三重PCR检测黄瓜靶斑病菌、炭疽病菌和细菌性角斑病菌

【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)和黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)的三重PCR快速检测方法。【方法】根据ITS或16S r DNA序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物;通过鉴定引物的特异性,筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物;选择可以组合的3种病原菌特异性引物进行三重PCR,对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化,优化三重PCR体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌分别设计出5对、7对和6对特异性引物,其中引物CC4F/CC4R和CC5F/CC5R可特异扩增黄瓜靶斑病菌ITS,引物CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特异扩增黄瓜炭疽病菌ITS,引物PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特异扩增黄瓜细菌性角斑病菌16S rDNA。引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R扩增片段长度分别为370、275和698 bp,其混合扩增产物可在3%琼脂糖凝胶上得到充分分离,这3对引物选择作为三重PCR引物。在三重PCR反应体系中,当引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R的终浓度分别为0.16、0.4和0.16μmol·L~(-1)时,3个目的片段能同时得到有效扩增;当退火温度大于65℃时,部分目的片段不能有效扩增。最终建立并验证了适合上述3种黄瓜主要病原菌的三重PCR检测体系,即25μL PCR反应体系中含有12.5μL 2×Hiff~(TM) PCR Master Mix(With Dye)、0.16μmol·L~(-1) CC5F/CC5R、0.4μmol·L~(-1) CL3F/CL5R、0.16μmol·L~(-1) PS3F/PS4R。反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,65℃退火30s,72℃延伸2 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。【结论】建立的三重PCR方法能够快速检测田间采集的黄瓜发病叶片中的黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌,灵敏度均可达到0.4 pg·μL~(-1)。     

小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)的RT-PCR检测

小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）是葫芦科作物上的一种重要病毒,近几年来已成了我国葫芦科作物上的一种重要病原物。根据已知的ZYMV基因组序列分别设计了2对特异性引物,在优化RT—PCR条件的基础上,成功建立了ZYMV的RT—PCR检测方法。引物ZYM1／ZYM2用于扩增整个CP基因序列（片段长度949bp）,而引物ZYM3／ZYM4用于扩增部分CP基因序列（片段长度449bp）,其中,引物ZYM3／ZYM4的检测灵敏度比引物ZYM1／ZYM2的检测灵敏度高。把所建立的方法用于南瓜（Cucurbita moschata）、丝瓜（如如cylindrica）病叶的检测,结果在这些病叶中也检出ZYMV。因此,该方法可用于ZYMV的快速、灵敏检测及分子流行病学的调查研究。     

PCR技术在印度腥黑穗病菌检测和鉴定中的应用

利用2对小麦印度腥黑穗病菌（Tilletia indica Mitra)特异性引物（Tin3/Tin4,F3／R1）和2对黑麦草腥黑穗病菌T.walkeri特异性引物（Tin7/Tin8,Tin11/Tin4)建立快速鉴定T.indica及其近似种T.walkeri的PCR程序。引物Tin3/Tin4,F3/R1可特异性扩增T.indica分别得到415bp和498bp产物,扩增T.walkeri无产物;引物Tin/Tin8,Tin11/Tin4可特异性 扩增T.walkeri得到391bp和415bp产物,扩增T.indica无产物。4对引物扩增T.horrida、T.controversa和T.laevis无产物。产物片段的测序验证了PCR反应的可靠性。为进口粮检疫中T.indica的鉴定提供了快速、简便、实用的PCR诊断技术。     

利用PCR技术特异性检测人参恶疫霉菌等6种疫霉菌

为了建立能同时检测人参恶疫霉菌（Phytophthora cactorum）等6种疫霉菌的快速检测方法,以期为病害的发生预测和早期诊断技术提供依据。通过比较基因组学分析,根据恶疫霉菌等疫霉菌属的6个种共有基因设计引物,通过PCR方法筛选特异性引物,并对引物的特异性、灵敏度和应用可行性进行验证。结果表明：筛选到了1对用于检测疫霉属6种病菌的常规PCR特异性引物YB-00394F/YB-00394R,采用优化的PCR扩增体系和反应条件进行扩增,筛选到的特异引物分别从疫霉属的6个种中扩增出386 bp大小的条带,而其他非疫霉属真菌无扩增条带。常规PCR法对人参恶疫霉菌基因组DNA检测的灵敏度为100 fg/μL,应用PCR方法成功快速的在62份植物样本和95份土壤样本中检测到了目标疫霉病菌。建立的常规PCR方法可以快速灵敏地检测6种疫霉属的真菌。     

西瓜炭疽病菌Colletetrichum orbiculare的分子检测

【研究目的】探索西瓜炭疽病菌(Colletetrichum orbiculare )的分子检测技术，为西瓜、甜瓜等生长期和采后炭疽病的快速、准确鉴定和检测提供技术和方法。【采用的主要方法和研究结果】根据GeneBank中Colletetrichum属的24个种的ITS系列，比较设计出一对引物CY1/CY2，可以特异的从西瓜炭疽病菌C. orbiculare和菜豆炭疽病菌C. lindemuthianum菌株中扩增到一条442bp的条带，将这两个种的炭疽菌和其它菌分开。进一步利用RAPD随机引物扩增C. orbiculare和C. lindemuthianum，找出在C. orbiculare中的特异性条带，经过克隆、测序后，设计出一对SCAR引物RB/RC，可以特异的在C. orbiculare中扩增出一条216bp的条带，将C. orbiculare和C.lindemuthianum分开。采用两对引物组成双重PCR，能够将C. orbiculare和其它相关和近似菌株分开。【主要结论】利用上述两对引物组成双重PCR检测体系，可以快速鉴定C. orbiculare，并且能够直接在植物组织中将西瓜炭疽病菌C. orbiculare检测出来，灵敏度可以达到1pg/μl。     

检测和鉴别流产布鲁氏菌与猪布鲁氏菌的复合PCR方法的建立

将GenBank上登录的流产布鲁氏菌（Br.abortus）和猪布鲁氏菌（Br.suis）外膜蛋白omp2基因序列进行比对,设计了流产布鲁氏菌特异性引物对A1/A2、猪布鲁氏菌特异性引物对S1／S2,分别用引物A1/A2和S1／S2进行PCR,进而将引物A1、A2、S1、S2置于同一体系内进行复合PCR,建立了一种能区分流产布鲁氏菌和猪布鲁氏菌的复合PCR鉴别诊断方法。应用该方法从流产布鲁氏菌和猪布鲁氏菌染色体基因组中扩增出了大小分别为424bp和535bp的1条特异性片段,从两种染色体基因组混合物中扩增出了大小为424bp和535bp的2条特异性片段。但对大肠杆菌、结核杆菌、坏死杆菌、棒状杆菌染色体基因组进行PCR扩增时均为阴性。该方法可以检测出10个菌／50阻L体系。本研究建立的复合PCR可以有效检测布鲁氏菌感染并把流产布鲁氏菌和猪布鲁氏菌区分开。     

实时荧光定量PCR定量检测山核桃干腐病病菌潜伏侵染量方法的建立

由茶麋子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea引起的山核桃Carya cathayensis干腐病是山核桃栽培过程中的主要病害,该病菌表现明显的潜伏侵染特性。研究山核桃树体中干腐病菌的定量检测技术对山核桃干腐病的预测预报及科学防治具有重要的指导意义。根据茶麋子葡萄座腔菌的EF1基因设计特异性引物,通过普通聚合酶链式反应（PCR）和实时荧光定量PCR（real-time PCR）扩增发现引物EFRT-F1/R1对山核桃干腐病病菌的特异性及扩增效率较高,可稳定扩增出230 bp的目标条带。应用此特异性引物建立的实时荧光定量PCR干腐病病菌检测方法能够定量检测出山核桃植株样品中的病菌含量,灵敏度要比普通PCR高100倍。图6参8     

利用PCR技术专化性检测瓜类细菌性果斑病菌

将hrpB2基因作为检测靶标,根据hrpB2基因设计了1对特异性引物HB2F2/HB2R2,用此特异引物从瓜类细菌性果斑病菌菌株中扩增出290 bp的特异性片段,而其余参试菌株和甜瓜组织的PCR反应结果为阴性,灵敏度试验证明可以检测到103CFU/ml靶标菌体。对市售的17个品种的甜瓜种子进行PCR检测,其中4个品种检测出携带有瓜类细菌性果斑病菌。将hrp基因作为靶标,为快速检测瓜类细菌性果斑病菌提供了新的方法。     

基于ITS序列大豆茎褐腐病菌的PCR鉴定

提取了分别来自11个种共13株真菌(都是大豆上的常见病害的病原菌)的DNA.采用ITS序列扩增通用引物对其进行PCR扩增,并对大豆茎褐腐病菌的PCR产物进行测序.根据所得大豆茎褐腐病菌与其常见易混淆品所在属在ITS区的基因序列比较分析,设计并合成了1对特异性引物.采用此对引物,只有大豆茎褐腐病菌能扩增出500 bp条带,检测的灵敏度达到4.2 pg/μL.将此对引物应用于人工接种大豆茎褐腐病菌大豆的检测,结果表明,此方法能够成功区分大豆茎褐腐病菌及其近似种.     

布鲁氏菌病病原快速检测方法的建立

根据编码牛种布鲁氏菌外膜蛋白（OMP-2）基因的核苷酸序列设计1对PCR引物,并对PCR扩增条件进行优化,建立了快速检测布鲁氏菌病病原的PCR方法。特异性检测表明,该引物对牛种、羊种、猪种布鲁氏菌制备的模板DNA均能扩增出193bp目的基因片段,但不能扩增大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠结肠炎耶氏菌（0：9型）的目的基因片段;敏感性检测显示,乳样的检测灵敏度达50cfu／mL、纯化的布鲁氏菌DNA检测灵敏度达1．5pg,可重复性和稳定性十分理想。可见,该布鲁氏菌病病原PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,能为快速诊断布鲁氏菌病提供技术支撑。     

红掌毁灭炭疽菌的分子检测

根据GenBank中炭疽属Colletotrichum不同种的ITS序列差异,设计了毁灭炭疽菌Colletotrichum destructivum的特异性引物F1/ITS4,由此建立的PCR检测体系可以从80个毁灭炭疽菌菌株中扩增得到1条486 bp的特异性条带,而扩增其他近似或相关种的菌株时没有相应的特异性条带.该...     

2种PCR方法扩增大豆rbcS启动子5'侧翼序列比较

比较了扩增已知序列5’侧翼序列的2种PCR方法.方法一是反向PCR (IPCR),以大豆基因组酶切后的DNA片段自身环化产物做模板,用2对特异引物反向扩增大豆rbcS启动子5'侧翼序列.方法二是热不对称交错PCR(rAIL- PCR),以大豆基因组DNA为模板,用3个巢武特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环...     

番茄白粉菌的PCR分子检测

根据番茄白粉菌核糖体DNA的ITS(internal transcribed spacer)序列的特异性,设计2对引物OidF1/R1、OidF2/R2,对番茄白粉菌进行了PCR特异性扩增试验。结果表明:2对引物都可以从番茄白粉菌基因组DNA中扩增出350 bp左右的特异性扩增产物,并具有专一性,只在白粉菌和接种感病组织DNA中有扩增条带,而番茄早疫病菌、叶霉菌以及健康组织DNA中均无特异性扩增片段;引物具有高度的灵敏度,可以检测含有1 ng的番茄白粉菌DNA。由此证明,该方法可快速、准确和灵敏地鉴定和检测番茄白粉病的发生。     

赛加羚羊的分子生物学鉴别

为了解决以往赛加羚羊(Saiga tatarica)鉴别方法存在的不确定性或分辨率低的问题,在mtDNA的12S rRNA基因易变区设计了2对赛加羚羊特异性引物Saiga A和Saiga B,通过PCR扩增和常规电泳检测,分别得到127 bp和320 bp的片段,进而可通过这两个片段的有无来特异性检出赛加羚羊的DNA。引物Saiga A和Saiga B的最小检出量为1．0 ng DNA,稳定性和特异性好、灵敏度很高,可以应用于赛加羚羊样品的检测。     

三重PCR检测草莓灰霉病菌、炭疽病菌和黄萎病菌

【目的】探索和优化检测条件,建立同时检测草莓灰霉病菌Botrytiscinerea,炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides和黄萎病菌Verticillium dahliae的三重PCR检测体系,为3种病害的早期快速诊断和鉴定提供技术和方法。【方法】选择可以组合的3种病原菌特异引物,研究多重PCR的影响因素,优化PCR退火温度,采用正交试验方法,以3个引物组、TaqDNA聚合酶、dNTP和Mg2+六因素三水平优化多重PCR体系。【结果】建立并验证适合上述草莓主要病原菌的三重PCR最佳检测体系,可分别扩增出729、539和450bp的特异条带,最适退火温度为50℃,25μL的反应体系中含有0.32μmol·L-1C729+/-、0.032μmol·L-1DB19/DB22、0.32μmol·L-1CgInt/ITS4、1.5UTaq聚合酶、0.15mmol·L-1dNTP、1.6mmol·L-1MgCl2。【结论】利用上述引物组合和反应体系进行三重PCR检测,能够快速从田间发病植株和土壤中将草莓灰霉病菌、草莓炭疽病菌和草莓黄萎病菌检测出来,灵敏度可以达到10pg菌丝DNA。     

用SSR标记和巢式PCR快速检测大豆疫霉菌

 【目的】建立快速、准确的大豆疫霉菌检测和病害早期诊断分子技术。【方法】基于大豆疫霉菌SSR标记Psc239设计两对引物Psc239EF/Psc239ER和Psc239F/Psc239R,建立特异性检测大豆疫霉菌的巢式PCR方法。【结果】用36个大豆疫霉菌分离物和25个其他卵菌和真菌分离物基因组DNA评价引物及巢式PCR的专化性,引物对Psc239EF/Psc239ER、Psc239F/Psc239R和巢式PCR反应只在大豆疫霉菌中分别扩增出519、242和242 bp的特异片段,在其它卵菌和病原真菌中不扩增片段;用两对引物进行常规PCR扩增,检测大豆疫霉菌DNA的灵敏度均为50 pg?μl-1,而巢式PCR的灵敏度为50 fg?μl-1;巢式PCR检测土壤中卵孢子的灵敏度为每克土壤0.4个卵孢子;巢式PCR能够特异地从大豆病株和土壤中检测到大豆疫霉菌。【结论】基于SSR标记建立的巢式PCR方法能够用于大豆疫霉菌的快速检测和病害诊断。     

梨轮纹病和炭疽病病原菌PCR检测

为建立梨轮纹病原菌和炭疽病病原菌的分子检测方法,根据GenBank上炭疽病原菌和轮纹病原菌不同种的ITS序列差异设计2对引物TJ1/TJ2和LW1/LW2,对2种病原菌菌株进行扩增,比较了常规PCR和巢式PCR的检测灵敏度,并对果园中接种梨轮纹病原菌的梨果实进行检测。结果表明,建立的PCR体系可分别从炭疽病原菌和轮纹病原菌菌株扩增出317 bp和325 bp的特异性条带,对其他相似或相近的病原真菌则无扩增条带。巢式PCR技术的灵敏度比常规PCR提高了约105倍,且可以在接种较低浓度(1 ml 10个)轮纹病原菌孢子液7 d后的梨果实组织中检测到病原菌。说明使用巢式PCR技术,可以准确、灵敏地监测梨轮纹病原菌在果园的种群消长动态。     

野生稻DNA片段存在于高世代水稻变异系进一步的分子验证

【目的】小粒野生稻(O. minuta) DNA导入水稻保持系V20B，第1代（D1）获得变异株,经过连续16代繁育，选出了完全稳定遗传的新不育系及其保持系“野威A”/“野威B”。本试验旨在从分子水平上证明野生稻DNA转移整合进栽培稻“野威B”基因组中，并能稳定遗传。【方法】通过RAPD分析、RAPD扩增特异条带测序分析及AFLP分析等方法揭示了远缘资源基因组DNA导入栽培稻的高世代变异系的基因组整合了远缘基因组片段。【结果】对供体（小粒野生稻）、变异系（野威B）和受体（V20B）进行RAPD分析发现，变异系含有供体存在而受体不存在的“特异带”，在此基础上，对“特异带”，DNA片段进行了核苷酸序列分析, 发现RAPD引物OPG-11在变异系与供体中扩增出的1对“特异带”DNA片段的长度均为975 bp, 二者间存在97%的同源性，有29个碱基的差异，碱基突变包括转换、颠换、插入及缺失4种类型；同时，AFLP分析表明：高世代（第16代）变异系“野威B”与受体（V20B）存在大量遗传多态性，并含有供体特异AFLP标记。【结论】证明了野生稻DNA向栽培稻的转移整合。     

大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR诊断方法的建立

根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌气溶素基因（hlyA）序列,设计1对特异性引物,通过对PCR反应条件进行优化,建立了检测大鲵致病性嗜水气单胞菌的PCR诊断方法。结果表明,扩增的阳性条带约为600 bp,特异性、敏感性结果显示,该PCR方法对致病性嗜水气单胞菌DNA的最低检测量为0.4 ng/L,而非致病性嗜水气单胞菌、大肠杆菌、黄杆菌、弗氏柠檬酸杆菌的扩增结果均为阴性。对123份大鲵病料进行检测,结果建立的PCR方法检测结果与细菌学和生化检验结果符合率为97.6%,表明该PCR方法能够对大鲵致病性嗜水气单胞菌样品进行快捷、灵敏、准确的检测。     

PCR法快速检测扩张青霉

 【目的】研究棒曲霉素扩张青霉菌（Penicillium expansum）的快速和特异性PCR检测方法。【方法】通过P.expansum的纯菌平板和液体培养以及纯菌接种于苹果、苹果果肉和苹果汁,用Cenis改良方法提取DNA,以基于isoepoxydon dehydrogenase和polygatacturonase编码基因的两对引物扩增P.expansum DNA,建立特异和快速的检测P.expansum的方法。【结果】基于polygatacturonase基因的引物具有很强的特异性,只有目标DNA片段被扩增,而基于isoepoxydon dehydrogenase基因的引物扩增特异性较差。纯培养可以检测到5×10-6 μｇDNA/每反应体系,整个检测时间约为5 h,比传统培养法（4～6 d）时间大大缩短。苹果、苹果果肉和果汁接种纯P.expansum后所提DNA都得到了很好的扩增,具有很高的特异性,不受苹果样品DNA的干扰。【结论】本研究建立的P.expansum的PCR检测方法特异、快速、灵敏,可用于商品果汁和苹果汁工业化生产中P.expansum的快速检测和质量控制,也可用于工艺过程对P.expansum污染的快速溯源。