山羊IL-2基因真核表达质粒构建及在MDBK细胞中的表达

本实验成功构建了真核表达质粒pVAX1-IL-2,并对质粒进行PCR,双酶切及测序鉴定,RT-PCR成功验证了目的基因在MDBK细胞中能够转录,同时ELISA验证目的基因在MDBK细胞中能表达.研究结果为pVAX1-IL-2作为核酸疫苗的细胞因子佐剂的应用研究提供生物材料.     

皮蝇 Hypodermin C 基因的克隆及重组表达载体的构建

参照牛皮蝇 Hypodermin C(HC)基因的核苷酸序列，设计了1对引物，以牛皮蝇总RNA为模板，用RT-PCR扩增了牛皮蝇HC基因，将扩增基因进行克隆测序。测序结果表明，所获得基因与已知序列同源性达99．45％。同时，将该基因与表达载体pGEX-4T-1连接，构建并获得阳性重组表达载体。     

PRRSV ORF5基因和CSFV E2基因重组真核表达质粒的构建及小鼠免疫试验

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)已知序列设计3对引物,采用RTPCR方法扩增PRRSV ORF5基因和CSFV E2基因,目的基因依次插入真核表达载体pcDNA4.0,经PCR、酶切及测序分析,重组质粒构建成功,并命名为pcDNA4.0-ORF5-E2.重组质粒回收提纯后,以100 μg/只剂量免疫小鼠,免疫3次.三免后10 d采血并制备血清,用间接ELISA检测小鼠血清中PRRSV及CSFV抗体效价.结果显示,所构建的重组质粒能够诱导小鼠产生PRRSV及CSFV抗体.     

小鹅瘟病毒VP3基因真核表达质粒在小鼠中的免疫效果

检测小鹅瘟病毒（GPV）VP3基因真核表达质粒在小鼠中的免疫效果。大量提取本实验室已构建的含有GPVVP3基因的真核表达质粒pVAXI／VP3和空载体pVAXI,分两组进行两点肌肉注射免疫小鼠,共免疫4次。利用MTY法检测免疫小鼠的T细胞增殖活性,间接ELISA法检测免疫小鼠血清中GPV特异性抗体的水平。淋巴细胞增殖指数,免疫小鼠与正常小鼠差异不显著。间接ELISA检测结果表明,pVAXI／VP3质粒免疫组小鼠血清中GPV特异性抗体水平,显著高于空载体对照组和阴性对照组。已构建的GPVVP3基因真核表达载体可以诱导小鼠产生明显的体液免疫,为小鹅瘟核酸疫苗的研究奠定基础。     

CpG寡核苷酸对IBDV VP2基因真核表达质粒免疫增效作用

以传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白基因表达质粒DNA为免疫原，以CpG的寡核苷酸(CpG-0DN)为免疫佐剂，肌肉注射于14日龄SPF鸡，1周后加强免疫1次，2次免疫后15d和21d分别测定血清ELISA抗体效价，并于免疫后21d用IBDV99儿强毒株攻毒和进行病理学观察。结果显示，(1)VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组的ELISA抗体水平明显高于VP2重组质粒免疫组；(2)IBD弱毒苗与VP2重组质粒免疫组抗体水平明显高于VP2重组质粒免疫组，且比VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组略高；(3)VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组及IBD弱毒苗与VP2重组质粒免疫组可明显降低IBDV强毒攻击后引起的急性发病率和死亡率。由此表明，CpG寡核苷酸对IBDV VP2蛋白基因真核表达质粒免疫具有明显增强作用，有很大的应用前景。     

猪PHGPx基因真核表达重组质粒的构建与鉴定

从猪睾丸中提取RNA后,采用逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）方法获得PHGPxcDNA。扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳回收,与pMD18-T载体连接,转入E．coli DH5α中筛选鉴定重组子。将质粒经酶切鉴定后,把酶切下的目的基因cDNA进一步克隆到真核表达载体pGAPZ旺A中,经PCR及序列鉴定,证实插入载...     

猪Ghrelin真核表达质粒的制备及对小鼠生长的影响

通过RT-PCR获得猪 Ghrelin基因的cDNA片段,克隆入pcDNA3.1(+)质粒中构建真核表达质粒,将质粒注射到断奶的昆明小鼠的后腿肌肉中,研究Ghrelin真核表达质粒对小鼠生长的影响。结果表明,试验组小鼠在试验第10、20、35 d的增重高于对照组,而在试验结束的第46 d增重无显著差异。说明Ghrelin基因真核表达质粒有促进小鼠生长的作用。     

纹皮蝇Hypodermin C基因原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为建立牛皮蝇蛆病的抗体检测方法,本研究从纹皮蝇I期幼虫中提取总RNA,采用RT-PCR扩增了Hypodermin C(HC)基因.将该基因片段插入到原核表达载体pET-30a(+)中进行原核表达.获得了31ku以包涵体形式表达的重组HC蛋白.Western blot结果表明表达产物能够与阳性牛血清IgG特异性结合,具有良好的抗原活性.以纯化的重组HC作为包被抗原建立了牛皮蝇蛆病间接ELISA诊断方法,实验确定抗原最佳包被浓度为15.63 μg/mL,血清最佳稀释度为1:80,阳性标准判定为待检血清OD值＞0.256.所建立的诊断方法具有较好的特异性、敏感性和可重复性.应用该检测方法对230份临床血清进行检测,阳性率为20.6％.研究结果表明该间接ELISA方法是一种有效的牛皮蝇蛆病血清学检测方法.     

鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E真核重组表达质粒的构建及其免疫保护性分析

为构建鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)重组真核表达质粒并检测其免疫保护性,本实验将E.tenella表面抗原基因3-1E(E)与鸡IFN-γ、IL-2基因分别串联在真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核重组表达质粒pcDNA-E-IFNγ、pcDNA-E-IL2,同时构建对照质粒pcDNA-E、pcDNA-IFNγ、pcDNA-IL2.经酶切鉴定得到预期大小目的片段,测序结果与预期序列一致.将构建的重组质粒免疫鸡只,经western blot检测表明该重组质粒在鸡体内可以正常表达;对感染鸡只的免疫保护效果显示,pcDNA-E-IFNγ、pcDNA-E-IL2组抗球虫指数(ACI)分别为181.04、187.30,具有高效的抗球虫效果,为将其进一步研制成为具有实用价值的抗球虫疫苗奠定了基础.     

牛新孢子虫NcSRS2基因真核重组质粒的构建及鉴定

为了解牛新孢子虫NcSRS2基因的生物学特性,试验扩增牛新孢子虫NcSRS2基因,亚克隆至pMD18-T载体后进行PCR鉴定、酶切鉴定及测序分析,最后克隆至pVAXⅠ真核表达载体中,并进行PCR鉴定和酶切鉴定。结果表明:牛新孢子虫NcSRS2基因长度为1 227 bp,与GenBank中发表的NcSRS2(AF061249)核苷酸序列同源性为99%;构建的真核重组质粒pVAXⅠ-NcSRS2正确。     

皮蝇素A基因的克隆及其毕赤酵母表达载体的构建

提取采自甘肃玛曲皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出皮蝇素A(Hypodermin A,HA)基因片段,用Xho Ⅰ、Xba Ⅰ消化,将消化后的目的基因HA纯化并回收,与经同样的酶消化后并纯化回收的裁体pPICZa连接并转化,获得重组表达质粒pPICZa-HA,经PCR、酶切、测序表明,目的基因插入位置、方向和阅读框正确.     

皮蝇素A基因的克隆与序列分析

首先提取采自甘肃玛曲的皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出Hypodermin A(HA)基因片段,将此片段与PGEM-T Easy载体连接,构建克隆载体PGEM-HA,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,进行测序与分析。结果表明,扩增的HA基因长678bp,编码229氨基酸。克隆到的基因序列与NCBI GenBank上登陆的皮蝇HA基因序列核甘酸同源性为96.6%,推导氨基酸同源性达97.8%。该基因的成功克隆为其进一步表达打下了坚实的基础。     

皮蝇Hypodermin A基因的克隆及表达质粒构建

参照牛皮蝇HypoderminA(HA)基因的核苷酸序列,设计一对引物,以皮蝇总RNA为模板进行RT--PCR扩增牛皮蝇HA基因,将扩增基因进行克隆测序。序列分析表明,所克隆获得的基因与GenBank中已经登录的核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.2%和99.3%。同时,将该基因与表达载体PGEX-4T-1连接,构建并获得阳性重组表达载体。     

鸡降钙素基因克隆及其真核表达质粒的构建

采集200日龄新扬州产蛋鸡腮后腺组织,直接提取总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物进行克隆、测序,获得新扬州鸡降钙素(CT)基因序列。测序表明,CT基因核苷酸长度为417bp,编码139个氨基酸。与GenBank上发表序列相比较,核苷酸同源性为99.8%,在第135位处存在G→C的有义突变。与从GenBank下载读取的红点鲑、大马哈鱼、河豚、斑马鱼、人、家鼠、绵羊、犬8个物种序列进行比较分析,核苷酸同源性分别为74.0%、63.3%、59.5%、55.6%、52.8%、50.6%、48%及42.2%。将该基因片段克隆到真核表达载体pCEP4,构建重组质粒pCEP4-CT,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段且连接、构建正确,为利用pCEP4-CT调控机体骨钙代谢、防治蛋鸡骨质疏松症的研究和应用奠定了基础。     

猪白细胞介素18基因的克隆及真核表达重组质粒的构建

为获得表达猪白细胞介素18（interleukin-18,IL-18）的真核表达重组质粒,试验通过RT-PCR从猪脾脏、肺脏和淋巴结组织中扩增猪IL-18全基因并定向克隆到真核表达载体pZJ-1,测序分析和酶切鉴定正确后,转染至293T细胞中,并通过实时荧光定量PCR和Western blotting分别在基因和蛋白水平检测IL-18的表达。结果表明,试验成功构建了真核表达重组质粒pZJ-IL-18,且可以在293T细胞中表达IL-18基因。Western blotting试验证实,猪IL-18多克隆抗体能与约17 ku的表达产物发生特异性反应,表明IL-18能正确表达且具有反应原性。本试验构建了表达猪IL-18基因的真核表达质粒,并在293T细胞中瞬时表达,为进一步研究IL-18的功能奠定基础。     

Cloning and Eukaryotic Expression Plasmid Construction of Porcine Interleukin-18 Gene

To obtain recombinant eukaryotic expression plasmid of porcine interleukin-18(IL-18), the whole gene of porcine IL-18 gene was amplified from porcine spleen, lung and lymph nodes by RT-PCR and cloned into eukaryotic expression vector pZJ-1. The recombinant expression plasmid pZJ-IL-18 were identified by enzyme digestion and sequencing analysis, and was transfected into 293T cells.The expression of IL-18 was detected by Real-time PCR and Western blotting in both gene and protein levels. The results showed that the eukaryotic expression plasmid of porcine IL-18 was constructed and could express transiently in 293T cells. Western blotting result confirmed that porcine IL-18 polyclonal antibody could react specifically with approximately 17 ku expression products,and indicated that IL-18 could express correctly and be responsive.This study constructed the eukaryotic expression plasmid of porcine IL-18 gene which could express transiently in 293T cells, and laid the foundation for studying function of IL-18.     

传染性法氏囊病病毒VP2基因真核表达载体的构建及初步表达

根据GenBank已登录的传染性法氏囊病病毒VP2基因序列,设计1对特异引物,应用反转录-聚合酶链反应技术从标准毒株B87中扩增了VP2基因,将其克隆到proVAX载体上,构建了proVAX-VP2真核表达载体,在脂质体介导下转染Hela细胞,用RT-PCR方法从转录水平证实VP2在Hela细胞中有特异性表达。     

牛皮蝇Hypodermin B 基因的克隆及原核表达载体构建

参照牛皮蝇Hypodermin B(HB)基因的核苷酸序列,设计一对引物,以牛皮蝇总RNA为模板利用RT—PCR扩增牛皮蝇HB基因,并对扩增基因进行克隆测序。序列分析表明,克隆的牛皮蝇HA基因与GenBank中已经登录的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97．2％和99．3％。同时,将该基因与原核表达载体．PGEX-4T-1连接,构建并获得阳性重组表达载体。     

猪孕烷X受体基因真核表达载体的构建与表达

为构建猪的孕烷X受体(PXR)基因真核表达质粒,用RT-PCR技术从新鲜猪肝中扩增到猪孕烷X受体(pgPXR)基因,将其连接到真核表达载体pCI-neo中,得到重组质粒pCI-pgPXR。对该重组质粒进行PCR、测序及酶切鉴定后,采用脂质体法将其转染到人肝癌细胞HepG2细胞,用RT-PCR和双荧光素酶检测系统进行鉴定。结果表明,猪孕烷X受体基因真核表达质粒pCI-pgPXR构建成功,可在HepG2细胞中表达,为猪孕烷X受体的药理学和毒理学研究奠定了基础。