膜孕激素受体(mPRα)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵母细胞成熟过程中的表达特征

通过实时荧光定量PCR方法(qRT-PCR)检测半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)雌性性成熟不同时期、不同时相卵母细胞中膜孕激素受体(mPRα)的表达,通过qRT-PCR和Western blotting方法检测促性腺激素(HCG)对成熟期半滑舌鳎卵母细胞mPRα表达的影响,同时,采用原位杂交、免疫组化和Western blotting方法研究雌性性成熟半滑舌鳎mPRα mRNA和蛋白在各组织中的表达.对半滑舌鳎性成熟不同时期、不同时相卵母细胞中mPRα mRNA的定量研究结果显示,在成熟时期半滑舌鳎Ⅴ时相卵母细胞的mPRα mRNA表达量最高.HCG对成熟期半滑舌鳎卵母细胞mPRα表达的影响研究结果显示,20 IU/ml HCG比10 IU/ml HCG对成熟时期半滑舌鳎卵母细胞mPRα mRNA和蛋白表达的促进作用更明显,进一步证明mPRα介导孕激素参与了卵母细胞成熟的调控.对mPRα组织表达的定量和定位研究中,Western blotting结果显示,在半滑舌鳎的卵巢、垂体、脑、头肾、肾、肝脏组织中均有mPRα蛋白表达,且在脑、垂体和卵巢中表达量较高,表明mPRα在不同组织中都发挥着一定的作用,且在内分泌相关组织如脑、垂体和卵巢中的作用更明显.原位杂交和免疫组化结果显示,mPRα mRNA和蛋白表达明显定位在卵母细胞膜上,且在其他组织的外周和管腔结构表达.本研究为进一步研究mPRα在膜上的信号转导机制提供了理论基础和形态学依据.     

孕酮受体膜组分1基因在性成熟雌性半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的组织学定位定量分析

运用Western blotting、免疫组化和原位杂交方法检测性成熟半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)孕酮受体膜组分1(Progesterone receptor membrane component 1,PGRMC1)蛋白和mRNA在不同组织的分布和表达特征.原位杂交结果发现,PGRMC1 mRNA主要分布在成熟的卵母细胞膜上,在脑组织神经元和分散的垂体细胞中也有表达.利用制备的半滑舌鳎PGRMC1多克隆抗体,对不同组织中的PGRMC1蛋白表达量进行Western blotting检测,发现在半滑舌鳎卵巢、脑、肝脏中PGRMC1蛋白表达量相对较高,在垂体、头肾、肾也有表达,但表达量相对较少.免疫组化结果表明,半滑舌鳎PGRMC1蛋白在成熟的卵母细胞膜上显著表达,进一步证明PGRMC1为卵膜上的受体基因,推测其主要在卵膜上行使相关的生理功能.研究结果为探究PGRMC1在半滑舌鳎卵母细胞成熟过程中的生理功能提供了重要参考.     

半滑舌鳎新型膜孕激素受体基因分子特征及其在卵巢发育过程的作用

为进一步提高半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)人工育苗技术水平,对半滑舌鳎新型膜孕激素受体(m PR-like)基因进行研究。采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法,获得全长为2 002 bp的半滑舌鳎新型膜孕激素受体的c DNA序列;二级结构分析表明,该蛋白存在7个跨膜区域;三级结构分析表明该蛋白有多个结合位点。使用MEGA4.0临位相联法和Clustal X方法对m PR-like的氨基酸序列进行聚类分析和序列相似度分析,发现半滑舌鳎m PR-like与青鳉(Oryzias latipes)和三刺鱼(Gasterosteus aculeayus)的m PR-like聚为一支,相似度分别为68%和72%。应用实时定量PCR方法分析了m PR-like m RNA表达情况,发现m PR-like m RNA在性成熟雌性半滑舌鳎不同组织表达具有广泛性,但表达量存在差异,在脑、卵巢、心脏、鳃、脾和胃等组织表达丰富;在不同发育阶段卵母细胞中,m PR-like m RNA表达水平从II时相卵母细胞到V时相卵母细胞持续升高,而在VI时相卵母细胞的表达水平显著下降(P0.05);在半滑舌鳎繁殖周期的脑和卵巢组织中,m PR-like m RNA的表达水平从性腺发育II期到V期持续升高,并且在V期达到最高峰(P0.05),VI期表达量开始下降;在半滑舌鳎繁殖周期的垂体组织中,不同繁殖期m PR-like m RNA表达水平变化幅度不大,但在性腺发育V期时垂体中的表达量显著高于其他繁殖期(P0.05)。放射免疫测定的结果表明,半滑舌鳎雌鱼血清中孕酮激素的含量变化在整个繁殖周期中差异显著(P0.05),在性腺发育IV期含量迅速升高并在V期达到峰值。该基因在半滑舌鳎多种组织中的表达特征,预示其具有多种生理学作用;在卵母细胞和繁殖周期脑–垂体–卵巢的表达特征表明其参与卵母细胞成熟过程和生殖调控。     

促性腺激素调控半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵母细胞孕酮受体膜组分1的表达特征

采用qRT-PCR方法分析性成熟半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)不同发育时期卵巢卵母细胞的孕酮受体膜组分1 (PGRMC1)mRNA的表达,研究发现,在发育Ⅳ期的卵巢,处于第Ⅳ时相的卵母细胞PGRMC1 mRNA表达量最高(P＜0.05);在发育Ⅴ期的卵巢,成熟期卵母细胞的PGRMC1mRNA表达量最高(P＜0.05).采用不同浓度促性腺激素(HCG)处理卵巢发育Ⅴ期半滑舌鳎不同时相的卵母细胞,并通过qRT-PCR和Western blotting技术对其表达量变化进行检测.结果显示,20IU/mlHCG对PGRMC1 mRNA和蛋白表达的调控作用比10 IU/ml HCG作用更明显,表明PGRMC1 mRNA和蛋白表达对HCG调控作用存在剂量依存关系.HCG对半滑舌鳎不同时相的卵母细胞的调控作用效果不同,对第Ⅴ时相卵母细胞作用最明显(P＜0.05),表明PGRMC1主要在卵母细胞成熟阶段发挥作用.PGRMC1对HCG调控作用的正向应答效应预示其参与了卵母细胞成熟调控,为进一步探讨PGRMC1在半滑舌鳎繁殖过程的功能提供重要基础资料.     

半滑舌鳎膜孕激素受体基因克隆与组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增（RACE）方法,首次获得全长为1 319bp的半滑舌鳎膜孕激素受体（mPRα）的cDNA序列;将推断的氨基酸序列与其他物种mPRα氨基酸序列进行多重比较分析,发现存在7个跨膜区域。使用MEGA 4.0临位相联法和ClustalX方法对mPRα的氨基酸序列进行聚类分析和序列相似度分析。结果表明,半滑舌鳎mPRα与漠斑牙鲆、大西洋绒须石首鱼以及青鳉等鱼类的mPRα聚为一支,亲缘关系较近,相似度较高,分别为94%、93% 和90%;而与高等哺乳动物人和牛相似性均为53%,亲缘关系较远。应用半定量RT-PCR技术分析了mPRα mRNA在性成熟雌性半滑舌鳎不同组织的表达,结果表明,mPR α mRNA组织表达具有广泛性,但表达量存在差异,在脑、肾、脾和卵巢等组织表达丰富,在肝、胃和肌肉组织表达较弱。     

性成熟雌性牙鲆(Paralichthys olivaceus)新型膜孕激素受体(mPRL)的定性定量表达分析

在牙鲆(Paralichthys olivaceus)繁殖周期,新型膜孕激素受体基因(mPR-Like,mPRL)在脑-垂体-性腺轴的表达变化规律与性腺发育成熟密切相关.为进一步研究牙鲆mPRL作用机制,本研究对其mRNA和蛋白的表达特征进行了分析.应用实时定量PCR方法分析mPRL mRNA在卵子形成过程中的时序表达,发现牙鲆mPRL mRNA相对表达量的最高值出现在性成熟阶段卵巢的Ⅴ时相卵母细胞.原位杂交分析mPRL mRNA在繁殖相关组织中的细胞学定位,发现mPRL mRNA主要分布在牙鲆性成熟阶段卵巢的卵母细胞膜上;在脑组织的神经元附近区域mPRL mRNA阳性信号也较强.制备牙鲆mPRL的多克隆抗体,采用Western blotting方法检测牙鲆mPRL蛋白在不同组织的表达特性,发现mPRL蛋白表达量在卵巢和脑组织中相对较高,在肝脏、头肾、肾脏中表达量相对较少.免疫组化结果显示,牙鲆mPRL蛋白在卵巢和脑组织的细胞学定位与mPRL mRNA定位一致.牙鲆mPRL在繁殖相关组织的表达特征说明其参与卵母细胞成熟的过程,并通过内分泌方式参与牙鲆的繁殖调控.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) gnrh2基因克隆、组织分布及卵巢成熟过程中表达分析

为了研究下丘脑神经肽促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone 2,GnRH2)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵巢成熟过程中的生理作用,本研究通过RT-PCR及RACE方法获得了半滑舌鳎GnRH2全长cDNA序列;通过实时荧光定量PCR(qPCR)对gnrh2 mRNA的组织分布以及卵巢成熟过程中的时空表达特性进行了分析.结果显示,半滑舌鳎GnRH2全长cDNA序列为538 bp(不包括polyA尾),其中,5'非编码区(Untranslated region,UTR)为154 bp,3'UTR为126 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)为258 bp,编码85个氨基酸的前体多肽,其分子量及等电点分别为9.69 kDa和8.55.GnRH2前体多肽由信号肽、GnRH2十肽、酶切位点(GKR)以及GnRH相关肽共4部分组成.序列比对分析发现,GnRH2在鱼类中同源性极高,尤其是十肽(QHWSHGWYPG)在所有硬骨鱼类中完全相同.半滑舌鳎GnRH2与鲈形目同源性最高(89.41％-90.5 9％),其次为鲽形目、鲑形目和鲍形目(78.82％-85.88％),与鲤形目同源性最低(61.18％-71.76％).gnrh2 mRNA主要在脑中表达,在垂体及其他外周组织中表达量极低.此外,组织学分析显示,半滑舌鳎卵巢发育共分为5个时期(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ期).在卵巢成熟过程中,脑gnrh2 mRNA表达量在卵黄生成期(Ⅲ期)显著性增加,达到峰值;随后表达量急剧下降,在成熟期(Ⅴ期)达到最小值;在排卵后期(Ⅵ期)又显著性增加.然而,在卵巢成熟过程中,垂体gnrh2 mRNA表达量在卵黄生成后期(Ⅳ期)显著性降低,随后在成熟期(Ⅴ期)有所增加,但在排卵后期(Ⅵ期)又急剧下降.上述研究结果表明,脑GnRH2可能参与了半滑舌鳎卵巢发育过程.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)黑色素富集激素基因的克隆和表达

为研究黑色素富集激素基因(MCH)表达调控与半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)无眼侧黑化性状的关系,通过分子克隆获得了半滑舌鳎pMCH2,通过NCBI获得了pMCH1 cDNA序列,分析了pMCH mRNA的组织表达特性,探索了脑垂体和皮肤中的pMCH mRNA表达与无眼侧黑化程度的关系.结果显示,pMCHl cDNA序列长476 bp,编码134个氨基酸,与鲽形目、鲤形目和鲈形目鱼类的pMCH1氨基酸聚为1个进化分支.pMCH2 cDNA序列全长为626 bp,编码147个氨基酸,与鲽形目和鲍形目鱼类的pMCH2氨基酸聚为1个进化分支.2种MCH mRNA在垂体中表达量最高,同时,MCH1 mRNA在除肌肉外的其他组织中均可检测到表达;MCH2 mRNA在脑、有眼侧皮肤、无眼侧正常皮肤、性腺和鳃组织中也可检测到较高表达.MCH mRNA表达与无眼侧黑化程度的关系分析显示,脑垂体和皮肤中MCH1 mRNA表现出相似的表达变化趋势,都是10％黑化组的表达量最高,而后随黑化程度加大显著降低.对于MCH2而言,无眼侧正常鱼和无眼侧50％黑化鱼的脑垂体中都具有较高的MCH2 mRNA表达水平,但在无眼侧10％黑化组和无眼侧80％黑化组,其表达水平显著降低.皮肤中MCH2表现出随黑化程度加大而显著升高的趋势.本研究结果可为认识MCH基因与半滑舌鳎无眼侧黑化性状的表达调控关系提供基础资料.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)体表色素细胞观察及POMC表达特性分析

为认识养殖半滑舌鳎无眼侧黑化的细胞学特性,利用显微观察方法研究了其皮肤黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞的形态特征,比较了3种色素细胞在有眼侧皮肤、无眼侧正常和黑化皮肤中的数量分布特征。为进一步揭示无眼侧黑化的分子机制,克隆了半滑舌鳎POMC基因的cDNA序列。结果显示,黑色素细胞较大,含黑色和棕色的色素颗粒,有树突状分枝不明显和延伸成放射状两种形态;黄色素细胞较小,含黄色素颗粒;虹彩细胞最小,含鸟粪素颗粒。半滑舌鳎POMC基因的cDNA序列长910 bp,包括一个114 bp的5?非翻译区和一个154 bp的3?非翻译区,开放阅读框长度为642 bp,共编码213个氨基酸,包含ACTH、α-MSH、β-MSH、γ-LPH、β-内啡肽5个多肽序列,但缺失γ-MSH和大部分连接区。半滑舌鳎POMC基因的氨基酸序列与其他鱼类的同源性为30%?64%。定量PCR分析显示,POMC mRNA主要在垂体中表达,其次是脑、性腺和无眼侧黑化皮肤。正常与黑化皮肤中的差异表达结果显示,无眼侧黑化皮肤中POMC mRNA表达量最高,并与有眼侧皮肤和无眼侧正常皮肤中的POMC mRNA表达量差异显著,揭示了POMC的表达与无眼侧黑化性状密切相关。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)IGF-Ⅱ的体外重组表达

为在蛋白水平认识半滑舌鳎类胰岛素生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)的生理功能,将IGF-Ⅱ成熟肽序列克隆到原核表达载体pET-28a中,成功构建了重组半滑舌鳎IGF-Ⅱ/pET28a质粒,导入到E. coli BL21(DE3)菌株后经IPTG诱导,获得了大小为11.4 kDa的重组IGF-Ⅱ蛋白,N端含6个组氨酸,可特异性地被6×His抗体识别。重组IGF-Ⅱ蛋白在最优诱导条件37℃诱导2 h,目的蛋白表达量占重组表达菌总蛋白的43.7%,重组蛋白主要以包涵体存在。将获得的重组蛋白包涵体经变性、纯化和复性后,获得了纯化的IGF-Ⅱ重组蛋白,其可在体外显著促进人乳腺癌MDA231细胞的增殖,表明IGF-Ⅱ重组蛋白具有体外细胞水平的生物活性。本研究结果可为认识鱼类IGF-Ⅱ生理功能及半滑舌鳎生长调控机制提供理论支撑。     

半滑舌鳎甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1基因的克隆及表达分析

甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1(Mannan-binding lectin associated serine protease 1,MASP1)是补体凝集素途径中起重要作用的激活蛋白。本研究以半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为研究对象,应用RACE技术和实时荧光定量qRT-PCR技术对半滑舌鳎MASP1基因(Cynoglossus semilaevis MASP1,CsMASP1)进行了克隆和表达模式分析。结果显示,CsMASP1基因c DNA序列全长为2507 bp,5′非编码区长82 bp,3′非编码区长142 bp,开放阅读框长2283 bp,共编码760个氨基酸;CsMASP1基因包含13个外显子和12个内含子,与多数已知鱼类的MASP1基因结构一致;SMART分析显示,CsMASP1包含6个结构域,与哺乳动物、鸟类、其他鱼类的结构域一致;同源比对发现,CsMASP1和鱼类的相似度较高,与金目鲈(Latescalcarifer)的相似性最高,为76%。CsMASP1基因在11种健康组织(血液、脑、鳃、性腺、心脏、头肾、肠、肝、皮肤、脾和后肾)中均有表达,其中,在肝、脾和头肾中表达量较高;鳗弧菌(Vibro anguillarum)感染后,CsMASP1基因在6种免疫组织(血液、鳃、头肾、肠、肝和脾)中呈现不同的表达模式,在6种免疫组织中呈现明显的上调表达,肝的表达峰值出现在感染后24 h;脾和鳃的表达峰值出现在感染后6 h;肠、头肾和血液的表达峰值均出现在感染后12h;随着病原菌感染时间增加,基因表达量逐渐降低并恢复至正常水平。研究表明,CsMASP1基因参与了半滑舌鳎的免疫应答过程,本结果为半滑舌鳎的免疫机理研究奠定了基础。     

GnIH多肽对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)下丘脑生殖相关基因表达的影响

本研究首次通过下丘脑离体孵育的方法研究促性腺激素抑制激素(Gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)多肽对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)下丘脑中生殖相关基因的表达调控.研究结果显示,tsGnIH-1促进了gnrh2和gnih的表达,对gnrh3和kiss2的表达无影响;tsGnIH-2抑制了gnrh3的表达,对gnrh2、kiss2和gnih的表达无影响.GnIH多肽对生殖相关基因的不同调控表明同一前体蛋白编码的不同GnIH多肽在生殖调控中的作用不尽相同.本研究结果增加了对GnIH参与鱼类生殖调控机制的认识,为深入研究奠定了基础.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) c-Jun基因的克隆及免疫应答分析

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AP-1家族转录因子c-Jun基因(Jun proto-oncogene)及其在免疫应答中的作用尚无报道.本研究根据半滑舌鳎转录组数据库中预测的c-Jun序列,通过RACE技术和PCR扩增方法获得了半滑舌鳎c-Jun基因cDNA全长2093 bp,CDS区域共981 bp,编码326个氨基酸,5'UTR区域377 bp,3'UTR区域735 bp.SMART分析显示,C-JUN蛋白具有2个结构域:AP-1家族典型结构域Jun,以及高度保守的亮氨酸拉链结构域(BRLZ).经蛋白多序列同源比对、系统进化树分析,发现半滑舌鳎c-Jun与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)c-Jun亲缘关系最近.实时荧光定量PCR分析显示,c-Jun基因在半滑舌鳎不同组织中普遍表达,在卵巢中表达量最高.鳗弧菌(Vibrio anguillarum)人工感染半滑舌鳎后,c-Jun基因在肝脏、脾脏、头肾、小肠、鳃、血液中表达量都出现不同程度上调,其中,鳃中变化最明显:感染12h后表达量达到0h时的13.20倍.使用LPS、PGN、PolyI:C和WGP病原模拟物刺激半滑舌鳎外周血淋巴细胞,结果显示,WGP诱导c-Jun基因上调表达,而LPS与PolyI:C均下调基因表达.以上实验结果表明,c-Jun基因在半滑舌鳎的免疫防御中发挥重要作用.     

半滑舌鳎多聚免疫球蛋白受体(pIgR)基因的克隆和表达分析

本研究根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)基因组数据库中预测的多聚免疫球蛋白受体(Polymeric immunoglobulin receptor, pIgR)序列,通过PCR和RACE技术获得了半滑舌鳎pIgR基因cDNA,全长为1419 bp,开放阅读框(ORF)为1020 bp,编码339个氨基酸,5′UTR区域为109 bp,3′UTR区域为290bp。保守结构域分析显示,半滑舌鳎pIgR蛋白包含1个信号肽,2个免疫球蛋白功能域(Ig-like domain, ILD)和1个跨膜结构域。经蛋白序列同源比对和系统进化树分析,发现半滑舌鳎pIgR与大菱鲆(Scophthalmus maximus)和牙鲆(Paralichthy solivaceus)的pIgR亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,pIgR基因在健康半滑舌鳎的不同组织中均有表达,在鳃中表达较高,在肌肉中表达最低。经哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)病原感染刺激后,pIgR基因在半滑舌鳎的5个组织(肝脏、脾脏、肾脏、肠和鳃)中均呈先上升后下降的趋势,其中,在脾脏和鳃中48 h达到最高值,在肝脏、肾脏和肠中72 h达到峰值。与内脏组织不同的是,pIgR基因在皮肤中呈一直上升的趋势。上述结果表明,pIgR基因在半滑舌鳎抵御哈维氏弧菌的免疫应答中发挥重要作用。     

不同脂肪含量的配合饲料对半滑舌鳎苗种生长的影响

通过不同脂肪含量饲料的对比喂养试验,初步了解半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）对饲料中脂肪含量的需求,使用脂肪含量分别为10.9％、14.2％和16.6％的配合饲料对半滑舌鳎进行了60d的喂养试验.结果表明,用脂肪含量为10.9％的配合饲料喂养的半滑舌鳎生长情况优于其他两种更高脂肪含量的配合饲料....