小鼠原始生殖细胞迁移过程中H2A.Z的表达

小鼠原始生殖细胞(PGCs)迁移、增殖、性别分化都受着基因组和DNA表观遗传修饰的调控,H2A.Z与转录激活有关,可能与表观遗传修饰存在联系,通过PGCs单细胞及组织石蜡切片的免疫荧光方法进行研究。结果表明,PGCs在迁移过程中,8.5 dpc时PGCs中不存在H2A.Z;迁移至生殖嵴时H2A.Z主要集中于细胞核,11.5dpc整个PGCs细胞核和细胞质都存在;13.5 dpc雌性的卵母细胞中H2A.Z主要集中于细胞质,而精原细胞中H2A.Z偏向集中于细胞核。综合基因组和DNA表观遗传修饰分析,H2A.Z的表达与其有密不可分的联系。     

H2A变体在小鼠不同时期雄性生殖细胞核质区的分布

【目的】了解小鼠雄性生殖细胞中macro H2A、H2A.Z和H2A.X 3种组蛋白变体变化与其发育特征间的联系,为揭示原始生殖细胞（PGCs）的发育机理及其分子调控机制奠定基础。【方法】以C57BL/6J小鼠胚胎的中肾和生殖嵴为试验材料,通过免疫荧光染色技术检测11.5dpc、12.5dpc和13.5dpc不同发育时期含有PGCs的组织石蜡切片及单细胞中macro H2A、H2A.X和H2A.Z变体的分布情况。【结果】macro H2A变体在11.5dpc胚胎时主要存在于细胞质中,12.5dpc时在细胞质中的表达增强,但进入生殖嵴后（13.5dpc）表达消失;H2A.X变体在11.5dpc和12.5dpc时存在于PGCs的核质区,13.5dpc时主要存于细胞质,且呈聚集分布;H2A.Z变体在11.5dpc时在PGCs的核质区均有存在,12.5dpc和13.5dpc时主要分布在细胞核,且表达明显增强。【结论】随着PGCs的不断迁移、增殖与分化,macro H2A、H2A.X和H2A.Z 3种组蛋白H2A变体在细胞核质区的分布及表达情况也发生变化,即H2A变体分布特征与PGCs的性别分化及其有丝分裂停止相关。     

小鼠原始生殖细胞迁移过程中H2A.Z的表达

小鼠原始生殖细胞(PGCs)迁移、增殖、性别分化都受着基因组和DNA表观遗传修饰的调控,H2A.Z与转录激活有关,可能与表观遗传修饰存在联系,通过PGCs单细胞及组织石蜡切片的免疫荧光方法进行研究。结果表明,PGCs在迁移过程中,8.5 dpc时PGCs中不存在H2A.Z;迁移至生殖嵴时H2A.Z主要集中于细胞核,11.5dpc整个PGCs细胞核和细胞质都存在;13.5 dpc雌性的卵母细胞中H2A.Z主要集中于细胞质,而精原细胞中H2A.Z偏向集中于细胞核。综合基因组和DNA表观遗传修饰分析,H2A.Z的表达与其有密不可分的联系。     

小鼠原始生殖细胞迁移过程中macroH2A的表达

通过单细胞及组织石蜡切片的免疫荧光方法,探讨了小鼠原始生殖细胞(PGCs)性别分化与macroH2A的关系.结果表明:PGCs在迁移过程中,macroH2A在细胞核中的表达越来越弱,而在细胞质中的表达越来越强;到达生殖嵴性别分化结束后,雄性PGCs中macroH2A在细胞核和细胞质中基本不表达,而在雌性PGCs细胞质中发现macroH2A大量表达.据此推断,macroH2A可能与后期的DNA印记快速擦除及性别分化后细胞分裂相关.     

自原始生殖细胞分离克隆小鼠ES细胞研究初报

自交配后9．5－13．5d小鼠胎儿生殖峭／腺或其类似物及周围组织，采用与其同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆到具小鼠ES细胞诸多特征的胚胎生殖细胞（EG细胞）系。即具有连续传代的能力（1例来自交配后11．5d胎儿类ES细胞传至10代），部分细胞集落呈典型鸟巢状结构，AP染色呈阳性，体外分化或延迟传代、堆叠培养具有分化形成类胚体、上皮细胞、成纤维细胞或神经细胞等的能力。同样培养交配后7．5－8．5d和14．5－15．5d的小鼠胎儿，原代观察到类ES细胞集落，继代培养未观察到类ES细胞集落，16．5－18．5d小鼠胎儿原代培养未观察到ES样细胞集落。     

昆明小鼠原始生殖细胞无血清培养基的筛选

【目的】筛选体外培养昆明小鼠原始生殖细胞(PGCs)的最佳无血清培养基,为昆明小鼠胚胎生殖细胞(EGCs)建系奠定基础。【方法】以妊娠8.5~12.5 d昆明小鼠PGCs为材料,采用无血清培养基,在培养基中添加不同组分,组成A、B、C、D、E、F、G 7种培养基,对昆明小鼠PGCs进行体外培养,分离培养胚胎原始生殖细胞,以筛选出其最佳培养基。【结果】D、E、F组均能得到较多的小鼠PGCs阳性集落。MEF-CM和GR-CM组的效果与细胞因子组相比差异不显著,但降低了培养基的成本。【结论】在无血清培养基中添加0.1 mmol/L RA或使用条件培养基MEF-CM和GR-CM,均有利于小鼠PGCs增殖。经过EGCs鉴定,本试验得到的细胞是PGCs,并且在各组培养基中均能够形成EGCs集落。     

自原始生殖细胞分离克隆小鼠ES细胞研究初报

自交配后 9.5～ 13.5 d小鼠胎儿生殖嵴 /腺或其类似物及周围组织 ,采用与其同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆到具小鼠 ES细胞诸多特征的胚胎生殖细胞 ( EG细胞 )系。即具有连续传代的能力 ( 1例来自交配后 11.5 d胎儿类 ES细胞传至 10代 ) ,部分细胞集落呈典型鸟巢状结构 ,AP染色呈阳性 ,体外分化或延迟传代、堆叠培养具有分化形成类胚体、上皮细胞、成纤维细胞或神经细胞等的能力。同样培养交配后 7.5～ 8.5 d和14.5～ 15 .5 d的小鼠胎儿 ,原代观察到类 ES细胞集落 ,继代培养未观察到类 ES细胞集落 ,16 .5～ 18.5 d小鼠胎儿原代培养未观察到 ES样细胞集落     

不同培养系统和传代方法对昆明白小鼠原始生殖细胞分离培养的影响

[目的]寻求适合昆明白小鼠EG细胞的培养系统和传代方法。[方法]常规方法从昆明白小鼠原始生殖细胞中分离EG细胞,用不同培养系统(EG细胞基础培养液,RH-CM,EG细胞基础培养液+MEF)及不同传代方法(机械法,酶消化法,连同饲养层消化法),研究对昆明白小鼠EG细胞分离克隆的影响。[结果]以RH-CM作为培养基效果最好,RH-CM能够更好地促进EG细胞贴壁增殖和集落的形成,有效地维持EG细胞未分化状态;酶消化法和连同饲养层消化法均能获得较高的克隆形成率。[结论]RH-CM和连同饲养层消化法可分别作为昆明白小鼠EG细胞的培养系统和传代方法。     

不同饲养层对兔原始生殖细胞传代培养的影响

为了探讨不同饲养层细胞对兔原始生殖细胞体外培养与传代的影响,从14~18 d的兔胎儿生殖嵴中分离得到原始生殖细胞(PGCs),分别培养在小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、兔胎儿成纤维细胞(REF)饲养层上或与同源兔胎儿生殖脊成纤维细胞(HEFgr)、兔睾丸支持细胞(RSC)共培养。观察兔类EG集落的生长状态,并检测其碱性磷酸酶活性。结果表明:4种方法均能分离克隆出兔类EG集落,碱性磷酸酶染色均呈阳性,但是采用共培养的模式分离得到的集落明显多于传统的饲养层模式。与RSCs共培养得到的EG集落数最多,保持未分化的时间最长,并传了8代,与HEFgr共培养得到的EG集落数与RSCs相比差异不明显,但最高只传了6代。培养在MEF上的兔类EG也能较好的保持未分化状态,传了4代。培养在REF上的兔类EG集落数目较少,出现分化时间较早,只传了3代。因此可以用与RSCs或HEFgr共培养的方法传代培养兔PGCs。     

P2X2阳性感觉神经末梢在小鼠食管的分布

本文采用免疫荧光组织化学双标方法结合激光共聚焦显微镜技术研究了伤害性受体P2X2阳性感觉纤维末梢在小鼠食管内的分布及与降钙素基因相关肽（CGRP）阳性纤维的关系。结果表明：在食管各水平均可见到P2X2阳性感觉纤维末梢。P2X2阳性纤维集中分布于食管的内、外肌层之间,部分或全部的覆盖在肌间神经节的表面。一些串珠样的纤维深入到肌间神经节内,相互缠绕在一起形成许多结构复杂、形状各异的神经节内板状末稍（IGLEs）。荧光双标显示许多CGRP阳性纤维围绕在P2X2阳性IGLEs周围,没有见到P2X2和CGRP在同一纤维的共存。结状神经节内可见许多中小型神经元表达P2X2,P2X2/CGRP双标神经元稀少,而背根神经节内可见较多的P2X2阳性细胞含有CGRP。由此可见,小鼠食管内部分感觉神经末梢表达伤害性受体P2X2,并形成IGLEs样末梢结构。     

H2A变体在卵原细胞及其前体细胞核质区的分布

小鼠卵原细胞发育之前经历细胞的迁移、大量繁殖和性别分化,为了进一步了解分子调控机制,通过组织石蜡切片免疫荧光染色和单细胞免疫荧光染色技术,对配种时间为11.5d、12.5d和13.5d卵原细胞及其前体细胞,组蛋白H2A变体MacroH2A、H2A.Z、H2A.X的分布情况进行研究。结果表明,配种时间为12.5d细胞中3种组蛋白H2A变体荧光强度减弱,macroH2A在配种时间为11.5d、12.5d细胞质表达,有少量的沉积,13.5d细胞质中macroH2A沉积明显增多。H2A.X在配种时间为11.5d、12.5d细胞核和细胞质中弥散分布,13.5d主要集中于细胞核。H2A.Z在配种时间为11.5d整个细胞核和细胞质都有表达,12.5dH2A.Z在细胞质内表达减弱,细胞核出现部分沉积,13.5d细胞中H2A.Z主要集中分布于细胞质。组蛋白H2A变体的分布特征,可能与细胞的性别分化及细胞的减数分裂相关。     

表达H3N2亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒对小鼠免疫原性的研究

【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,将其亚克隆入质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有H3HA及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP。利用脂质体转染方法将穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP。将重组病毒rAd-H3HA-EGFP以108TCID50两次接种6周龄的Balb/c小鼠,时间间隔为3周,通过检测免疫小鼠的抗体水平及对病毒攻击的保护情况评价该重组病毒的免疫原性。【结果】HA基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物性活性。重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.58×1010.mL-1,以108TCID50的剂量免疫小鼠后,能够诱导产生高水平的特异性抗体,并对H3亚型SIV的攻击提供有效保护。【结论】构建了一株具有良好免疫原性的复制缺陷型重组腺病毒,为H3亚型SI活载体疫苗的研制奠定了基础。     

实验小鼠肠道鞭毛虫研究Ⅰ昆明神小鼠肠道鞭毛虫区系分布、自然感染状况

作者对７０只开放系统内饲养的不同年龄、性别昆明种小鼠作了肠道鞭毛虫区系分布、自然感染状况的观察，共检出８种肠道鞭毛虫．其感染率和肠道分布如下：鼠唇鞭毛虫感染率为８０．００％，多见于盲肠、小肠后端；鼠贾第虫感染率为５１．４３％，多见于小肠前端；鼠六鞭毛虫为６８．５７％，多见于小肠前端；鼠八鞭毛虫为７８．５７％，多见于盲肠；人五毛滴虫为８８．５７％，多见于盲肠、结肠；田鼠四毛滴虫为８２．８６％，多见于盲肠；微小三毛滴虫为４７．１４％，多见于盲肠、结肠；鼠三毛滴虫为９１．４３％，多见于盲肠、结肠及小肠后端。被检７０只小鼠均有肠道鞭毛虫感染，其中感染７种肠道鞭毛虫的有９只，占被检总数的１２．８６％，８种全部感染的有６１只，占被检总数的８７．１４％．     

不同时期施入的氮肥在橡胶园土壤中的迁移分布

为了研究不同时期施入的氮肥在橡胶园土壤中的迁移分布规律和淋溶损失情况,采用施入15N标记氮肥的方法进行田间试验,分析了不同层次土壤中的全氮量、碱解氮含量和肥料氮素残留。结果表明:早、中期施入的氮肥淋溶作用较强,达到100 cm土层以下,后期施入的氮肥在土壤浅层的积累作用明显,在60 cm土层以下的淋溶较少。说明不同时期施入的氮肥在橡胶园土壤中的淋溶迁移特点明显,在生产中可以结合缓控释化肥施用以及调控不同时期施肥比例等措施合理避免肥料氮肥的损失。     

microRNA-34c在不同发育时期雄性小鼠脑组织中的表达分析

【目的】研究microRNA-34c(简称miR-34c)在出生后不同发育时期小鼠嗅球、大脑皮质、小脑皮质及海马中的表达情况,并分析其与小鼠行为活动之间的相关性。【方法】以出生后0,3,7,14,21,28,60和90d的雄性昆明小白鼠为试验动物,以5SrRNA为内参基因,运用荧光实时定量PCR技术,检测miR-34c在小鼠出生后8个不同发育时期嗅球、大脑皮质、小脑皮质和海马中的相对表达量以及在成年鼠脑组织中4个不同部位的相对表达量。【结果】随着小鼠的发育,miR-34c在嗅球、大脑皮质、小脑皮质及海马中的相对表达量均呈现不同程度的递增趋势。在成年鼠中,miR-34c在嗅球、大脑皮质、小脑皮质、海马中的相对表达量差异显著,其中海马中最高,小脑皮质次之,嗅球最低。【结论】miR-34c在出生后不同发育时期小鼠嗅球、大脑皮质、小脑皮质及海马中的表达趋势,与小鼠各种行为活动的出现具有一定的相关性。     

进入生殖嵴前PGCs中H2A变体的分布

小鼠原始生殖细胞进入生殖嵴之前经历细胞迁移、大量繁殖。为进一步解分子调控机制,文章通过组织石蜡切片免疫荧光染色和单细胞免疫荧光染色技术,对8.5、10.5 dpcPGCs中组蛋白H2A变体MacroH2A、H2A.Z、H2A. X的分布情况进行研究。结果表明,8.5~10.5 dpc,H2A.Z在PGCs中的表达明显递增,10.5 dpc PGCs中H2A.Z的表达主要集中于细胞核;而MacroH2A和H2A.X在此过程中无明显变化,在细胞质和细胞核中弱表达。综合分析发现,8.5~10.5 dpc PGCs中H2A.Z可能是装配核小体的主要变体,PGCs大量繁殖可能有H2A.Z的参与。     

妊娠、泌乳不同时期小鼠催乳素释放肽mRNA在甲状腺中的表达

为了研究妊娠、泌乳不同时期PrRP mRNA在甲状腺中的表达水平,取36只小鼠,分为妊娠早(6 d)、中(12 d)、晚期(18 d)和泌乳早(6 d)、中(12 d)、晚期(18 d)6组,每组6只,以GAPDH作为内对照探究小鼠甲状腺中PrRP mRNA的相对含量。结果表明,妊娠期和泌乳期PrRP mRNA在甲状腺中的表达均呈现先升高再降低的趋势;妊娠和泌乳的不同时期PrRPmRNA的表达水平不同,对催乳素的释放调节水平不同,PrRP mRNA可能通过调节催乳素的释放来影响泌乳量。     

荧光定量PCR检测基因枪轰击免疫小鹅瘟病毒VP3基因疫苗在小鼠体内的动态分布

开展了检测小鹅瘟病毒(GPV)VP3基因的荧光定量PCR(FQ-PCR)的建立和基因枪轰击不同剂量(6μg/只、3μg/只和1μg/只)GPV-VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)在BALB/c小鼠各组织器官(心、肝、脾、肺、肾、脑、肠和免疫部位皮肤)分布规律的研究。结果表明:①建立的FQ-PCR特异性强、灵敏度高、重复性好,核酸模板数与FQ-PCR测定的Ct值具有很好的直线相关性(相关系数达到0.999);②pcDNA-GPV-VP3在各剂量免疫小鼠1h即可在各组织中被检测到,其中在免疫部位皮肤含量最高,在心与肺中含量也较高,在脑中含量最低;③pcDNA-GPV-VP3在组织器官里的含量于3h开始下降,31wk仍能在3个剂量免疫组小鼠的各个组织器官中检测到,但多数组织器官中的含量比1h时约少了102,免疫部位皮肤减少了103;④不同剂量免疫组各组织器官中pcDNA-GPV-VP3含量6μg/只组>3μg/只组>1μg/只组,但剂量组之间的差异并不显著(P>0.05)。研究表明:FQ-PCR是定量检测pcDNA-GPV-VP3在免疫小鼠各组织器官含量的可靠实验手段,pcDNA-GPV-VP3免疫小鼠后1h时可分布至小鼠体内各组织器官中并持续存在31wk以上。     

桔梗石油醚提取物对酒石酸泰乐菌素在小鼠体内的药代动力学及组织分布的影响

以酒石酸泰乐菌素为靶标药物,探究药物中加入桔梗石油醚提取物对小鼠血浆中的药代动力学特征及组织分布的影响。采用高效液相色谱法测定不同时间点小鼠血浆及心脏、肝、肺、肾中酒石酸泰乐菌素的浓度,运用PKsolver程序及SPSS19.0统计软件处理数据,用非房室模型分析药代动力学参数。结果表明:酒石酸泰乐菌素的血–药时曲线呈现多峰;与对照组(药物未加桔梗石油醚提取物)相比,桔梗石油醚提取物组(桔梗组)消除半衰期和达峰时间均变短,达峰浓度降低;药时曲线下面积减少,而表观分布容积增加;平均滞留时间缩短,而药物清除率增大;组织分布图显示,与对照组相比,桔梗石油醚组小鼠心脏中的药物浓度明显比肺、肝、肾中药物浓度高,说明桔梗石油醚提取物改变了酒石酸泰乐菌素在小鼠体内的组织分布。综合分析,桔梗石油醚提取物对酒石酸泰乐菌素在小鼠体内的药代动力学特征有较大影响,表现为加快了药物的吸收速度,但减轻了吸收程度;使药物在体内分布更广泛,却加快了其在体内的消除速度。     

组蛋白macroH2A在G_1/S和M期的分布差异

组蛋白macro H2A(m H2A)具有独特的结构和丰富的亚型,不但具有转录活化和抑制功能,还作用于细胞增殖和肿瘤发生等过程。采用同步化培养的NIH/3T3细胞,分别提取G1/S和M期的组蛋白H2A及m H2A,通过免疫荧光和Western blot从定性和定量2方面分析m H2A的分布情况。结果显示,在总含量保持不变的情况下,m H2A在G1/S和M期的分布有显著差异,从G1/S期进入M期,m H2A在染色体上的分布出现约30%的增长。结果表明,m H2A在细胞周期内的分布有显著差异,很可能与转录激活有关。