we amplified and sequenced the rDNA-ITS region of the pathogens of cucumber downy mildew and cucumber powdery mildew collected from the Shanghai region. The intra-/interspecific sequence difference was analyzed by rDNA-ITS sequence. The results show that the length of rDNA-ITS1 and rDNA-ITS2 of cucumber downy mildew’s pathogen was 141 bp and 406 bp, respectively, with GC contents of 41.13% in ITS1 and 46.8% (Minhang and Jinshan District, sm1 and sm2) or 46.55% (Pudong District, sm3) in ITS2. The rDNA-ITS sequence was intraspecific conservation. The interspecific difference was related with their kin relationship. The pathogen of cucumber downy mildew was identified as Pseudoperonospora cubensis by molecular marker. The length of rDNA-ITS1 and rDNA-ITS2 of cucumber powdery mildew’s pathogen was 136 bp and 89 bp, respectively, with GC contents being 59.56% and 66.29%, and rDNA-ITS sequence being highly conservative in this study that was the same as Sphaerotheca cucurbitae. But the sequence difference between the strains in the Shanghai region in this study with S. fuliginea was 4.5%, which was identified by morphology. It is suggested that the pathogen of cucumber powdery mildew should be further clarified and determined. __________ Translated from Journal of Northwest A & F University (Nat. Sci. Ed.), 2007, 35(10): 155–158 [译自: 西北农林科技大学学报(自然科学版)]     

黄瓜霜霉病菌侵染对黄瓜叶片生理生化指标的影响

为了解黄瓜霜霉病菌侵染后对黄瓜生理指标的影响。采用蒽酮比色法、考马斯亮蓝法、磷钼酸-磷钨酸比色法、索氏回流法及丙酮法,分别测定黄瓜霜霉病不同为害程度的黄瓜叶片可溶性糖、可溶性蛋白质、单宁、黄酮及叶绿素质量分数的影响。结果表明:黄瓜霜霉病为害后,各处理黄瓜叶片中可溶性糖、单宁和黄酮的质量分数随着为害程度的增强而显著升高(P0.05),最高升幅分别为158%、130%和52.33%;可溶性蛋白质只有轻度为害叶片与健康对照存在显著差异(P0.05),升幅11.46%;叶绿素质量分数随着为害程度的增强而显著降低(P0.05),最大降幅62.24%。可见,黄瓜在霜霉病菌侵染侵染后可产生诱导抗性。     

Q型烟粉虱化学感受蛋白基因BtabCSP1的克隆与分析

【目的】克隆Q型烟粉虱（Bemisia tabaci）化学感受蛋白基因,分析其序列特征和表达特性,为深入研究该类基因功能奠定基础。【方法】根据桃蚜化学感受蛋白OS-D2a（ABM5558）的氨基酸序列,借助生物信息学搜索烟粉虱EST序列拼接了1个烟粉虱化学感受蛋白基因（BtabCSP1）,以烟粉虱mRNA为模板,采用RT-PCR扩增克隆烟粉虱化学感受蛋白cDNA。采用半定量RT-PCR对不同发育阶段的烟粉虱样品中BtabCSP1的表达模式进行研究。【结果】BtabCSP1完整阅读框全长为2 626 bp,包含2个外显子和1个内含子,编码131个氨基酸残基,其中含有1个CX6CX18CX2结构域,为化学感受蛋白的典型特征。BtabCSP1在供试样品中均有表达,并且在2龄、3龄和伪蛹阶段表达量更高。聚类分析结果表明,烟粉虱与果蝇、桃蚜等物种遗传关系较远,化学感受蛋白基因在物种进化过程中较为活跃。【结论】从Q型烟粉虱若虫中克隆了1个化学感受蛋白基因 BtabCSP1,该基因在烟粉虱不同发育阶段中均能表达,推测其对烟粉虱的生长发育具有重要的调控作用。     

葡萄MrRPV1蛋白LRR结构域的功能研究

[目的]明确葡萄霜霉病抗性蛋白(MrRPV1)LRR结构域对葡萄霜霉菌特异性识别的影响,为进一步研究葡萄与霜霉菌间的互作机理打下基础.[方法]将MrRPV1和白粉病抗性蛋白(MrRUN1)两个蛋白的LRR结构域互换,构建重组表达载体后转化至感霜霉病和白粉病的欧亚种西拉葡萄胚性愈伤组织中以获得转基因植株,并通过DNA、RNA分子水平检测和室内接种试验进行抗病性鉴定.[结果]共获得7个RGA10-8LRR阳性转基因(重组了MrRPV1蛋白LRR结构域)株系和6个RGA8-10LRR阳性转基因(重组了MrRUN蛋白LRR结构域)株系.在7个RGA10-8LRR阳性转基因株系中,仅RGA10-8-13阳性植株表现出与MrRPV1转基因苗S8-1一致的坏死斑点,肉眼观察不到白色霜霉状物,但7个阳性转基因系均未表现出明显的白粉病抗性.在6个RGA8-10LRR阳性转基因株系中,RGA8-10-3和RGA8-10-28两个株系表现出对白粉病的抗性,有35%左右的细胞表现出细胞程序性坏死(PCD);RGA8-10LRR转基因苗均不抗霜霉病.[结论]MrRPV1的LRR结构域可能介导对葡萄霜霉菌的特异性识别,而MrRUN1的LRR结构域可能介导对白粉病菌的特异性识别.     

贵州独山县水稻霜霉病的发生及鉴定方法

对贵州独山县感病水稻病害症状观察表明,受害水稻植株矮化,比健壮植株矮1/3～1/2左右,受害株心叶褪绿呈淡黄色或黄白色且严重扭曲畸形.采用组织整体透明法和荧光染色法对感病植株观察鉴定,观察到病组织内有大量孢子囊,根据病害症状特征,病原菌孢子囊特征,可确定此水稻病害为霜霉病.气候条件与育秧方式是水稻霜霉病发病与传播的关键因素.在防治过程中应该把农业防治放在首位,同时辅以必要的药剂防治.