家蚕溶茧酶基因的克隆、序列分析及原核表达

【目的】获得家蚕溶茧酶基因的全长序列,实现溶茧酶基因在大肠杆菌中的融合表达。【方法】利用cDNA末端扩增技术（RLM-RACE）克隆了家蚕溶茧酶基因cDNA序列（GenBank 登录号：EF428980）。【结果】家蚕溶茧酶基因cDNA序列全长1 047 bp,其中780 bp的蛋白质编码区可编码260个氨基酸,预测蛋白质分子量为27.6 kD,等电点（pI）为8.89。家蚕溶茧酶基因包含4个内含子。用Signal P 3.0 Server程序分析家蚕溶茧酶基因,预测其从第1～22位为信号肽序列。SMART分析结果预测其第34～254位氨基酸序列具有类胰蛋白的丝氨酸蛋白酶活性。重组质粒pET-32a-Cocoonase 转化E.coli BL21进行原核表达,SDS-PAGE分析结果表明,家蚕溶茧酶基因以融合蛋白形式表达,相对分子量为48 kD。【结论】本研究成功地克隆、表达了家蚕溶茧酶基因,分析和预测了它的结构和功能,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。     

猪FAM213B基因mRNA和启动子的克隆及序列分析

【目的】获得猪FAM213B基因完整mRNA和启动子序列,研究猪FAM213B基因表达,为探讨母猪妊娠的建立和胚胎发育调控机制奠定基础。【方法】通过5'RACE和3'RACE技术,获得基因完整mRNA序列,分析不同物种该基因氨基酸序列相似性;通过PCR克隆启动子区,并通过双荧光素酶报告基因载体系统转染猪子宫内膜细胞,研究其转录活性。【结果】猪FAM213B基因mRNA全长808 bp,其中5'UTR、CDS区和3'UTR长度分别为67、609(含终止密码子)和132 bp(不含poly A序列),在17~106位氨基酸之间存在硫氧还蛋白折叠结构域;与猪FAM213B基因其他2个潜在转录本相比,三者都包含硫氧还蛋白折叠结构域,但蛋白三级结构存在较大差异;猪FAM213B氨基酸序列与山羊、牛和绵羊高度相似,相似性分别为94.03%、93.03%和91.54%。克隆获得2 261 bp(-2 231/+30)的基因启动子序列,将其连接至双荧光素酶报告基因载体,转染猪子宫内膜细胞,发现获得的启动子片段能够启动下游报告基因的转录,在启动子区存在潜在的典型NFκB等转录因子结合位点。【结论】本研究获得猪FAM213B基因转录本长度为808 bp,其蛋白存在硫氧还蛋白折叠功能结构域,其启动子序列(-2 231/+30)在猪子宫内膜细胞中具有较强的转录活性。     

番茄匍柄霉SlCmr1基因克隆及其敲除载体的构建

【目的】克隆番茄匍柄霉（Stemphylium lycopersici）SlCmr1基因,并构建SlCmr1基因敲除载体,为研究该基因功能打下基础。【方法】根据NCBI数据库提供的番茄匍柄霉基因组信息设计引物,PCR扩增得到SlCmr1基因的DNA全长和CDS序列,并对SlCmr1基因编码的蛋白进行生物信息学分析。利用SlCmr1基因上、下游1100 bp左右的序列设计引物,分别PCR扩增SlCmr1基因的上、下游片段,通过酶切连接的方法将SlCmr1基因的上、下游序列分别插入载体pCX62,构建SlCmr1基因敲除载体。【结果】SlCmr1基因的DNA全长为3275 bp,CDS长度为3018 bp,有3个内含子,编码蛋白序列全长1005 aa,分子式为C₄₈₈₂H₇₆₄₂N₁₄₀₄O₁₄₉₉S₆₁,分子量为111.94 kD,理论等电点为（pI）6.64,半衰期30 h,不稳定指数58.72,亲/疏水性平均值为-0.424,预测亚细胞定位于细胞核,存在2个相邻的ZnF_C2H2结构域和1个GAL4结构域,推测SlCMR1为不含跨膜区域的非分泌、不稳定可溶性蛋白。分别将SlCmr1基因上、下游序列插入pCX62载体,成功构建了基因敲除载体pCX62-SlCmr1。【结论】SlCmr1可能是真菌调控色素合成的关键基因,在真菌的次级代谢产物合成中发挥重要作用。     

绵羊YAP1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆绵羊YAP1基因cDNA并分析其序列及其蛋白的遗传特性及其在不同组织中不同程度的表达情况。【方法】以湖羊为研究对象,利用RT-PCR和RACE技术获得绵羊YAP1序列,并结合生物信息学方法对绵羊YAP1的序列进行深入分析。【结果】从湖羊背最长肌中克隆YAP1基因的全长cDNA序列;利用生物信息学技术,对绵羊YAP1基因与其它物种的同源性,蛋白质序列的跨膜区,亚细胞定位,亲水性,潜在信号肽剪切位点,糖基化位点,磷酸化位点,编码产物进行功能预测分析,及其编码蛋白的二级结构,三级结构等进行分析。【结论】克隆获得绵羊YAP1基因序列全长为1 712 bp,包括1 212 bp的编码区序列,编码403个氨基酸。同源性分析发现,绵羊YAP1核苷酸序列与推测氨基酸序列与灰仓鼠的同源性最高,分别达到78.77%和92.51%,而与人、黑猩猩的一致性差异较小。氨基酸序列分析发现该基因编码蛋白为水溶性蛋白,相对分子量为44079.0Da,理论等电点为4.91,无信号肽序列和跨膜区;亚细胞定位主要在细胞核,不属于分泌蛋白;预测含有33个磷酸化位点,7个糖基化位点,具有两个WW结构域,二级结构以无规则卷曲为主,三级结构显示,YAP1结构域区构成弯曲状螺旋结构。预测YAP1蛋白主要在调节功能过程中有着关键作用。以上研究为进一步探讨YAP1基因在肌肉生长过程中的功能研究奠定了遗传信息基础。     

绿尾虹雉(Lophophorus lhuysii)Toll样受体5基因的克隆和适应性进化分析

【目的】获得绿尾虹雉(Lophophorus lhuysii)Toll样受体5基因(TLR5)编码区序列,并对其编码区蛋白的特征及适应性进化进行分析。【方法】以绿尾虹雉基因组DNA为模板,采用PCR扩增克隆获得TLR5基因编码区序列。使用MEGA、PAML等软件对其序列特征及选择压力进行分析。【结果】绿尾虹雉TLR5基因编码区序列全长2 583 bp,共编码860个氨基酸,以亮氨酸含量最高(133/860),色氨酸含量最低(11/860)。编码蛋白为典型的Ⅰ型跨膜结构,包括富含LRRs结构域的胞外区、跨膜区和胞内TIR结构域。绿尾虹雉TLR5基因极其保守,与雉鸡(P. colchicus)的同源性最高(97.75%),与小白鹭(E. garzetta)同源性最低(85.17%)。采用位点-特异模型在胞外区共检测到3个正选择氨基酸位点(263F, 280K和645I)。【结论】绿尾虹雉TLR5基因编码区受到较强的纯净化压力,胞外区LRRs结构域可能为识别病原微生物的区域。     

无量山乌骨鸡FSHR基因分离、表达及其蛋白功能分析

【目的】揭示无量山乌骨鸡FSHR基因的结构与功能。【方法】采用RT-PCR法克隆了无量山乌骨鸡FSHR基因的编码区全序列,并利用生物信息学方法对无量山乌骨鸡FSHR基因编码产物的理化特性、结构及功能进行了初步分析,最后采用实时荧光定量分析其组织表达情况。【结果】本研究获得的无量山乌骨鸡FSHR基因编码区全长为2 082 bp,编码693个氨基酸。生物信息学预测显示:无量山乌骨鸡FSHR无N-端信号肽。该蛋白含有3个保守结构域、7个跨膜区和6种功能活性位点。无量山乌骨鸡FSHR二级结构主要由无规则卷曲和α螺旋构成,分别占35.50%和31.17%。氨基酸序列比对显示:无量山乌骨鸡FSHR与其他禽类的同源性在87.4%以上。荧光定量结果显示:该基因在性腺组织中表达量最高,说明该基因与生产性能、繁殖性能等有关系。【结论】FSHR属于G蛋白偶联受体家族,可介导促卵泡作用的发生,可能在转运和结合、信号转导、修饰加工等过程中发挥重要作用。     

盐芥GRP7基因的克隆和逆境表达分析

【目的】从抗逆植物盐芥中分离GRP7(glycine-rich RNA-binding protein7,GRP7)基因,为进一步揭示GRPs基因在盐芥逆境应答中的作用机制及生物学功能奠定基础。【方法】利用盐芥GRP7基因的EST序列设计特异引物,克隆GRP7基因的全长序列,对其保守结构域和系统进化树进行分析,并对TsGRP7基因的启动子区进行预测;利用qRT-PCR技术,检测GRP7基因在不同逆境胁迫、不同组织中的表达情况。【结果】TsGRP7基因编码区全长522bp,编码173个氨基酸;TsGRP7蛋白的N端第9~82位氨基酸之间有1个RNA识别基序(RRM),RRM中含有保守的RNP-1和RNP-2亚结构域;多重序列比对和系统进化树分析表明,盐芥和拟南芥亲缘关系较近;启动子序列分析表明,盐芥GRP7启动子区含有HSE热激响应元件、LTR低温应答元件等多个逆境相关的顺式作用元件,表明盐芥GRP7基因参与逆境响应。qRT-PCR分析表明,盐芥GRP7基因在不同逆境胁迫条件及不同组织中表达不同。【结论】盐芥GRP7基因参与低温、高盐、PEG等逆境响应。     

槟榔江水牛LALBA基因克隆及序列特征分析

【目的】α-乳清蛋白由LALBA基因编码,在乳糖合成中起着重要作用。近年在普通奶牛中发现该基因与泌乳性状关系密切,但在水牛中研究较少。为了揭示水牛LALBA基因的序列特征。【方法】本研究采用RT-PCR测序法对槟榔江水牛LALBA基因的编码区序列进行了克隆和生物信息学分析。【结果】槟榔江水牛LALBA基因的编码区全长429 bp,编码蛋白含142个氨基酸。其α-LA含有1个C型溶菌酶/乳蛋白家族结构域(AA20~138)和1个信号肽序列(AA19~20),无跨膜结构,是胞外分泌的亲水蛋白;其N末端疏水,C末端亲水;有4类功能活性位点。基于LALBA基因编码区序列的系统发育分析表明,槟榔江水牛与牛亚科物种聚在一起,揭示它们LALBA基因功能的相似性。在LALBA基因编码区共检测到5个SNP位点:c.63AG、c.107AG、c.147AG、c.249CT、c.291TC。这些变异位点全部处于Hardy-Weinberg不平衡状态,只有SNP107为异义替换,导致编码氨基酸由天冬氨酸变为甘氨酸。功能分析显示SNP107对槟榔江水牛α-LA功能没有影响。【结论】水牛LALBA基因的序列与其他牛科物种长度相同,其编码产物的结构、功能与其他牛科物种相似。本研究可为进一步研究LALBA基因在水牛泌乳过程中的作用机制奠定基础。     

叶用莴苣热激蛋白90（LsHsp90）基因的克隆及其在热激下的表达

【目的】克隆叶用莴苣热激蛋白Hsp90基因并探讨其响应热胁迫的相关机制,为揭示叶用莴苣抗热分子机制奠定理论基础。【方法】采用同源克隆和RACE 技术相结合,从叶用莴苣叶片总RNA 中克隆LsHsp90 cDNA 序列。通过实时荧光定量 PCR (qRT-PCR) 分析LsHsp90在叶用莴苣耐热品种Z36和热敏品种S106受37℃和42℃热激后叶片的表达差异。【结果】该基因cDNA序列全长2 330 bp,开放阅读框2 097 bp,编码698个氨基酸,推导的蛋白质分子量约79.8 kD。蛋白质结构预测及同源比对分析表明,LsHsp90基因编码蛋白含ATPase位点和Hsp90保守结构域,并与拟南芥（AY081302.1）、紫茎泽兰（EU269070.1）等多种物种的热激蛋白90高度同源;进化树分析表明,LsHsp90与紫茎泽兰Hsp90基因（EU269070.1）聚为一类。qRT-PCR分析表明,37℃热胁迫下,该基因在耐热品种和热敏品种的叶片中均上调表达;42℃高温胁迫下,热敏品种S106 中下调表达,而耐热品种Z36上调表达。【结论】成功从叶用莴苣叶片中分离克隆到LsHsp90,该基因具有已知物种Hsp90基因的特征,该基因在热胁迫下有不同的表达特征,预示该基因其可能在抗高温胁迫中起重要作用。     

毛果杨 RAV/PLC 基因生物信息学分析

【目的】利用生物信息学手段,对毛果杨(Populus trichocarpa)RAV/PLC基因编码蛋白质结构和特征进行预测。【方法】以PLC(Phospholipases C)为关键字在Phytozome数据库搜索毛果杨磷脂酶C基因序列,以RAV/PLC基因及其蛋白质序列为研究对象,利用多种生物信息学分析工具对其基因结构及蛋白功能进行分析。【结果】在毛果杨PLC编码基因中发现了一个可编码RAV和PLC结构域的特殊基因,该基因在Phytozome数据库中编号为Potri.018G109200,ORF区域长度为1 650 bp,编码549个氨基酸,预测分子量为62.72338 ku,理论等电点为9.16;该基因在茎中表达量最高,芽中表达量其次之根和叶中表达量较低。其编码蛋白包含1个AP2结构域、1个B3结构域和1个PLC-X结构域,AP2/B3结构域和PLC-X结构域之间可能存在一个跨膜区;启动子元件分析表明,RAV/PLC基因可能与光应答及激素应答相关;String软件预测RAV/PLC基因可能与MYB103、WRKY49、ABI5、DXS2存在功能关联;KEGG分析表明,该基因主要与RAV转录因子信号通路有关;同时利用同源建模方法获得了RAV/PLC的完整三维模型。【结论】通过对RAV/PLC基因结构和蛋白功能预测,为该基因克隆及参与信号通路分析提供参考。     

甘蓝型油菜乙酰辅酶A羧化酶3个亚基基因的克隆及其表达

[目的]为构建乙酰辅酶A羧化酶的叶绿体表达载体奠定基础。[方法]以从甘蓝型油菜叶片中提取的叶绿体基因组DNA为模板进行PCR扩增,克隆羧基转移酶β亚基基因。以从开花20~29 d后油菜幼胚中提取的总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆生物素羧化酶和生物素羧基载体蛋白的cDNA序列。最后,乙酰辅酶A羧化酶的3个亚基基因被克隆到大肠杆菌表达载体中。[结果]SDS-PAGE分析结果表明乙酰辅酶A羧化酶的3个亚基基因分别被克隆到大肠杆菌表达载体中。乙酰辅酶A羧化酶的3个亚基基因在大肠杆菌中的表达产物分别为76.6、44.0和81.5 kD,其融合蛋白分别占总菌体蛋白的12%、10%和6%。[结论]不同品种的甘蓝型油菜生物素羧基载体蛋白cDNA序列存在较大差异。     

乙酰辅酶A羧化酶的结构·功能及基因的研究进展

乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase,ACCase）属于生物素包含酶类型Ⅰ,在生物体内催化乙酰辅酶A形成丙二酰辅酶A。在植物中乙酰辅酶A羧化酶主要有异质型和同质型2种;在动物中乙酰辅酶A羧化酶属同质型,分为ACC1和ACC2 2种类型。主要介绍了分布于双子叶植物以及非禾本科单子叶植物的质体中的异质型ACCase的亚基组成、结构、功能及其编码基因。ACCase由生物素羧化酶（Biotincarboxylase,BC）亚基、生物素羧基载体蛋白亚基（Biotincarboxyl Camer Protein,BCCP）、羧基转移酶的α-CT亚基和β-CT亚基4种亚基构成,有3个功能结构域,即BC功能结构域、BCCP功能结构域以及CT功能结构域。除β-CT亚基由质体基因编码外,其他亚基由核基因编码,在细胞质中合成后转运到质体中组成功能蛋白,参与脂肪酸的合成。     

油菜脂肪酸延长酶基因fae1片段的克隆与SNP分析

 脂肪酸延长酶基因fae1是调控油菜芥酸合成的关键基因。本研究利用GenBank中的fae1基因序列AF490462为模板设计引物，通过多聚酶链式反应（PCR）从白菜、甘蓝和甘蓝型油菜（包括2个人工合成种）的12个不同品种中扩增出长1 007bp的fae1基因片段。PCR产物经与克隆载体pGEM-T vector连接和序列测定，获得12个品种的fae1基因片段的DNA 序列。对来自12个不同品种的fae1基因序列进行比较分析表明：fae1基因具有高度序列保守性，扩增长度均为1 007 bp，核苷酸序列相似度达98%以上，氨基酸序列的保守性更高。在1007 bp的区间内共发现23个SNP(single nucleotide polymorphism)位点，其中有11个单核苷酸变异导致了编码氨基酸的改变。人工甘蓝型油菜和天然甘蓝型油菜的fae1基因片段未发现明显差异。发现了高芥酸品种与低芥酸品种的fae1基因、以及A基因组与C基因组的fae1基因特有SNP位点。     

二斑叶螨乙酰辅酶A羧化酶基因全长cDNA克隆及其生物信息学分析

【目的】克隆二斑叶螨（Tetranychus urticae）的乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase,ACCase）基因,对其进行生物信息学分析并研究其在二斑叶螨敏感和抗性品系中的表达量。【方法】利用RT-PCR技术克隆ACCase基因的cDNA 全长,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性;利用实时荧光定量 PCR 方法分析ACCase基因在二斑叶螨敏感和抗螺螨酯品系中的表达差异。【结果】ACCase基因（GenBank 登录号：JX424763）的开放阅读框长度为7 068 bp, 编码2 235个氨基酸,分子量约为266.35 kD,理论等电点为6.38,包含典型的生物素羧化酶（biotin carboxylase,BC）、生物素羧基载体蛋白（biotin carboxyl carrier protein,BCCP）和羧基转移酶（carboxyltransferase,CT）3个结构域。结合其它物种ACCase基因构建系统发育树表明,该基因与体虱（Pediculus humanus corporis）ACCase基因具有较高的同源性。实时荧光定量 PCR 结果表明,ACCase基因在抗螺螨酯品系中的相对表达量较高,与明感品系间存在显著差异。【结论】利用RT-PCR技术在二斑叶螨中克隆到ACCase基因,ACCase基因的过量表达可能与二斑叶螨对螺螨酯的抗性形成有关,为二斑叶螨的抗性治理提供了依据。     

Cloning and Molecular Identification of A Fatty Acid Desaturase 2 Gene in a and C Genome of Brassica Species

The fatty acid desaturase 2 (fad2) gene was proven to be a major locus for high oleic acid (C18:1). Brassica napus is an amphidiploid species originating from a spontaneous hybridization of Brassica rapa and Brassica oleracea. B. napus contains multiple copies in genome for most of the genes, including fad2 genes. The research cloned nine fad2 genes from 3 varieties of B. rapa and 3 varieties of B. oleracea, respectively. Alignment of the nine fad2 sequences from B. rapa and B. oleracea detect-ed 6 single nucleotide polymorphic sites, which resulted in 6 amino-acid substitutions. The nucleotide substitutions at position 743 bp in the fad2-A gene and position 947 bp in the fad2-C gene were used as 3’ end of al ele-specific primers. In use of the al-lele-specific primers to amplify fad2 gene, we could identify if the fad2 gene originated from A genome or C genome. Besides, the research found that fad2 genes in C genome are more conserved in evolutionary process than those in A genome. The fad2 expression data reported in this study revealed that fad2-A from B. rapa was not only expressed in siliques same as fad2-C from B. oleracea, but also expressed in a high level in stems. Not even the less, fad2 gene from B. napus was expressed higher in roots and flowers. Al these results provided evidences that fad2, though it was expressed differently in B. rapa and B. oleracea, but it was regulated by the same approach in B. napus.     

甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体构建

[目的]为研究质体定位的乙酰辅酶A羧化酶转化叶绿体奠定基础。[方法]根据GeneBank上的甘蓝型油菜的叶绿体DNA序列设计1对引物,通过PCR扩增获得与甘蓝型油菜叶绿体基因组可发生同源重组的DNA片段,构建甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体,并在大肠杆菌中通过平板定性分析和Western印迹对所构建载体上的表达盒进行功能鉴定。[结果]以甘蓝型油菜的叶片叶绿体基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得4 357 bp的DNA片段,包含2个开放阅读框RbcL和β-CT。成功构建了甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体pHBM720,而且同一多顺反子的3个基因均在大肠杆菌中得到表达。[结论]该叶绿体多顺反子单交换表达载体具有较强的通用性与安全性,比双交换表达载体更具优越性。     

RACE方法在甘蓝型油菜基因克隆中的应用

将Invirtogen公司开发的一种RACE技术应用于甘蓝型油菜基因家族成员的克隆,克隆了查尔酮异构酶基因家族的全部6个成员和类黄酮3′-羟化酶基因家族的2个成员。应用结果表明:该方法具有低成本、高效率、能克隆全长基因的特点,适合甘蓝型油菜等多倍体物种基因家族成员的克隆。     

油菜PEP基因的克隆及PEP反义基因的构建

丙酮酸羧化酶（ Ｐ Ｅ Ｐ）是控制油菜蛋白质／油脂含量比例的一个关键酶⒚本研究用 Ｐ Ｃ Ｒ 法扩增出了 Ｐ Ｅ Ｐ 基因片段,并将其 克隆到 ｐ Ｂ Ｓ Ｓ Ｋ＋ 的 Ｓｍ ａ Ⅰ位点⒚ Ｄ Ｎ Ａ 序列分析表 明克隆片段 的长度为 ５３０ｂｐ,其序列与报道序列相同⒚将该 Ｐ Ｅ Ｐ基因 片段反向插入 ｐ Ｉ Ｇ１２１ 质粒,构建了带 Ｐ Ｅ Ｐ 反义基因的超级双元载体并进行油菜的转化,目前已获得转基因植株⒚     

甘蓝SRK底物蛋白基因的克隆与序列分析

采用PCR、3’RACE以及其他分子生物学方法,以甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对SSP基因进行扩增克隆,得到长度分别为778 bp和825 bp的基因片段。序列分析表明,甘蓝SSP基因不包含内含子,SSP核苷酸序列与拟南芥肽酶M28家族蛋白有同源性,序列相似性达到67.4%,两者的氨基酸序列相似性达到62.7%,而且都含有一个TFR_dimer结构域,推测SSP蛋白极有可能与在自交不亲和过程中受ARC1作用而泛素化了的某一未知蛋白的降解相关。     

夏枯草RuBPCase大亚基基因的克隆与表达

为从夏枯草中克隆参与光合作用和光呼吸代谢的关键酶RuBPcase大亚基基因rbcL,为今后研究夏枯草RuBPcase的结构和功能以及从分子水平探讨夏枯草的光合作用机理提供必要的基础数据,以夏枯草基因组DNA为模板,采用PCR法对夏枯草RuBPCase大亚基基因(PvrbcL)的克隆与表达进行研究。结果表明:PCR法扩增出夏枯草RuBPcase大亚基基因片段PvrbcL,基因长837bp,编码278个氨基酸,GenBank登录号为JN 692563;经BLAST序列比较,夏枯草PvrbcL基因核苷酸序列与大花夏枯草、鼠尾草、烟草、大豆、水稻、菜豆、葡萄、油菜的相似性为86%～100%,氨基酸同源性为92%～100%;Northern杂交分析表明,PvrbcL基因在夏枯草叶和茎中表达,且在叶中的表达量最大;发育表达模式结果显示,Pvr-bcL基因的表达量随着叶片的生长而增加。PvrbcL基因的克隆和表达模式分析为进一步研究夏枯草RuB-Pcase的结构和功能奠定了基础。