猪细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及抗原捕捉ELISA方法的建立

为制备猪细小病毒VP2蛋白单克隆抗体(McAb),建立检测猪细小病毒的抗原捕捉ELISA方法 (AC-ELISA),本研究以原核表达的重组VP2蛋白作为免疫原,免疫6周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA方法筛选,成功获得了2株能稳定分泌抗猪细小病毒VP2蛋白的McAb,命名为3C4、5F8。以多克隆抗体作为捕获抗体、单克隆抗体5F8作为检测抗体,通过双抗夹心ELISA各个反应条件的优化,建立检测猪细小病毒抗原捕捉ELISA方法。该方法与日本乙脑病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)均不发生交叉反应;与RT-PCR相比较,符合率、敏感性和特异性分别为93.6%、90.9%、94.4%。本研究建立的猪细小病毒AC-ELISA有良好的重复性、敏感性和特异性,可应用于猪细小病毒感染的早期诊断。     

抗酵母表达犬细小病毒蛋白VP2的单克隆抗体的制备和鉴定

以纯化的酵母重组表达的犬细小病毒VP2单位免疫BALB／C小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,通过ELISA方法筛选,获得4株能稳定分泌抗犬细小病毒CPV结构蛋白VP2的单克隆抗体杂交瘤细胞株。4株单克隆抗体中,2株属于IgG2b亚类,2株属于IgG1亚类,其腹水效价可达到1：51200和1：204800,细胞培养上清液效价可达1：256、1：512。ELISA分析表明,这些单抗仅与CPV及其VP2发生特异性反应,而与CDV和CAV-1及CAV-2没有交叉反应;荧光免疫染色病毒检测进一步表明单克隆抗体的特异性效果好。这些特异性单抗的制备为建立有效的检测犬细小病毒感染奠定了基础。     

小鼠抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备

采用杂交瘤技术,用纯化的鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV) VP3蛋白免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体(mAb),经间接ELISA方法筛选和有限稀释法进行3次亚克隆后获得一株抗鹅细小病毒VP3蛋白杂交瘤细胞株(4E5).经鉴定,该mAb为IgGl亚型,轻链为κ链.Western blot试验结果表...     

猪细小病毒结构蛋白VP2研究进展

猪细小病毒(PPV)是引起猪繁殖障碍性疾病的重要病原之一,目前该病在世界很多国家均有流行和报道,给养猪业带来巨大损失。传统的灭活苗和弱毒苗又都存在各自的缺陷,新型诊断试剂及疫苗的研究迫在眉睫。VP2蛋白是病毒粒子的主要衣壳蛋白,具有在体外能自我装配成类病毒粒子,并能刺激机体产生抗PPV中和抗体,可作为抗原转运载体等特性,故VP2蛋白在猪细小病毒诊断试剂及新型疫苗研究领域具有很大的潜力。论文就VP2的分子生物学及其在该病诊断与预防等方面的研究进展进行了综述。     

猪细小病毒结构蛋白VP2及其疫苗的研究进展

猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍性疾病的主要病原之一,该病毒在世界范围内广泛存在并呈地方性流行, 给生猪的繁殖、发展带来了巨大的经济损失,故防制猪细小病毒病非常重要。PPV VP2蛋白是病毒粒子的主要衣壳蛋白,在体外能自我装配成病毒样颗粒,并能刺激机体产生抗PPV中和抗体,且可作为抗原转运载体,所以研究VP2对PPV新型疫苗研制至关重要。文章综述了猪细小病毒结构蛋白VP2及其疫苗的研究进展。     

猪细小病毒VP2基因及其编码蛋白研究进展

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起猪繁殖障碍的重要病原之一，主要引起初产母猪不孕、流产、木乃伊胎、死产，而母猪本身并不表现临床症状，其他猪感染后也无明显的临床症状。PPV最先由Mary和Mahnet于猪瘟病毒组织培养时发现。从60年代中期，许多国家相继分离到该病毒并逐步明确其致病作用。我国于1982年由中国兽药监察     

鹅细小病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为制备鹅细小病毒（goose parvovirus,GPV）单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）,利用浓缩的GPV免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术,经间接ELISA方法筛选和有限稀释法克隆后获得一株抗GPV单克隆抗体杂交瘤细胞株4B4。经鉴定,其McAb的重链为IgG1亚型,轻链为κ链。ELISA和Western blotting试验结果表明,获得的4B4株McAb可特异性的识别GPV和GPV-VP3蛋白,表明4B4株McAb识别的表位可能位于GPV VP3蛋白的保守区域。为进一步鉴定GPV的表位和GPV诊断试剂的研究奠定了基础。     

猪细小病毒VP2蛋白的原核表达及其免疫原性评估

利用原核表达载体pET28a和pColdⅠ与猪细小病毒VP2基因分别构建重组表达质粒,并采用与伴侣蛋白共表达和低温诱导表达猪细小病毒VP2蛋白,并以电镜观察、血凝效价测定等进行鉴定。结果显示,2个表达载体均能对重组蛋白进行可溶性表达。冷休克载体组pColdⅠ-VP2蛋白在上清中表达效率更高且杂蛋白较少,诱导时不需要额外添加L-阿拉伯糖,表达过程工艺相对更简单。纯化后的pColdⅠ-VP2蛋白具有一定的免疫反应性,能在体外组装成病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),且具有血凝活性,使用206佐剂混合乳化重组蛋白免疫豚鼠后,血清中能检测到高滴度血凝抑制抗体。上述结果为进一步研究新型安全高效的猪细小病毒疫苗提供了数据支持。     

鸡贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备

鸡贫血病毒是鸡传染性贫血病的病原体，它广泛存在于世界各地，成为危害养禽业的主要病原之一。鸡贫血病毒基因组含有3个开放阅读框架，分别编码分子量为51.6kDa（VP1）、24kDa（VP2）和13．6kDa（VP3）的3种蛋白质。本文将克隆化VP2基因亚克隆到PET-32a（＋）载体上并进行原核表达，用PET-32a（＋）表达的VP2融合蛋白免疫Balb/c小鼠，经过杂交瘤细胞的建立、融合细胞的筛选和克隆化培养，获得一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3C5。腹水单克隆抗体的ELISA效价为1：409600，经Western—blotting证明单抗3C5为针对VP2融合蛋白的单抗。为VP2融合蛋白的纯化和鸡贫血病毒的检测、鉴定和奠定了基础。     

一株抗猪脑心肌炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备抗猪脑心肌炎病毒(EMCV)HB10株VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究利用原核表达系统表达的重组VP2蛋白(r VP2),纯化后将其免疫BALB/c小鼠,取免疫的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法筛选出一株稳定分泌抗VP2 MAb(1D3)。通过间接免疫荧光试验和western blot对该MAb的免疫活性和特异性进行鉴定,结果表明1D3 MAb仅能够特异性与EMCV全病毒反应。此外,通过构建截短的VP2蛋白重组质粒,采用western blot的方法对VP2蛋白抗原表位进行鉴定,初步确定MAb 1D3识别的线性表位区域为89DGGVFGAALRRH100。本实验结果为进一步研究VP2蛋白的功能及建立EMCV检测方法奠定了基础。     

鸭肠炎病毒VP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

应用截短表达的鸭肠炎病毒(DEV) VP5-C蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合及筛选,获得4株稳定分泌抗VP5蛋白的杂交瘤细胞株,命名为1B5、3A1、4F9、6F6.抗体亚类鉴定表明,4株单克隆抗体均为IgG、k链.间接免疫荧光检测结果表明,4株单克隆抗体均能够与DEV感染CEF发生特异性反应,而不与CEF对照发生反应.Western blot检测,4株单克隆抗体均能够识别大小约为150 kDa的蛋白,说明4株单抗隆抗体是特异性识别VP5蛋白的抗体.DEV VP5蛋白单克隆抗体的制备为进一步鉴定VP5蛋白B细胞抗原表位及VP5蛋白功能研究提供了有效工具.     

抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体的制备及在抗原捕捉ELISA中的应用

本研究以原核表达、纯化的扎伊尔株埃博拉病毒（Ebola virus,EBOV）VP40蛋白片段免疫BALB／c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体,获得一株分泌抗EBOVVP40蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系。以重组杆状病毒表达EBOV VP40蛋白为抗原,经Western blot和间接免疫荧光检测该单克隆抗体显示出良好的特异性免疫反应。采用该株杂交瘤细胞系经腹腔注射接种8日龄BALB／c小鼠,制备腹水,并经纯化和HRP标记,获得HRP标记的抗EBOV VP40蛋白单克隆抗体。从而,初步建立一种抗原捕捉ELSIA诊断方法,以原核表达EBOV VP40蛋白片段兔抗血清为一抗,应用HRP标记的抗EBOV VP40蛋白单克隆抗体检测杆状病毒表达的重组EBOV VP40蛋白显示出良好的敏感性和特异性。结果表明,初步建立的抗原捕捉ELSIA诊断方法有希望成为一种理想的检测EBOV感染的诊断方法。     

蓝舌病病毒17型VP2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备蓝舌病病毒(BTV)血清17型VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究用原核表达系统部分重叠表达的两段VP2蛋白共同免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术获得杂交瘤细胞,通过以重组VP2蛋为白包被抗原的间接ELISA筛选获得2株稳定分泌抗BTV17 VP2蛋白的MAbs杂交瘤细胞株,分别命名为3F4和4H10.Ig亚类鉴定2株MAbs均为IgG1/k链.Western blot证明,2株MAbs均能识别重组VP2蛋白.间接免疫荧光试验表明:2株MAbs均与BTV17呈阳性反应,其中MAb 3F4与BTV1、BTV2、BTV3、BTV5、BTV8、BTV11、BTV13、BTV16、BTV23、茨城病病毒(IBAV)、牛轮状病毒(BRV)、牛呼肠孤病毒(RV)均呈阴性反应,但与BTV10和BTV24呈弱阳性反应.利用合成多肽对VP2抗原表位鉴定结果表明,MAb 3F4识别的抗原表位为540DPWNNR545,MAb 4H10识别的抗原表位为540DPWNNRA546.本研究结果为建立BTV17型特异性检测方法及VP2功能研究奠定了基础.     

抗猪传染性胃肠炎病毒重组S蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组S蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,间接ELISA方法进行筛选和有限稀释法3次克隆,获得2株稳定分泌抗TGEV重组S蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为C7C882和B5G8G7,其染色体平均计数均为88±10对,制备腹水抗体效价分别为1:2×105和1:104,分泌抗体亚类均为IgM型.2株杂交瘤细胞上清与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪伪狂犬病病毒(PrV)均无交叉反应,与TGEV感染细胞经间接免疫荧光检测均呈黄绿色荧光.     

鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备CIAV VP2单克隆抗体,将原核表达的His-VP2融合蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经4次免疫后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合。将原核表达的GST-VP2融合蛋白作为包被抗原,利用间接ELISA筛选阳性克隆。阳性细胞株经3次亚克隆后,获得3株稳定分泌抗CIAV VP2蛋白的杂交瘤细胞克隆,分别命名为3D7、3B8、2D3。经间接ELISA测定,以上3株杂交瘤细胞腹水效价分别为1:8.0×10~5、1:4.0×10~5,以及1:6.4×10~6,亲和力解离常数分别为7.34×10~(-11)、2.65×10~(-11),以及2.98×10~(-11)。IgG亚类分别为IgG1、IgG2b以及IgG2b。经Western Blot试验证明,3D7株单抗能特异地识别CIAV VP2蛋白,其识别的抗原表位区域为VP2 N-端的20~40 aa。经IFA试验证明,3株单抗均能识别天然的CIAVVP2蛋白。此单抗为研究CIAVVP2的生物学功能和CIAV致病机理奠定基础。     

鸭肠炎病毒VP22蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备抗鸭肠炎病毒(DEV)VP22蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究以DEV Clone-03基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增UL49基因并克隆至pMD-18载体.重组质粒经测序鉴定后,将UL49基因亚克隆于原核表达载体pET-30a,构建重组表达质粒pET-30a-UL49.重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,在大肠杆菌中获得表达,并对表达的重组蛋白VP22进行western blot鉴定.结果显示,表达的重组蛋白分子量约为36 ku,与预期的大小一致.重组蛋白能够被鼠抗DEV阳性血清所识别,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性.将重组蛋白纯化、复性后免疫BALB/c小鼠,制备MAb,经间接ELISA、western blot和间接免疫荧光试验进行筛选及鉴定.获得4株能够稳定分泌抗DEV VP22蛋白MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2810、2G1、3F10和3G2.其MAb亚类分别属于IgG2b、IgG2b、IgA和IgM.4株MAbs都能够与DEV Clone-03发生特异性反应,表明能够识别天然构象的VP22蛋白.这4株MAb可用于DEV VP22蛋白功能研究及抗原表位的研究.