番茄黑环病毒RT-LAMP检测方法的建立

为了快速有效地检测出植物样品中的番茄黑环病毒(tomato black ring virus,TBRV),根据TBRV的保守序列设计RT-LAMP反应的特异引物,通过试验成功建立了TBRV的RT-LAMP特异性检测方法。该方法检测快速,约27 min即可检测到扩增曲线;特异性强,可有效区分同样侵染马铃薯的马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯Y病毒(PVY)、番茄斑萎病毒(TSWV)及番茄环斑病毒(ToRSV);灵敏度高,比普通RT-PCR灵敏度至少高10倍;并可通过肉眼观察反应颜色的变化直接进行结果判断。该方法适用于TBRV的快速检测。     

环介导等温扩增技术检测菊花中番茄不孕病毒

【目的】环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术。本研究拟用该技术建立菊花中番茄不孕病毒(TAV)的检测方法。【方法】设计能识别TAV CP序列6个特定区域的4种LAMP特异引物,对MgCl2、dNTPs、甜菜碱等LAMP反应条件进行优化,利用新建的LAMP法检测TAV,比较LAMP和RT-PCR2种不同方法的检测灵敏度。【结果】建立了检测番茄不孕病毒的LAMP技术;LAMP比RT-PCR具有灵敏度更高、快速、简便等优点。【结论】建立的LAMP技术能快速、准确、简便地检测出菊花中的番茄不孕病毒。     

同步检测为害非洲菊3种病毒的多重RT-PCR方法研究

以接种番茄斑萎病毒(TSWV)的烟草和侵染烟草脆裂病毒(TRV)及烟草花叶病毒(TMV)的非洲菊为试验材料,建立了同步检测非洲菊上述3种病毒的多重RT-PCR方法.结果表明,建立的多重RT-PCR方法可一次性扩增出 3 种病毒的DNA条带,可以从RNA含量1 mg的带毒叶片中检测到混合病毒;同时对单一病毒RT-PCR的灵敏度检测表明:最低可以从RNA含量分别为1 mg、10μg和100 ng的带毒材料中检测到TSWV、TRV和TMV.     

胶体金免疫层析试纸结合RT-PCR法快速检测烟草环斑病毒

利用烟草环斑病毒胶体金免疫层析检测试纸条,对烟草环斑病毒3个分离物进行了快速检测。结果表明,试纸条在10min内,可特异性检出烟草环斑病毒的3个分离物,对番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒、番茄黑环病毒和健康叶片无反应。剪下试纸条上显示的检测带,进行RT—PCR,能扩增到与预期大小相同的DNA条带。试纸条检测烟草环斑病毒粗提纯液,检测灵敏度在1μg·mL^-1,试纸条检测烟草环斑病毒的病汁液,检测灵敏度在10^-3（W／V）,试纸条检测灵敏度与DAS—ELISA方法灵敏度基本相同。     

番茄不孕病毒实时荧光RT-PCR检测方法研究

番茄不孕病毒(tomato aspermy vires,TAV)是危害我国菊花生产的主要病毒之一.本研究根据该病毒外壳蛋白北京分离物的基因,设计特异性引物与荧光探针,建立了基于TaqMan探针的实时荧光RT-PCR检测方法.该方法与DAS-ELIAS相比,检测灵敏度提高了约1 000倍,重复性试验表明批内与批间变异系数均在5%以内,整个检测过程仅需2 h,是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、快速有效的TAV检测方法.     

Dot-ELISA和RT-PCR检测南方水稻黑条矮缩病毒灵敏度的比较

南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是近年来在我国南方稻区和越南危害严重的一种新病毒,主要由白背飞虱传播,造成水稻大面积减产。检测田间白背飞虱、杂草和水稻植株的带毒率是南方水稻黑条矮缩病预测预报的基础。为寻找一种适合大量样本的检测方法,以感染南方水稻黑条矮缩病毒的水稻植株和带毒的白背飞虱为材料,比较了斑点免疫测定法(Dot-ELISA)和反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)两种检测方法的灵敏度。试验结果表明:RT-PCR技术的检测灵敏度比Dot-ELISA技术检测灵敏度高。     

鸢尾黄斑病毒免疫磁珠RT-PCR检测方法的建立及应用

鸢尾黄斑病毒是近年新发现的番茄斑萎病毒属的一个种,目前国内还没有发生、危害的报道。试验以带有鸢尾黄斑病毒的烟草叶片为材料,建立了免疫磁珠RT-PCR高灵敏度的检测方法。通过抗体包被、吸附特异性及灵敏度比较等试验,确定了免疫磁珠在样品处理中的作用。免疫磁珠RT-PCR方法最低可检测稀释至10~(-6)的病汁液,灵敏度比免疫捕获RT-PCR高10倍,比磁珠直接吸附RT-PCR高10~4倍。这一结果表明免疫磁珠用于样品处理,可大大增加病毒吸附效率,提高检测灵敏度。应用该方法检测进境葱类种子及田间大葱、洋葱等样品150份,结果均未检出。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒分子检测方法的建立与评价

以接种黄瓜绿斑驳病毒的黄瓜种子为材料,分别建立了快速检测黄瓜绿斑驳病毒的多种PCR方法.实验结果表明,这些方法的灵敏度都比DAS-ELISA的灵敏度高,其中实时荧光RT-PCR的灵敏度最高,可检测到2 ng黄瓜种子中的黄瓜绿斑驳花叶病毒.普通RT-PCR最低可检测到200 ng黄瓜种子中的黄瓜绿斑驳花叶病毒,免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)的灵敏度是普通RT-PCR的2倍,而免疫磁珠RT-PCR(IMS-RT-PCR)是普通RT-PCR的4倍.     

以cytC基因为靶标的LAMP快速检测番茄溃疡病菌方法的建立

以番茄细菌性溃疡病病菌的特异性基因cytC为检测靶标,以番茄溃疡病病菌等8种病原细菌为供试菌株.根据检测靶标设计环介导等温扩增(LAMP)引物并进行特异性和灵敏度检测.结果显示,引物cytC-170能特异性检测出番茄溃疡病病菌,检测灵敏度高达5×105 copy/μL,环引物的加成将试验进程缩短为33.06 min,使整个反应控制在50 min内.研究建立的LAMP检测方法操作简单,结果可视,非常适用于番茄细菌性溃疡病病菌的现场快速检测.     

RT-LAMP 及RT-PCR 方法快速检测玉米褪绿斑驳病毒的比较与应用

利用玉米褪绿斑驳病毒外壳蛋白基因为靶标序列设计引物,通过优化反应温度、引物浓度、反应时间以及评价环引物效果,建立了检测玉米褪绿斑驳病毒反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)方法,并与RT-PCR方法比较。结果表明,RT-LAMP在64℃等温条件下反应45min,最低可检测到280fg的目的片段,灵敏度是RT-PCR的100倍。以甘蔗花叶病毒、玉米矮花叶病毒、小麦线条花叶病毒、玉米白线花叶病毒及玉米褪绿斑驳病毒等5种病毒为检测对象,证明该方法针对玉米褪绿斑驳病毒具有很强的特异性。利用RT-LAMP方法对100份模拟病毒感染的玉米种子进行检测,病毒检出率为100%。     

Viral Diseases and Rehabilitation of Honeysuckle (<Emphasis Type="Italic">Lonicera caerulea</Emphasis> L.) Plants

The prevalence of viruses in honeysuckle plants depends on the location of the plantation and the variety composition. TBRV virus had the maximal prevalence (28–60%) in most blue-berried honeysuckle stands. Prevalence of the ArMV virus ranged from 0 to 26%, that of the RpRSV virus ranged from 6 to 17%, and that of the SLRSV virus ranged from 7 to 25%. Most varieties of honeysuckle (67%) were infected with a complex of viruses, whereas no viruses were detected in certain varieties. The varieties produced at the Lisavenko Research Institute for Selection and Seedage had a higher degree of viral infection than those produced at the All-Russia Vavilov Research Institute of Plant Breeding. The viruses found in blue-berried honeysuckle plants were mostly in the latent form, but green leaf mottle and interstitial chlorosis were observed on individual bushes from a number of varieties. A tendency for virus infection accumulation with the extension of plant life was observed. TBRV and SLRSV transmission through seeds was registered, which is indicative of the need for improvement of the hybrid forms involved in the breeding process. The duration of dry air thermotherapy of honeysuckle plants should not exceed 30–45 days. Combined use of thermotherapy and meristem culture provided for an 80% yield of healthy plants.     

花生矮化病毒3种PCR检测方法的建立和比较

建立了花生矮化病毒（PSV）普通RT-PCR、SYBR Green I荧光RT-PCR和免疫捕获RT-PCR检测方法,并比较了它们的检测灵敏度。结果表明,以阳性对照为样品,普通RT-PCR灵敏度达到10-4,SYBR Green I荧光RT-PCR和免疫捕获RT-PCR的检测灵敏度相当,相对灵敏度均可达到10-6;检测混有PSV的大豆叶片样品,普通RT-PCR灵敏度为10-1,SYBR Green I荧光RT-PCR和免疫捕获RT-PCR的检测灵敏度为10-5;SYBR Green I荧光RT-PCR和免疫捕获RT-PCR方法比直接RT-PCR灵敏度高至少100倍,尤其在带毒植物叶片检测中优势更明显,而且灵敏、简便、同时重复性好。     

嗜水气单胞菌的检测方法比较

[目的]比较实时荧光定量PCR法、PCR法及细菌培养法检测嗜水气单胞菌的灵敏度与特异性。[方法]在常规PCR法的基础上设计并建立了实时荧光定量PCR法,并采用该法与常规PCR及传统细菌培养法3种方法同时对嗜水气单胞菌进行检测与比较。[结果]实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达12.5 cfu/ml,达到了只需13个细菌就可得到阳性结果的灵敏度,具有很高的特异性,且检测速度快,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右,比传统细菌培养法和常规PCR法所需时间大大缩短。实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染。[结论]实时荧光定量PCR检测是3种方法中最为快速敏感的方法,是一种比较实用的嗜水气单胞菌的检测方法。     

Force detection of nuclear magnetic resonance

Micromechanical sensing of magnetic force was used to detect nuclear magnetic resonance with exceptional sensitivity and spatial resolution. With a 900 angstrom thick silicon nitride cantilever capable of detecting subfemtonewton forces, a single shot sensitivity of 1.6 x 10(13) protons was achieved for an ammonium nitrate sample mounted on the cantilever. A nearby millimeter-size iron particle produced a 600 tesla per meter magnetic field gradient, resulting in a spatial resolution of 2.6 micrometers in one dimension. These results suggest that magnetic force sensing is a viable approach for enhancing the sensitivity and spatial resolution of nuclear magnetic resonance microimaging.     

呋喃西林代谢物酶联免疫检测方法的建立

[目的]建立动物性食品中呋喃西林代谢物ELISA检测方法。[方法]通过制备特异性强的单克隆抗体,采用间接竞争ELISA法建立动物性食品中呋喃西林代谢物ELISA检测方法,并研制出对动物性食品中呋喃西林代谢物残留检测的试剂盒。[结果]该试剂盒标准曲线的IC50值为0.267 7μg/L,最低检测限为0.1μg/kg,样本加标回收率范围为79.5%～95.6%,变异系数为7.6%～9.7%。在交叉反应试验中,对呋喃西林的交叉反应率为25%,与其他药物的交叉反应率均小于1%,表明该方法具有很强的特异性。[结论]该方法灵敏度、准确度、精密度均较高,能满足兽药残留的检测要求,且检测时间短(45 min),样本前处理简单、检测成本低,适合于大量样本中呋喃西林代谢物残留检测的快速筛选。     

顶空气相色谱法测定食用植物油中残留溶剂及平衡条件的研究

在顶空气相色谱法测定食用植物油中的残留溶剂的基础上,对残留溶剂顶空分析的平衡条件进行研究。研究结果表明:顶空分析的灵敏度与平衡温度、平衡时间所决定的气相提取效率有关;在一定温度范围内组分的峰面积随平衡温度的增加呈指数规律递增,提高平衡温度有利于提高检测的灵敏度;平衡时间对平衡的影响效果不及平衡温度显著。     

大豆叶片及种子内大豆花叶病毒(SMV)的生物与免疫测定方法的比較

用生物测定(局部枯斑反应)、免疫吸附电镜(ISEM)、酶联免疫吸附试验(ELISA)三种方法对大豆叶片及种子内的SMV进行了定性定量测定。结果表明,三种方法均可用来检测叶片及种胚和子叶内的SMV,并可对其定量,结果高度吻合,相关系数达0.97以上。ELISA能测出稀释2430—7290倍病叶中的SMV,测提纯病毒的下限为70ng—20ng/ml,生物测定可测出稀释640—1280倍病叶中的SMV。种皮内含有非侵染性SMV,不能用生物方法测出,而需用免疫方法检测。     

牛呼吸道合胞体病毒重组N蛋白间接ELISA方法的建立及应用

 【目的】以纯化的牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)HJ株重组N蛋白作为包被抗原,对各项条件进行优化,确定判定标准,建立检测BRSV抗体的间接ELISA方法。【方法】将已构建的重组菌BL21(DE3)进行诱导表达,获得重组N蛋白。利用电洗脱法对表达产物进行纯化,并用Western blot对表达产物进行鉴定。以纯化后的重组N蛋白作为诊断抗原,对ELISA反应条件进行优化,初步建立检测BRSV抗体的间接ELISA诊断方法。【结果】成功表达并纯化了BRSV HJ株重组N蛋白,Western blot检测结果证明表达产物具有良好的反应原性。以重组N蛋白作为诊断抗原,建立了间接ELISA诊断方法。交叉试验结果表明重组N蛋白与牛无浆体病(Anaplasmosis)、牛传染性鼻气管炎(IBRV)和牛副流感(BPIV)阳性血清均不发生交叉反应。与中和试验(SNT)相比较,该方法的特异性、敏感性和符合率分别为85.0%、90.9%和87.7%。采用本试验建立的间接ELISA方法对黑龙江省的牡丹江、佳木斯、鹤岗和大庆4个地区牛场的600份牛血清进行了检测,结果表明,黑龙江省部分地区BRSV的抗体阳性率为27.33%。【结论】本研究建立的间接ELISA方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,利用该方法初步证实黑龙江省部分地区存在牛呼吸道合胞体病。这一研究为牛呼吸道合胞体病诊断试剂盒的研制奠定了基础,并为该病的诊断与流行病学调查提供有效的技术手段。