强致病性沙门菌快速分子诊断技术的建立

在已有工作的基础上,利用多重PCR技术进行沙门菌组氨酸转运操纵子hisJ基因、毒力质粒spvR基因和H1抗原fliC基因的特异性扩增,结果发现,5株(鼠伤寒、猪霍乱、都柏林、肠炎、雏沙门菌)常见强致病性沙门菌标准菌株均可检测出hisJ基因(359 bp)和spvR基因(789 bp),并可检测出fliC-c基因(623 bp)或,fliC-i基因(537bp);伤寒沙门菌和亚利桑那沙门菌标准菌株检测出spvR基因,验证了伤寒沙门菌、亚利桑那沙门菌已具毒力质粒的报道,揭示它们对人和动物具强致病性.该技术有助于快速诊断强致病性沙门菌,有助于发现新的强致病性沙门菌,并为亚利桑那沙门菌以及常见具H1-c、H1-i抗原沙门菌的血清型鉴定提供辅助依据,可应用于公共卫生、食品卫生和口岸检疫等领域.     

毛皮动物源大肠埃希菌毒力基因二重PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速检测毛皮动物源大肠埃希菌耶尔森菌强毒力岛(HPI)中irp2、FyuA毒力基因的二重PCR方法,根据GenBank中irp2、FyuA基因的序列,设计并合成两对引物,扩增得到irp2、FyuA基因片段,大小分别为300bp和951bp。据此建立双重PCR方法,并将反应条件进行了优化。结果表明,用所建立的二重PCR方法可同时特异性扩增出大肠埃希菌irp2、FyuA毒力基因片段,对沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、克雷伯菌均无特异性扩增。菌液最低检出量为2.8×105CFU/mL。在78份临床样品检测中,二重PCR检测结果与常规PCR检测结果一致。所建立的大肠埃希菌irp2、FyuA毒力基因二重PCR检测方法具有很好的特异性和灵敏度,能够提高临床样品检测的效率。     

驴源马流产沙门菌的耐药表型及毒力基因检测

为了解驴源马流产沙门菌临床分离株的耐药表型及毒力基因的携带情况,本试验通过K-B药敏纸片扩散法对9株马流产沙门菌进行11种临床常用抗菌药物的敏感性测试,采用PCR方法检测与沙门菌致病性相关的10种毒力基因。结果显示:9株驴源马流产沙门菌存在2种耐药表型,对链霉素耐药率达100%,对阿莫西林耐药率为33%;10种毒力基因中仅traT未被检出,invA、avrA、ssaQ、mgtC、sopB、spvC、spvR、pefA和misL的检出率均为100%。结果表明,驴源马流产沙门菌耐药谱较为单一,但携带的毒力基因为多样性组合。     

山东地区生猪屠宰环节沙门菌毒力基因携带状况分析

为了了解山东地区生猪屠宰环节沙门菌毒力基因携带状况,为进一步开展沙门菌风险评估提供基础数据。采集山东地区5个不同生猪屠宰场样品1 000份,分离沙门菌,鉴定血清型,并对mogA、sseL、spvC、spvR、hisJ、fliC等6种毒力基因进行PCR检测。结果共分离得到沙门菌菌株188株,分离率为18.8%。鉴定出9种血清型,以德尔卑沙门菌(S.derby)、鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)、汤卜逊沙门菌(S.thompson)为主。上述6种毒力基因均有检出,其中,mogA检出率为76.70%,hisJ检出率为62.77%,两种毒力质粒spvR、spvC的检出率较低,仅分别为3.19%和1.06%,且同时含有多种毒力基因的沙门菌菌株较少。不同地区屠宰场毒力基因携带状况存在较大差异。表明山东地区生猪屠宰环节沙门菌毒力基因携带状况不同,沙门菌污染较严重,应采取措施降低生猪屠宰中沙门菌的污染,减少食物中毒事件。     

吉林省猪源沙门菌毒力基因检测及耐药性分析

为了解吉林省规模化猪场猪群中沙门菌的携带、毒力基因分布及耐药性等情况,本试验于2013年间采集吉林省规模化猪场猪直肠拭子540份,经细菌分离、生化鉴定、分子生物学鉴定,共检出猪源沙门菌18株,检出率3.33%,同时对菌株进行药敏试验、毒力基因检测及致病性试验。结果显示,18株分离株对链霉素耐药率为72.22%,对四环素耐药率为72.22%,其他药物耐药率普遍高于22.2%,且多重耐药严重。此外,共检测10种毒力基因,其中sseC、spvA、spvR三种基因检出率分别为72.2%、72.2%、83.3%。小鼠致病性试验中,有11株分离株对小鼠具有较强的致病性(61.1%)。表明分离沙门菌存在多重耐药现象,且致病力的增强可能与毒力岛和毒力质粒的存在有关。     

沙门菌和志贺菌二重PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank提供的沙门菌invA基因序列和志贺菌ipaH基因序列设计引物,建立了二重PCR方法,在同一反应体系同时检测两种致病菌核酸,经二重PCR方法扩增后,在同一泳道同时检出沙门菌284 bp和志贺菌611 bp特异性扩增条带,而普通大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、阪畸大肠埃希菌、绿脓杆菌、蜡样芽胞杆菌、马链球菌、产单核细胞李斯特菌、鹅大肠埃希菌、猪水肿病大肠埃希菌均未出现这两种条带.对PCR产物进行测序,测序结果与已发表的基因核苷酸序列比较,沙门菌同源性为93%～100%,志贺菌同源性为98%～100%.应用建立的沙门菌和志贺菌二重PCR方法对广西6个试验猴养殖场1 665份猴粪便样品进行检测,检出沙门菌阳性25份,志贺菌阳性90份,阳性检出率分别为1.5%和5.4%.表明建立的沙门菌和志贺菌二重PCR检测方法特异性强、敏感性高,适用于临床粪便样品的快速检测.     

禽源性大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法的建立与应用

为了解临床禽源致病性大肠杆菌中高致病性毒力岛(High pathogenicity island HPI)流行情况和基因特征,根据Gen Bank已知禽源irp2基因序列,设计、合成一对特异性引物,建立irp2基因PCR检测方法,优化、确定PCR扩增特性,进行敏感性、特异性、重复性检测评价。对256份临床分离禽源大肠杆菌进行irp2基因PCR检测和基因遗传变异分析。结果显示,建立的PCR检测方法敏感性可达2.14×10~(-4)ng/μL;特异性显示与鸡沙门菌、副鸡嗜血杆菌、鸭疫里默菌、禽巴氏杆菌、鸡毒支原体、鸡新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)核酸均无交叉反应;重复性显示3份阳性样品重复5次检测,变异系数3.4%~5.0%。256份临床样品PCR检测irp2基因,阳性率30.6%。获得了9株分离株irp2基因序列,分析显示,与GenBank已知基因同源性高达96.2%以上。说明建立的禽源大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床致病性大肠杆菌毒力岛基因快速检测。     

肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛PCR检测方法的建立

以肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛主要结构亚单位基因为靶序列,设计合成了1对可扩增长609 bp目的片段的引物,建立检测肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛结构基因的PcR方法.特异性试验表明,本室保存的表达Ⅲ型菌毛的鸡源肺炎克雷伯菌临床分离株Kpn7扩增出609 bp的特征性片段,而大肠埃希菌、副伤寒沙门菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌和金黄色葡萄球菌扩增产物均未检出;敏感性试验表明,PER方法检测该菌基因组DNA的灵敏度为16.8 ng/L,检测该菌菌液的灵敏度为3.7× 102 CFU/mL.用此方法对10份临床疑似病例分离物进行检测,结果有5株阳性.表明此方法特异性和敏感性都很高,可用于临床Ⅲ型菌毛肺炎克雷伯菌病的辅助诊断和流行病学调查.     

应用复合PCR方法检测沙门菌的研究

参照文献报道的沙门菌Repeat se和hisJ基因片段的引物序列，设计并合成了2对引物，对沙门菌属和非沙门菌属的标准菌株及分离菌株进行了复合PCR扩增反应。结果，沙门菌PCR产物均出现199bp与495bp的特异性DNA扩增条带．而非沙门菌均未出现扩增条带，证明这2对引物具有沙门菌属特异性。将提取的沙门菌DNA做梯度稀释，测定该复合PCR体系的敏感度。结果表明，此体系可检出10^3CFU／mL菌液提取的DNA模板。应用上述方法，对进境鱼粉阳性样品进行了检测，均出现阳性结果。本研究表明，复合PCR是一种特异、敏感、快速的沙门菌检测方法，可应用于口岸系统鱼粉、肉骨粉的日常检测。     

饲料中鸡源性成分PCR-DHPLC检测方法的建立

以鸡组织为材料,提取鸡组织的线粒体DNA,以鸡12SrRNA基因为靶基因设计引物,PCR反应扩增片段230bp;用13种畜禽和水产动物线粒体DNA验证该PCR引物的特异性,结果只有鸡线粒体DNA为阳性;PCR-DHPLC检测灵敏度在DNA水平上达到了2.04mg/L;在随机采集的22份饲料样品中,检出8份鸡源性成分样品。结果表明,本研究建立的PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地对饲料中的鸡源性成分进行快速准确检测。     

辽宁省规模化猪场生产链中沙门菌优势血清型及其主要毒力因子分布

为了解辽宁省猪沙门菌流行菌株主要血清型毒力因子的分布特征及致病性,依据猪沙门菌属保守基因、多重PCR引物和血清凝集试验,从辽宁省选择有代表性的规模化养猪场、下游生猪屠宰场和肉类市场采集肠道、饲料和污水、猪肉等样品进行猪沙门菌及其血清型鉴定。应用猪沙门菌14种主要毒力因子特异性基因扩增检测方法,检测所分离到的不同血清类型猪链球菌的毒力因子分布情况,并应用小鼠攻毒试验和病理学技术对其致病性进行观察。结果显示:采集的412个样品中共分离到39株猪沙门菌,养猪场、屠宰场、销售市场所分离沙门菌检出率分别为51.28%,41.02%,7.70%;主要血清型为猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒型沙门菌,其阳性率分别为41.02%,38.46%,5.12%,未定型占15.38%;毒力因子共检出11种,其中检出率达到90%以上的和3种血清型共同携带的毒力因子结果一致有mogA、sseL、mgtC、bcfA、araB、stn,猪生产链3个环节共同携带的毒力因子有spvR、spvA、mogA、mgtC、araB、stn,其中养殖场毒力因子检出率最高,销售市场毒力因子检出率最低;猪霍乱沙门菌可引起小鼠的急性败血症,肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌均可引起小鼠发病,但各器官的损伤则较轻。     

沙门菌多重PCR检测方法的建立及其应用

为鉴定临床上常见的3种沙门菌血清型,针对特异性基因invA(沙门菌属)、sdfl(肠炎沙门菌)、Stm4495(鼠伤寒沙门菌)和SPUL-2693(鸡白痢沙门菌)设计引物,利用标准菌株通过优化体系成功建立了沙门菌的四重PCR检测方法.结果 显示:该方法特异性好,敏感性高(检测下限:基因组为500 pg/mL,菌液为10...     

新城疫病毒强弱毒株PCR-RFLP鉴别方法的建立

设计1对特异性引物扩增新城疫病毒F蛋白基因460 bp大小片段,而后利用PstⅠ和Bbe Ⅰ进行酶切,弱毒株酶切出120 bp和220 bp两个片段,而强毒株酶切出120 bp和340 bp两个片段,经敏感性、特异性试验,表明该方法敏感性高、特异强.用该PCR-RFLP检测了170份病料,检出强毒株5份、弱毒株1份,PCR阳性病料经SPF鸡胚进行病毒分离,用MDT、ICPI试验测定其生物学毒力,并对它们的F蛋白基因克隆测序,通过MDT、ICPI和推导氨基酸裂解位点分析,确定其毒力的结果与PCR-RFLP检测结果一致.表明该方法快速、特异、敏感,很适合于鸡群中新城疫快速诊断和新城疫病原学监测.     

猪瘟病毒和不同型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立

为建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,针对CSFV和PRRSV的基因序列设计3对特异性引物,第1对引物扩增CSFV毒株NS2基因508bp片段,第2对引物扩增PRRSV美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因338bp/248bp片段,第3对引物扩增PRRSV欧洲型毒株ORF5基因614bp片段。经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分CSFV毒株和PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株及欧洲型毒株的多重RT-PCR方法。该方法可以特异扩增CSFV和PRRSV,而与猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均无交叉反应;对CSFV和PRRSV 4种重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝/μL。对采集的106份临床疑似病料进行检测,结果CSFV和PRRSV变异株混合阳性4份,占3.77%(4/106);CSFV阳性7份,占6.60%(7/106);PRRSV变异株阳性17份,占16.04%(17/106)。结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法可以用于CSFV和PRRSV的临床快速鉴别诊断和流行病学调查。     

四川省山羊源沙门菌血清型鉴定及毒力基因的分布

调查四川省山羊源沙门菌血清型及部分毒力基因的分布及其致病性,为食品安全控制提供参考。采用沙门菌单因子血清对42株山羊源沙门菌血清型进行鉴定,并用PCR检测其携带invA、sopE、orgA、avrA、ttrB、sseL、rhuM、mgtC、orfL、sopB、pipD、sodC1、lpfC、pefA、spvC等15个毒力基因的情况;根据血清型和毒力基因的携带情况选取山羊源沙门菌菌株,采用灌胃法对BALB/c小鼠进行攻毒试验。血清学鉴定结果显示,23株为布利丹沙门菌、15株为肠炎沙门菌、3株为阿贡纳沙门菌、1株为纽波特沙门菌;PCR检测结果显示,42株沙门菌均携带invA、orgA、pipD、sopB、lpfC5种毒力基因,sopE、sseL、ttrB、rhuM、sodC1、pefA、spvC、avrA、mgtC、orfL的携带率分别为97.6%、97.6%、88.1%、95.2%、92.9%、47.6%、47.6%、40.5%、40.5%、38.1%;每个菌株携带6~15种毒力基因,且发现有2株阿贡纳沙门菌携带毒力质粒;携带15个毒力基因的2株布利丹沙门菌、2株肠炎沙门菌和2株阿贡纳沙门菌均在5×108 CFU剂量下致死全部未经抗生素处理的小鼠,其中肠炎沙门菌SWUN3816对小鼠的LD50为1.6×102 CFU。综上可见,布利丹沙门菌和肠炎沙门菌是四川省山羊源沙门菌的优势血清型,首次发现阿贡纳沙门菌携带毒力质粒。     

猪繁殖与呼吸综合征3种毒株多重PCR检测方法的建立

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列设计2对特异性引物,第1对通用引物扩增美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因(466bp/376bp),第2对引物特异性扩增欧洲型毒株ORF7基因(580bp)。反应条件优化后,建立了能够同时检测美洲型经典毒株、美洲型变异毒株和欧洲型毒株的多重PCR检测方法。该方法可以特异性扩增3种毒株的基因,目的基因片段大小差异在90bp以上便于电泳观察,重组质粒标准品检测下限为1.93×103拷贝。应用该方法检测183份临床疑似病例,结果 PRRSV阳性35份,其中美洲型经典株2份,美洲型变异株31份,欧洲型毒株3份,美洲型变异株和欧洲型毒株混合感染1份。表明建立的多重PCR检测方法具有快速、准确、敏感等优点,对PRRSV 3种毒株的快速诊断有十分重要的意义。     

鸡白痢沙门菌基因组差异片段的筛选与分析

采用抑制性消减杂交技术（SSH）对鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株进行了基因组差异片段分析.结果,从C79-13株中共检出13个特异性差异片段.经同源分析,这些序列可分为3类：噬菌体相关序列、质粒相关序列和已知功能序列.这些差异片段包含一些重要的沙门菌毒力相关基因,如编码大肠杆菌素、IpaJ蛋白、尾突蛋白、切除酶的基因.结果表明,鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门茵Sg9株基因组问存在较多差异基因,这些差异片段为确定鸡白痢沙门菌特异性遗传标志,建立分子鉴别新体系提供了基础.     

同时检测美洲型及欧洲型PRRSV的多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV基因序列设计3对特异性引物,即第1对通用引物扩增美洲型和欧洲型病毒株ORF7基因(433 bp/398 bp)、第2对引物扩增美洲型经典病毒株和高致病性变异株(HP-PRRSV)Nsp2基因(338 bp/248 bp)、第3对引物扩增欧洲型病毒株ORF5基因(614 bp)。经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分美洲型经典病毒株、HP-PRRSV株以及欧洲型病毒株的多重RT-PCR检测方法。该方法可以特异扩增3种病毒的基因,其重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝;而与猪的其它重要病原均无交叉反应。应用该方法检测176份临床疑似病料样品,结果 PRRSV阳性45份,其中美洲型变异病毒株41份、经典病毒株4份,未检测到欧洲型病毒株。表明本研究建立的多重RT-PCR检测方法可以用于PRRSV的快速鉴别诊断和流行病学调查。     

朗德鹅大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌三重PCR快速检测技术研究

以GenBank公布的大肠杆菌OmpA基因序列、沙门氏菌invA基因序列、禽多杀性巴氏杆菌基因序列(U51470)为靶基因,设计合成了3对引物,分别扩增大小约为266bp、801bp和445bp的片段,优化反应条件,建立多重PCR反应体系,并对临床样品进行模拟检测,结果显示:该反应体系对目的菌具有高度的特异性,对三种菌的检测下限为10~5CFU/ml;对24份临床可疑病料检测结果与细菌分离结果一致,证明该多重PCR检测方法的诚实可靠,可用于三种菌的快速检测。     

鸡白痢与鸡伤寒沙门菌双重PCR方法的建立和初步应用

分析不同血清型/生物型沙门菌全基因组序列筛选出鸡白痢和鸡伤寒沙门菌特异性基因组序列,设计两对引物,建立双重PCR方法鉴别检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌不同生物型,并进行初步的临床应用。双重PCR方法结果显示,鸡白痢沙门菌显示417 bp条带,鸡伤寒沙门菌显示417 bp和636 bp两个条带,而阴性对照未出现条带,与预期设计相符。双重PCR体系对56株不同血清型沙门菌鉴定结果与细菌学分离的血清型鉴定结果完全一致,说明本试验建立的双重PCR体系特异性良好,应用上述方法检测鸡场疑似20份临床样本,结果发现8株鸡白痢沙门菌阳性,1株鸡伤寒沙门菌阳性。上述结果表明,已建立双重PCR方法特异性检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌。本试验为鸡白痢和鸡伤寒不同生物型沙门菌的检测提供了一种简洁、敏感、特异的新方法。