发根农杆菌转化新疆紫草的PCR检测及序列分析

以发根农杆菌MSU440菌株转化的新疆紫草毛状根为材料,设计了rolC基因的特异性引物,应用PCR技术,扩增得到了600 bp左右的特异性核苷酸片段.进行双向测序分析,扩增的基因序列全长626 bp,含rolC基因的编码区540 bp,编码180个氨基酸组成的蛋白.正向测序rolC基因与GENEBENK已发表的序列相比较,核苷酸序列的同源性达到100 ;,氨基酸同源性高达100 ;;反向测序中,同源性达到97 ;.证实并确认了新疆紫草毛状根的真实性,为进一步利用新疆紫草毛状根生产次生代谢产物研究奠定了物质基础.     

杨树农杆菌介导遗传转化中抗生素浓度的筛选

研究头孢噻肟钠、头孢曲松钠、头孢拉啶、头孢他啶4种头孢类抗生素对根癌农杆菌LBA4404和EHA105的抑制作用;以欧美杨111和盖杨组培苗为材料,研究卡那霉素（Km）对2种杨树叶片分化及茎段生根的影响,并分析头孢噻肟钠对欧美杨111叶片分化及茎段生根的影响。结果表明,头孢噻肟钠、头孢曲松钠和头孢他啶对LBA4404具有良好的抑菌效果,使用浓度为50mg/L,其中头孢噻肟钠对农杆菌EHA105的抑菌效果最好,头孢拉啶抑菌效果较差。不同杨树品种对卡那霉素的耐受性差异不大,欧美杨111在叶片转化筛选培养时,使用浓度为10mg/L,抗性芽生根阶段为20mg/L;盖杨在叶片转化筛选培养时,卡那霉素使用浓度为20mg/L,抗性芽生根阶段为25mg/L,头孢噻肟钠对欧美杨111叶片分化和茎段生根影响不大。     

青蒿植物的遗传转化研究

为了建立利用发根农杆菌诱导青蒿植物Artemisia annuaL.毛状根的培养系统,分别用发根农杆菌Ri1601、ATCC15834感染青蒿无菌苗的子叶、下胚轴、叶片、叶柄等外植体获得毛状根,并比较不同因素对毛状根诱导和生长的影响。发根农杆菌诱导青蒿毛状根的有效方法被建立,借此为青蒿大规模遗传转化提供了理论基础。     

黄梁木遗传转化受体系统对筛选物敏感性研究

【目的】明确农杆菌介导的黄梁木遗传转化体系对筛选物的敏感浓度,为黄梁木遗传转化研究奠定基础。【方法】以黄梁木子叶、胚轴和无菌苗为材料,探讨筛选物卡那霉素、潮霉素、头孢霉素对试验材料生长的影响,以及对农杆菌LBA4404的抑菌效果。【结果】在不定芽分化、生根阶段,卡那霉素的临界浓度分别为20、10 mg/L,潮霉素的临界浓度均为10 mg/L;当头孢霉素的浓度为100 mg/L时,完全抑制农杆菌生长,而且该浓度对黄梁木不定芽分化、生根影响较小。【结论】在黄梁木子叶和胚轴为试验材料的遗传转化体系中,20和10 mg/L的卡那霉素可作为不定芽分化、生根阶段的筛选选择压,10 mg/L的潮霉素可作为两个阶段的筛选选择压;而100～200 mg/L的头孢霉素可作为农杆菌LBA4404的抑菌浓度。     

杉木遗传转化中抗生素种类和浓度的筛选

【目的】筛选适用于农杆菌介导的杉木遗传转化的抗生素种类和浓度,为杉木遗传转化体系建立提供理论依据。【方法】以杉木组培苗茎段和嫩芽为材料,探讨了潮霉素、卡那霉素和头孢霉素对其生长的影响以及对农杆菌GV3101的抑菌效果。【结果】潮霉素浓度为40 mg/L和60 mg/L时,杉木嫩芽和茎段培养42 d存活率分别为8.78%、13.97%和7.05%、5.93%,表现出良好的效果;80 mg/L时,其生长完全被抑制。卡那霉素浓度为100 mg/L时,杉木嫩芽和茎段在80 d时存活率仍高达75.04%和80.37%。300 mg/L的抗生素抑菌剂头孢霉素能有效抑制农杆菌GV3101生长,且该浓度下杉木嫩芽及茎段增殖效果良好。【结论】在以杉木嫩芽和茎段为受体材料的遗传转化体系中,40~60 mg/L和60~80 mg/L的潮霉素可作为杉木遗传转化抗性苗二次筛选的选择压,300 mg/L头孢霉素可作为农杆菌GV3101的抑菌浓度。     

农杆菌介导的丹参遗传转化体系研究进展

丹参是我国传统的大宗药材,被广泛用于治疗心脑血管疾病。随着我国心脑血管疾病发病率的逐年攀升,丹参的种质资源也急需有新的提高,转基因技术作为基因功能研究和转基因育种的重要手段在丰富和优化丹参种质资源方面取得了显著成效。通过利用转基因技术中常用的农杆菌介导法来转入外源基因以及探求丹参有效成分合成代谢相关基因功能,以期获得高产、高抗丹参植株的方法已较为成熟,目前研究工作主要集中于不同遗传转化体系的建立和优化。本文就丹参遗传转化体系构建的转化原理、影响因素和研究现状三方面作出详细综述,为今后丹参基因功能研究和新品种培育提供一定参考。     

发根农杆菌Ri质粒T-DNA对杜仲的遗传转化研究

杜仲是中国特有的经济树种,杜仲毛状根能够合成与杜仲含量相当的次生代谢产物。本实验用发根农杆菌ATCC15834分别感染杜仲Eucommia ulmoides Oliv的子叶、叶片、叶柄、下胚轴和根5个营养器官,结果表明杜仲植物的5个营养器官均能单独诱导出大量的毛状根。经PCR检测,发根农杆菌ATCC15834Ri质粒的rolB基因已转入杜仲毛状根基因组中。说明用发根农杆菌诱导杜仲产生大量的毛状根的方法有效,为大规模用发根农杆菌Ri质粒转化到杜仲植物中提供了理论基础。     

发根农杆菌感染导致紫果西番莲遗传转化

将发根农杆菌ＭＡＦＦ０３－０１７２４株系，涂布于逆向插入未添加任何生长调节剂的ＭＳ培养基中的紫果西番莲的茎段切口上，４周后，切口上出现瘤状突起，次周产生不定根，切下不定根根尖，培养于含Ｃｌａｆｏｒａｎ ０．５ｇ·Ｌ＾－１的培养基中，分化出发状根，发状根转入含有ＢＡ１ｍｇ·Ｌ＾－１和２，４－Ｄ ０．１ｍｇ·Ｌ＾－１的ＭＳ培养基中，分化出植株，再生植株经滤纸电泳检测，测出了农杆碱和甘露碱，说明紫果西番     

发根农杆菌感染导致紫果西番莲遗传转化

将发根农杆菌ＭＡＦＦ０３－０１７２４株系,涂布于逆向插入未添加任何生长调节剂的ＭＳ培养基中的紫果西番莲的茎段切口上．４周后,切口上出现瘤状突起,次周产生不定根．切下不定根根尖,培养于含Ｃｌａｆｏｒａｎ０．５ｇＬ－１的培养基中,分化出发状根．发状根转入含有ＢＡ１ｍｇＬ－１和２,４－Ｄ０．１ｍｇＬ－１的ＭＳ培养基中,分化出植株．再生植株经滤纸电泳检测,测出了农杆碱和甘露碱,说明紫果西番莲已发生了遗传转化．     

发根农杆菌介导的杨梅遗传转化研究初报

为了建立发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes介导的杨梅Myrica rubra遗传转化体系,利用携带拟南芥Arabidopsis thaliana LEAFYcDNA片段的发根农杆菌R15834感染东魁杨梅M. rubra‘Dongkui’和荸荠杨梅M. rubra‘Boji’的子叶、叶片和茎段。结果表明,只从东魁杨梅子叶上诱导出毛状根,而且产生毛状根的东魁杨梅子叶数在10%以下。杨梅子叶产生毛状根受多种因素影响,新种子比旧种子容易产生毛状根,在1/2 MS(Murashige and Skoog)培养基培养较在MS培养基上培养好。东魁杨梅子叶上的毛状根经聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测和Southern杂交检测,证实已将拟南芥的LEAFYcDNA片段成功导入并整合到东魁杨梅子叶中。图2参10     

新疆紫草毛状根提取物的抑菌活性研究

为了研究新疆紫草毛状根的抑菌活性与新疆紫草根的抑菌活性是否相似,以甜瓜叶斑病、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、棉花枯萎病菌和棉花黄萎病菌5种菌为供试菌,采用滤纸片法和菌丝生长速率法,对新疆紫草毛状根紫草素粗提物及多糖进行抑菌活性研究。结果表明:乙醇提取物对3种细菌均具有抑制作用,其中对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强。丙酮提取物仅对甜瓜叶斑病菌有抑制作用,其抑制作用较乙醇提取物高26.5%。乙酸乙酯和石油醚提取物对3种细菌均无抑制作用;4种溶剂提取物对2种真菌均有抑制作用,且对棉花黄萎病菌的抑制率均高于枯萎病菌;乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、丙酮提取物对甜瓜叶斑病菌的MIC均为0.1 mg/mL,乙醇提取物对大肠杆菌的MIC为6.25 mg/mL;毛状根多糖对2种真菌均具有抑制作用,且对棉花黄萎病的抑制作用较棉花枯萎病高26.14%,而对3种细菌均无抑制作用。     

新疆紫草毛状根提取物的抗氧化活性研究

[目的]研究新疆紫草毛状根提取物的抗氧化活性.[方法]采用平行提取法提取紫草色素(LEP),测定了LEP对DPPH·体系、Fenton体系、亚油酸脂质过氧化体系和还原体系的抗氧化作用.[结果]新疆紫草毛状根四种不同溶剂提取物在DPPH·体系、Fenton体系、亚油酸脂质过氧化体系和还原体系中均具有较强的清除作用.新疆紫草毛状根粗多糖也具有抗氧化活性.[结论]新疆紫草毛状根提取物具有抗氧化作用,可作为原料进行开发利用.毛状根的抗氧化活性属国内首次报道.     

培养基及温度对新疆紫草毛状根生长的影响

[目的]研究新疆紫草毛状根理化因子对其生长的影响.[方法]采用固体培养法研究培养基、接种量及温度对新疆紫草毛状根生长的影响.[结果](1)毛状根在不同培养基中的相对生长率及增殖倍数均表现接种量0.1 g较大.BS5固体培养基的相对生长率及增殖倍数达最高,分别为1 790;和18.90倍.(2)毛状根在B5培养基中培养33 d时鲜重达峰值,毛状根的继代时间不宜超过33 d.(3)26℃条件下毛状根的干重达最高,是接种量的19.2倍.高温处理毛状根的时间越长其受抑制程度越大.[结论]培养基、温度及接种量对毛状根的生长均有影响.研究为采用固体培养法长期保存新疆紫草毛状根提供了理论依据.     

影响新疆紫草毛状根生长的因子研究

[目的]研究毛状根生长过程中的影响因子,为新疆紫草毛状根生产紫草素及其衍生物提供技术支持.[方法]采用SH液体培养法,分别考察硝酸钾、酸水解酪蛋白、磷酸二氢铵对毛状根生长的影响.[结果]硝酸钾浓度为3.0 g/L时增殖倍数达6.32倍;在硝酸钾为3.0 g/L、磷酸二氢铵为0.3 g/L时毛状根增殖倍数达10.37倍;当酸水解酪蛋白为0.5 g/L、硝酸钾为3.0 g/L、磷酸二氢铵0.3 g/L三者配合使用时,毛状根增殖倍数平均达12.62倍;培养液pH随着培养时间的延长呈下降趋势,但对毛状根生长没有显著影响;生长末期pH下降幅度为0.41 ～1.85;起始pH高时,末期pH降低的幅度大,起始pH低时末期降低的幅度小.起始pH偏酸有利于毛状根生长;在pH5.8、培养容积为250 mL时,毛状根增殖倍数达15.47倍.[结论]硝酸钾是影响新疆紫草毛状根生长增殖的必要条件,酸水解酪蛋白、硝酸钾、磷酸二氢铵有互作效应.     

新疆紫草种子无菌苗的培养技术优化

采用不同消毒方法对新疆紫草种子进行消毒,并将种子接种在不同激素、不同培养基中进行培养。结果表明,用15％的H2O2消毒新疆紫草种子15min可提高种子的发芽率,发芽率最高达92．5％,较升汞消毒的种子发芽率高52．7％。培养基中加碳粉可以促进种子发芽率和无菌苗的质量。消毒方法对新疆紫草种子发芽率的影响最大,不同的培养基和激素对新疆紫草种子发芽率的影响甚微。     

新疆紫草种子萌发过程中生理生化变化

测定了新疆紫草种子萌发过程中过氧化物酶（POD）活性及酚类物质含量的变化,考察了其对新疆紫草种子萌发的影响。结果表明,新疆紫草种子在萌发过程中,随POD活性的增强,发芽率逐渐升高,POD活性增强促进新疆紫草种子的萌发。福林试剂与10NNa2CO3之比为2：1（V：V）,反应温度为25℃,反应时间为45min,体积为0．5～3．0mL时与其吸光度值呈良好的线性关系,建立了酚类物质的提取及测定方法。总酚含量随发芽进程呈先降低后升高趋势,酚类物质的合成和积累抑制新疆紫草种子萌发。     

新疆紫草快繁技术研究

[目的]建立新疆紫草组培快繁技术体系.[方法]以新疆紫草无菌苗的茎尖为外植体,筛选适合茎尖萌发、增殖、生根的激素组合.[结果]茎尖最佳萌发培养基为MS+TDZ 1.0 mg/L,其萌发率为100;.芽增殖培养基为MS+TDZ 1.0 mg/L,芽增殖倍数为13.50倍,继代壮苗培养基为MS+NAA 0.3 mg/L +6-BA 0.5 mg/L,生根培养基为MS+NAA 0.1 mg/L,生根率为84;.降低6-BA浓度到0.05 mg/L可大幅降低玻璃化发生率.经过此培养基继代后,再在原生根配方中生根,生根率提高到95.32;.[结论]茎尖是新疆紫草快繁的最佳外植体.     

紫草与大青叶提取物体外抑菌效果研究

[目的]研究紫草[Arnebia euchroma（Royle） Johnst]与大青叶（Isatis indigotica Fort）提取物对6株腐败微生物和致病菌的抑菌性能及其最小抑菌浓度（MIC）。[方法]采用滤纸片扩散法。[结果]紫草提取物对猪粪链球菌、炭疽杆菌、李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌均有较强的抑制效应,MIC分别为0.03、0.03、0.08、0.11mg/ml,而对沙门氏菌和大肠杆菌的抑制效果相对较弱。大青叶提取物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特氏菌、炭疽杆菌均有较强的抑制效应,MIC分别为0.08、0.19、0.20、0.56mg/ml,而对猪粪链球菌和大肠杆菌的抑制效果较差,MIC分别为1.08、1.16mg/ml。[结论]为开发和应用大青叶与紫草提取物作为功能性天然防腐剂提供参考。     

理化条件对新疆紫草毛状根培养及紫草素含量的影响

以发根农杆菌诱导的新疆紫草毛状根为试验材料,采用二阶段培养法,分别考察了NH4NO3、培养基、转速、温度、蔗糖对毛状根生长的影响及培养方式、酸水解酪蛋白对毛状根生产的影响。结果表明:毛状根在MS无铵液体培养基中生长速度较MS快了近1倍,第15天时毛状根的生长量达峰值,增殖8倍;在SH无铵培养基、转速为(120±5)r/min、温度为(25±1)℃时毛状根增殖倍数最大,为9.34倍。蔗糖质量浓度对毛状根的生长增殖影响不大;液体培养方式的紫草素及其衍生物含量(1.05%)远远高于固体培养(0.33%),是后者的3倍;添加0.5g/L的酸水解酪蛋白的其紫草素及衍生物含量为1.29%,较对照(1.17%)增加了10.3%。本研究为今后利用新疆紫草毛状根规模化生产提供了理论依据。