老年性痴呆发生机制的研究进展

老年性痴呆即阿尔茨诲默病(Alzheimer disease,AD),是一种多发生于老年以近期记忆障碍为主要临床表现、以老年斑、神经原纤维缠结为主要病变的进行性神经性疾病.其病因和发病机制迄今未明,但近年来基础研究以惊人的速度进展.其中应特书的是家族性AD(FAD)的致病基因早老素基因编码的早老素蛋白(PS)就是产生β淀粉样蛋白(Aβ)的酶本身[1].该发现有力支持AD发生的Aβ学说,并成为治疗AD新战略的基础.本文简述近年来AD发生机制及有关治疗的新进展.     

回神颗粒对双转基因阿尔茨海默病小鼠海马区Aβ1-42表达的影响

目的 探讨在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)病理早期采用回神颗粒对转基因AD小鼠的治疗作用。方法 采用聚合酶链式反应（PCR）法鉴定淀粉样前体蛋白/早老素1(APP/PS1)双转基因AD小鼠的基因表型后,选取3月龄雄性转基因阳性PAD小鼠和同龄、同背景的C57BL/6J野生型雌性小鼠作为实验对象。应用Morris水迷宫中逃避潜伏期、穿越平台的次数来评价小鼠的学习记忆能力,苏木精-伊红(HE)染色法观察小鼠脑组织形态学的改变,免疫组化法检测小鼠海马区β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)1-42的表达水平。结果 回神颗粒治疗组小鼠学习记忆能力提高,与模型组比较,小鼠逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增多(P＜0.05);穿越平台次数与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗组大脑海马区Aβ1-42表达阳性面积明显减少(P＜0.05)。与正常组相比,模型组AD小鼠大脑海马区Aβ1-42表达阳性面积明显增高(P<0.05)。结论 回神颗粒可显著改善APP/PS1转基因AD小鼠的学习记忆能力,抑制Aβ1-42的过度表达、聚集。     

早老蛋白-1基因突变与Alzheimer病

Alzheimer病 (AD)的病因非常复杂 ,目前发现与AD相关的基因有 5种 :2 1号染色体上的淀粉样蛋白前体 (APP)基因、1 9号染色体上的ApoE基因、1 4号染色体上的早老蛋白 1 (ps 1 )基因和 1号染色体上的早老蛋白 2 (ps 2 )基因及 1 2号染色体上的α2 巨球蛋白 (α2 MG)基因。在早发型AD(EOAD)家系发现app、ps 1和ps 2基因的突变 ,呈线性常染色体遗传模式 ,此3个基因的突变分别占 2 %～ 3%、70 %～ 80 %和 2 0 %。ps 1基因已成为AD研究的热点。但迄今为止 ,ps 1基因的功能尚未明了。近年来更多的研究发现多数早发型家族性AD(FAD)与p…     

Aβ抗真菌活性与聚集形态和细胞壁多糖的关系探究

阿尔茨海默症（alzheimer’s disease, AD）的“微生物感染假说”表明,AD的发生发展与脑部真菌感染密切相关。β淀粉样蛋白（β-amyloid, Aβ）作为一种“抗菌肽”已被证明能够对多种病原微生物产生抗菌活性,然而其在抗真菌方面的机制仍不明确。本文主要从AD的“微生物感染假说”入手,探究几丁质等细胞壁多糖在Aβ的抗真菌活性中所发挥的作用。Aβ的聚集状态与其抗菌活性存在相关性,为探究不同聚集状态的Aβ与其抗菌活性的关系并尝试解析Aβ抗真菌的具体作用机制和靶点,选择病原真菌白色念珠菌作为研究对象,证实了Aβ中更容易发生淀粉样变性的具有42个氨基酸的Aβ42对白色念珠菌浮游菌和生物膜的代谢活力具有抑制作用,并且其抑菌效果与Aβ42浓度呈现明显的正相关。通过特异性标记真菌细胞壁的钙荧光白（calcofluor white,CFW）染色法验证了Aβ42对白色念珠菌菌丝生成具有抑制作用。体外制备获得了Aβ42的寡聚体及纤维状聚体,并通过透射电镜进行了形态验证,随后将不同聚集状态的Aβ42作用白色念珠菌。结果表明：不同聚集状态的Aβ42其抗真菌活性存在差异,当Aβ42寡聚体转变为纤...     

β淀粉样蛋白(25-35)对AD大鼠海马Beclin-1表达及学习记忆的影响

研究β淀粉样蛋白(25-35)对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)大鼠海马自噬相关蛋白Beclin-1的表达和学习记忆功能的影响。通过行为学以及免疫组织化学检测,观察模型大鼠学习记忆功能以及海马Beclin-1表达的变化。行为学检测表明:模型组的学习记忆功能明显低于正常组,模型组Beclin-1表达明显降低(P<0.01)。海马CA1区注射β淀粉样蛋白(25-35)大鼠学习记忆力下降,Beclin-1表达下调,提示Beclin-1蛋白的表达降低很可能是β淀粉样蛋白(25-35)致神经元可塑性降低的关键环节。     

马齿苋多糖对小鼠大脑神经细胞代谢损伤修复机制的研究

为探讨马齿苋多糖(Portulaca oleracea polysaccharide,POP)对小鼠大脑神经细胞代谢损伤的修复保护机制,采用原代培养小鼠大脑神经细胞的方法,分别用20μmol/L的β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)处理原代培养细胞、20μmol/L的Aβ加10 mmol/L的POP共同处理原代培养细胞;对处理的原代细胞进行倒置相差显微镜观察与PI-Hochest双染色成活分析,用Western blotting检测处理后的原代细胞P35和P25条带的表达;pEGFP-tau-s3和pcDNA-GSK-3β转染原代培养细胞,pEGFP-tau-s3和pcD-NA-GSK-3β加POP共同转染原代培养细胞,48 h后荧光观察和Western blotting检测GSK-3β的表达。结果显示,倒置相差显微镜下经20μmol/L Aβ处理的原代培养细胞出现了皱缩,部分细胞死亡;经PI-Hochest双染色细胞成活分析,Aβ和POP共同处理的原代培养细胞成活率明显高于只用Aβ处理的原代培养细胞;Western blotting检测到Aβ处理的细胞出现了P25条带,而Aβ加POP共同处理的细胞P25条带明显减弱;Western blotting检测发现,pEGFP-tau-s3和pcDNA-GSK-3β与POP共转染的细胞中,其tau蛋白的迁移率高于只转染pEGFP-tau-s3和pcDNA-GSK-3β的细胞tau迁移率。所以POP对小鼠大脑原代培养细胞Aβ损伤有修复保护作用,并能减少P35到P25的裂解和GSK-3β对tau的磷酸化。     

抗淀粉样蛋白寡聚体单链抗体融合蛋白在真核细胞中表达的初步研究

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种由脑内淀粉样蛋白(A)聚集引起的,以老年人记忆和认知功能丧失为临床表征的神经退行性疾病。研究表明,A寡聚体是AD发生发展的主要因素。应用自行筛选出的能够特异识别淀粉样蛋白寡聚体的单链抗体W20基因,构建了以绿色荧光蛋白为报告基因的真核表达载体pSNAV2.0-W20-EGFP,并应用流式细胞分选、蛋白免疫印迹以及荧光显微镜等技术对该单链抗体融合蛋白在真核细胞中的表达进行了初步研究,为针对AD的抗体基因治疗奠定了基础。     

β淀粉样肽25-35对PC细胞p53和bcl-2基因表达的影响

目的：观察β淀粉样肽25-35（β-amyloidpeptide25-35,Aβ25-35)诱导PC12细胞凋亡和对p53及bcl-2基因表达的影响。方法：采用终浓度分别为0、5、10、20μmol／L Aβ25-35处理PC12细胞24h,用MTT比色法分析细胞存活率,Hoechst33258-PI荧光染色观察细胞核凋亡的形态学改变,DNA电泳观察梯状条带(DNA-Ladder),RT-PCR和Western blot检测p53和bcl-基因表达变化。结果：随着Aβ25-35剂量的增加,PC12细胞存活率降低,凋亡明显增加,p53基因表达增加,bcl-2基因表达降低。结论：Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡可能与上调p53基因,下调bcl-2基因有关。     

Aβ1-10特异性结合肽对老年性痴呆大鼠空间学习记忆的影响

利用Morris水迷宫探讨Aβ1-10特异性结合肽对Aβ1-42诱导的老年性痴呆大鼠模型空间学习记忆的影响。结果显示,在定位航行试验中,中剂量治疗组的潜伏期和游泳路程较模型组显著缩短(P<0.05);在空间探索任务中,中剂量治疗组在目标象限内游泳路程的百分比显著高于模型组(P<0.05)。表明合适剂量的Aβ1-10特异性结合肽可显著改善老年性痴呆大鼠的空间学习记忆能力。     

禾谷镰孢菌β-微管蛋白基因的克隆及在原核细胞中的表达

分别扩增了禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵(MBC)敏感菌株(MBCS)的β1-微管蛋白基因(β1-S)和β2-微管蛋白基因(β2-S),及多菌灵中抗菌株(MBCMR)和高抗菌株(MBCHR)的β2-微管蛋白基因(β2-MR和β2-HR),测序正确后连接到pET32a(+)原核表达载体上,转化至大肠杆菌Rosepta感受态中,经IPTG(1 mmol.L-1)诱导,得到了N末端融合6×His纯化标签的表达产物。SDS-PAGE电泳分析表明:在大肠杆菌中表达了相对分子质量约68×103的蛋白,和预测蛋白大小一致,表达的产物主要以包涵体的形式存在。表达的蛋白经HisTrapTM HP Columns纯化并做了Western-blot验证,结果表明,该蛋白能与抗His标签的单抗发生特异性反应。     

抗淀粉样蛋白寡聚体单链抗体融合蛋白 在真核细胞中表达的初步研究

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种由脑内淀粉样蛋白（A(）聚集引起的,以老年人记忆和认知功能丧失为临床表征的神经退行性疾病。研究表明,A(寡聚体是AD发生发展的主要因素。应用自行筛选出的能够特异识别淀粉样蛋白寡聚体的单链抗体W20基因,构建了以绿色荧光蛋白为报告基因的真核表达载体pSNAV2.0-W20-EGFP,并应用流式细胞分选、蛋白免疫印迹以及荧光显微镜等技术对该单链抗体融合蛋白在真核细胞中的表达进行了初步研究,为针对AD的抗体基因治疗奠定了基础。     

尖孢镰刀菌黏团专化型β-葡萄糖苷酶Foglu1的功能

甘蓝枯萎病是由尖孢镰刀菌黏团专化型(Fusarium oxysporum f. sp.conglutinans, FOC)引起的。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)是纤维素降解过程中的限速酶。本研究中，为明确FOC中一种β-葡萄糖苷酶在其生长发育和致病中的生物学功能，通过split-marker同源重组技术对该病原菌中一种β-葡萄糖苷酶基因(Foglu1)进行敲除与回补，分析野生型菌株与ΔFoglu1敲除突变体菌株、ΔFoglu1-C回补菌株间的表型差异。结果表明，在细胞膜胁迫试验(0.05%SDS)中，ΔFoglu1突变体生长5 d后的菌落直径与野生型相比降低19.6%,推测Foglu1基因对病原菌细胞膜功能具有一定的作用；氧胁迫试验(0.1%H₂O₂)中菌落直径比野生型减小14%,表明ΔFoglu1突变体比野生型对氧胁迫更加敏感；ΔFoglu1突变体产孢量较野生型降低约22.3%,说明Foglu1基因影响FOC的产孢能力；在接种寄主甘蓝时，发现接种ΔFoglu1菌株的甘蓝植株初期发病缓慢，接种后第8天的病情指数比接种野生菌株的低...     

小麦蛋白磷酸酶2A调节亚基基因TaBβ-1的克隆及其在非生物胁迫下的表达特性

【目的】克隆小麦蛋白磷酸酶2A(PP2A)调节亚基(PR55)基因TaBβ-1,分析其在非生物胁迫下的表达特性,为小麦抗逆育种提供候选基因。【方法】以小麦品种旱选10号为材料,通过电子克隆和RT-PCR获得TaBβ-1的全长cDNA序列,采用生物信息学软件分析TaBβ-1及其编码蛋白TaBβ-1的序列特征,预测其功能,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术分析该基因在小麦孕穗期不同组织中、不同生育时期新叶中的表达情况,以及在PEG、NaCl、低温及外源激素ABA等非生物胁迫下的表达模式,检测不同水分条件下成株期转基因拟南芥的叶片细胞膜稳定性。【结果】获得TaBβ-1的全长cDNA序列1931bp,其开放阅读框(ORF)为1539bp。该基因编码512个氨基酸,预测TaBβ-1蛋白分子量为57.1kD,等电点为5.87,含有PP2A调节亚基的1个CDC55保守结构域、1个alpha/beta结构域、2个PR55保守结构域和6个WD重复子。TaBβ-1在小麦孕穗期的根、穗、叶中均有表达,表达量依次为根穗叶;在不同生育时期的新叶中,苗期叶片的表达量最高。TaBβ-1的表达明显受PEG、NaCl、低温以及外源ABA的诱导。【结论】小麦蛋白磷酸酶2A调节亚基家族基因TaBβ-1在小麦苗期叶片中的表达量明显高于根、穗以及其它时期的叶片;TaBβ-1参与对高渗、高盐、低温等多种胁迫以及ABA处理的应答反应,但表达模式不同;在水分胁迫条件下,转基因拟南芥比野生型具有较高的细胞膜稳定性。     

小金蝠蛾幼虫β-1,3-葡聚糖识别蛋白 βGRP1基因的分子特征与生物信息学分析

[目的]探索冬虫夏草寄主昆虫小金蝠蛾幼虫的β-1,3-葡聚糖识别蛋白βGRP1基因的结构特征与进化关系.[方法]通过PCR法克隆获得小金蝠蛾幼虫βGRP1基因的编码序列,并采用Protparam、NetPhos 2.0 Server cDNA、MEGA等软件分析βGRP1蛋白的理化特征和进化分析.[结果]小金蝠蛾幼虫βGRP1基因编码序列1593 bp,推断可编码530氨基酸组成的蛋白,该蛋白为分泌型蛋白,含有20个氨基酸的信号肽,包含2个功能结构域,该结构域与葡聚糖的识别密切相关;同源分析和分子系统进化树分析表明,鳞翅目昆虫中的βGRPs基因家族分为4个进化分枝,其中小金蝙蝠蛾与勾蝠蛾为单独的一个进化分枝,小金蝠蛾幼虫βGRP1进化较钩蝠蛾早,介于I型和Ⅲ型分支.[结论]该蛋白具有识别β-1,3-葡聚糖的结构域,并可能通过丝氨酸磷酸化激活酚酶源级联系统,启动免疫,为进一步探索βGRP1蛋白的免疫功能奠定基础.     

猪瘟病毒E0蛋白对IFN-β启动子的抑制作用研究

以新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)为IFN-β诱导剂,将猪瘟病毒(Classical swine fever vires,CSFV)E0基因的C末端与增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protem,EGFP)基因相连,瞬时表达于猪。肾细胞PK15中,利用荧光素酶报告基因系统检测IFN-β启动子的活化状态,结果显示CSFV E0蛋白可抑制NDV对IFN-β启动子的诱导作用,抑制效应随E0蛋白量增加而增强;半定量RT-PCR结果显示,E0蛋白可明显降低IFN-βmRNA的生成量。结果表明,E0蛋白具有干扰素拮抗功能。该研究为阐明CSFV的致病及持续感染机制提供了理论支持。     

牛β-乳球蛋白基因5′调控成分的分离、克隆及序列分析

利用PCR方法克隆了牛β-乳球蛋白基因5′调控成分(1 449 bp),其中包括5′侧翼序列(645 bp),第一外显子及第一内含子(804 bp).PCR产物回收纯化后,克隆在pMD 18-T Vector的T位点.序列分析表明,该序列与牛β-乳球蛋白A型基因、牛β-乳球蛋白B型基因、山羊和绵羊β-乳球蛋白基因的同源性分别为98.55%,99.79%,90.70%和90.09%.计算机分析表明,此调控成分含有诸多调节因子结合位点或反应元件,其中包括视黄酸反应元件(RARE)、佛波酯反应元件(TRE)、乳腺特异性因子(MSBF)和核因子1(NF1)结合位点等,提示此调控成分可调控外源基因在乳腺细胞中高效表达,可用于构建乳腺特异性表达载体.     

整合素β1和β2亚基胞内区的原核高效表达及纯化

【目的】构建整合素(Integrin)β1和β2亚基胞内区原核表达载体,高效表达整合素β1和β2亚基胞内区蛋白,为进一步研究其在细胞迁移和信号传导中的定位及其多克隆抗体的制备奠定了基础。【方法】采用PCR技术,从cDNA中扩增出整合素β1和β2亚基胞内区基因片断,并将其克隆到pGEX-4T2原核表达载体上,构建了GST-β1和GST-β2质粒,然后将GST-β1和GST-β2质粒分别转化E.coliBL21(DE3)表达菌,用IPTG诱导,成功表达了整合素β1和β2亚基胞内区蛋白,并利用Glutathione SepharoseTM4B对表达产物进行纯化。【结果】利用PCR扩增得到了整合素β1和β2亚基胞内区基因片段,并成功构建了GST-β1和GST-β2质粒;对GST-β1和GST-β2诱导表达发现,这2种融合蛋白均为可溶性蛋白,具有良好的生物学活性。通过纯化得到了高纯度的GST-β1和GST-β2融合蛋白。【结论】整合素β1和β2亚基胞内区基因可以高效表达,并具有良好的生物学活性。     

中国牦牛β-珠蛋白基因的克隆和序列分析

根据黄牛β-珠蛋白基因的序列设计引物,扩增了中国牦牛的β-珠蛋白基因,并对其进行了克隆测序和氨基酸序列比较分析。结果显示,其与黄牛β-珠蛋白基因的同源性很高,达到97%以上;检测到中国牦牛β-珠蛋白基因的2个等位基因7β3A sn和1β35A sn,其中67号牦牛个体中检测到2个等位基因7β3A sn和1β35A sn,64号牦牛个体中检测到等位基因1β35A sn,1078号牦牛个体中检测到等位基因7β3A sn;等位基因1β35A sn是中国牦牛特有的一个等位基因,推测该等位基因编码的第135位氨基酸天冬酰胺,可能会降低牦牛血红蛋白的氧亲和力。     

脑尔康对AD模型大鼠海马内低密度脂蛋白受体相关蛋白表达的影响

目的观察复方中药脑尔康对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠海马低密度脂蛋白受体相关蛋白(LDL receptor-related protein,LRP)表达的影响,探讨其抗痴呆的作用机制。方法 48只健康雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、吡拉西坦组和脑尔康大、中、小剂量组,每组8只。除空白组外,其余各组大鼠双侧海马CA1区各一次性注射10μg凝聚态Aβ1-42制备AD模型,空白组注射等体积生理盐水。3个脑尔康剂量组大鼠给予脑尔康(60、30、15g.kg-1.d-1)连续灌胃28d,吡拉西坦组给予吡拉西坦(0.375g.kg-1.d-1)灌胃,空白组和模型组给予等量生理盐水灌胃。采用Y型电迷宫检测大鼠学习记忆能力,采用免疫组化染色法检测海马内LRP表达。结果大鼠海马注射Aβ1-42后,与空白组比较,模型组大鼠学习记忆能力下降,海马内Aβ1-42表达明显增多,而LRP的表达减少;经脑尔康干预后,与模型组比较,吡拉西坦组和脑尔康组大鼠学习记忆能力改善(P<0.05或P<0.01),海马内Aβ1-42表达下降(P<0.05或P<0.01),而LRP的表达上调(P<0.05或P<0.01)。结论复方中药脑尔康可能通过上调AD模型大鼠海马LRP的表达从而降低Aβ1-42的含量,并改善其学习记忆能力,从而发挥抗痴呆作用。     

鸡大肠杆菌TEM和CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因分型研究

 【目的】检测鸡大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的基因型和基因亚型,了解河南省产酶鸡大肠杆菌ESBLs基因型分布。【方法】 对河南省7个地区不同鸡场临床分离28株产ESBLs鸡大肠杆菌分别用TEM、SHV和CTX-M等3种通用引物进行PCR扩增及测序分析,确定其基因型和基因亚型。【结果】 21株鸡大肠杆菌检出TEM型基因,2株检出CTX-M型基因,5株检出TEM型和CTX-M型两种基因,未检出SHV型。TEM基因亚型以TEM-1变异型为主,与AY293072(TEM-1)相比同源性为98%—99%,核苷酸序列除发生18T→C沉默突变外,尚有3株分别有另一处碱基发生变化：783G→A(C3菌,序列号为FJ405207)、21T→A(X2菌,序列号为FJ405208)和269G→A(F4菌,序列号为FJ405211),其中前两处为沉默突变,F4菌的碱基突变引起92甘氨酸变为天冬氨酸,为TEM-57型。CTX-M基因亚型包括两种：CTX-M-65亚型4株(C2、C3、C4和K1,序列号分别为FJ405191,FJ405192,FJ405212和FJ405214)和CTX-M-14亚型3株(F2、X3和B5,其中F2菌的相关序列已上传至GenBank,获序列号为FJ405213)。【结论】 目前河南省产ESBL鸡大肠杆菌基因亚型以TEM-1变异型为主,CTX-M-65和CTX-M-14型次之。