猪SOCS3基因克隆及其在不同生长阶段表达差异

随着分子生物学技术的发展和广泛应用,发现了许多与脂肪沉积密切相关的基因,ob基因是其中最为重要的一个。leptin是ob基因编码的主要由脂肪细胞分泌的循环激素,与肥胖症的发生之间存在复杂的关系,leptin在猪体脂沉积过     

猪不同生长阶段脂肪酸合成酶基因的表达差异

动物的体脂沉积所需要的脂肪酸大多是由脂肪酸合成酶(FAS)催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成脂肪酸。熊文中等(2001)研究发现,猪脂肪组织中脂肪酸合成酶与胴体脂肪量、胴体的脂肪率呈极显著正相关。FAS基因的表达直接影响着脂肪酸合成酶多寡。Kameda和Goodrige(1991)和Matthe     

猪脂蛋白脂酶基因片段的克隆及不同体重的表达差异

从杜长大母猪的肠系膜脂肪中提取基因组RNA，用RT-PCR扩增脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase LPL)基因，获得1条约689 bp的片段，以pGEM-T Easy vector 为载体，将该基因片断克隆到大肠杆菌(Escherichia coli )DH5α中。从筛选的阳性克隆中分离出LPL基因，测定其序列。分析表明，该片段为LPL cDNA的部分序列，编码229个氨基酸组成的多肽。研究得到的基因片段与报道的猪脂肪组织中LPL cDNA部分序列同源性达到98%，氨基酸序列同源性达到99.1％。以LPL基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT-PCR法，以β-actin 为内标，研究不同体重猪脂肪组织LPL基因表达的差异。结果发现，从刚出生到30 kg，LPL基因表达呈上升趋势，在30～50 kg，LPL基因表达呈下降趋势，50～90 kg，LPL基因表达又呈上升趋势。     

半定量RT-PCR法评定不同生长阶段猪抗菌肽pr-39基因表达差异

根据已报道的猪抗菌肽pr-39基因和看家基因β-肌动蛋白(β-actin)基因序列，分别设计pr-39和β-actin的引物，探讨了PCR体系中适宜的MgCl2浓度、循环次数，以及2对引物间竞争情况。实验揭示，要保证半定量RT-PCR的可行性与可靠性，适宜的MgCl2浓度为2．5mmol／L，循环次数为29；由于2对引物之间的杂交配对，两对引物需分别进行扩增。根据以上信息构建一优化的半定量RT—PCR法，以β-actin为内标，研究不同生长阶段猪抗菌肽pr-39基因表达的差异。结果显示，不同生长阶段猪pr-39基因表达有差异，从出生到断奶前pr—39表达量呈增加趋势，断奶时表达量下降，断奶后随日龄增加pr-39表达量再逐渐增加。     

猪心型脂肪酸结合蛋白基因的克隆及不同生长阶段表达的差异

从1,30,50,70和90kg左右的杜长大猪肌肉组织中提取基因组RNA,用RT-PCR扩增猪心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因,获得1条211bp的片段,以pGEM-T为载体,将该基因片段克隆到大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α中。从筛选到的阳性克隆中分离出脂肪酸结合蛋白基因,测定其序列。分析表明,该片段为脂肪酸结合蛋白基因cDNA的部分序列,与已报道的猪肌肉组织中的H-FABPcDNA部分序列同源性达到99%。以H-FABP基因片段的克隆为基础,构建了优化的半定量RT-PCR法,以18SrRNA为内标,研究不同生长阶段猪肌肉组织中H-FABP基因表达的差异。结果表明,从出生到50kg,猪H-FABP基因表达呈下降趋势;50～90kg阶段,H-FABP基因的表达又有所上升。     

莱芜猪和杜洛克猪H-FABP表达差异和肉质性状关系研究

采用荧光定量RT-PCR法测定H-FABP基因在体重100kg左右的莱芜猪和杜洛克猪背最长肌中的表达差异，分析了H-FABP基因表达差异与肉质性状的关系，结果表明：莱芜猪的背最长肌H-FABP基因mRMA的表达水平比杜洛克猪高38.60％，认为可能与莱芜猪肌内脂肪含量极显著高于杜洛克猪有关（P<0.01）；H-FABP基因的背最长肌mRNA的表达水平与肌内脂肪、pH值成正相关，与肌纤维直径成负相关，与大理石纹和肉色的相关关系两品种不一致。其中莱芜猪和杜洛克猪H-FABP基因mRNA表达量与肌内脂肪相关系数最高，分别为0.363和0.943。对H-FABP基因的研究不仅有助于肌内脂肪的提高，而且可提高肌肉pH值、降低肌纤维直径，全面改善肌肉的肉质性状     

猪骨髓抗菌肽 PMAP-37 基因片段的克隆及不同体重的表达差异

从杜长大母猪的股骨骨髓中提取基因组RNA，用RT-PCR 扩增抗菌肽PMAP-37 基因，获得1 条约282 bp 的片段，以pGEM-T Easy vector 为载体，将该基因片断克隆到大肠杆菌(Escherichia coli )DH5α 中。从筛选的阳性克隆中分离出PMAP-37 基因，测定其序列。分析表明，该片段为PMAP-37 cDNA 的部分序列，编码167 个氨基酸组成的多肽。研究得到的基因片段与报道的猪骨髓抗菌肽PMAP-37 cDNA 部分序列同源性达到98%。以PMAP-37 基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT-PCR 法，以18S rRNA 为内标，研究不同体重猪骨髓抗菌肽PMAP-37 基因表达的差异。结果发现，从刚出生到20 kg，PMAP-37 基因表达呈上升趋势，在20～40 kg，PMAP-37 基因表达呈下降趋势，40～60 kg，PMAP-37 基因表达又呈上升趋势，在60～90 kg，PMAP-37 基因表达呈下降趋势。     

猪APOA5和APOC3基因mRNA的表达差异及与肌内脂肪沉积的相关性分析

为了探究载脂蛋白A5（apolipoprotein A5,APOA5）基因和载脂蛋白C3（apolipoprotein C3,APOC3）基因组织表达差异及其与肌内脂肪（intramuscular fat,IMF）沉积的相关性,本研究利用荧光定量PCR方法分析APOA5和APOC3基因mRNA在可乐猪和江口萝卜猪7个组织中的相对表达量及其与IMF沉积的相关性。研究结果表明：APOA5和APOC3基因在可乐猪和江口萝卜猪的7个组织中均有不同程度表达,在肝脏中表达量最高,在皮下脂肪和背最长肌中表达量次之;APOA5基因在可乐猪多数组织中的表达量显著低于江口萝卜猪（p〈0.05）,而APOC3基因未呈现类似规律性;可乐猪中,除心脏外,其它组织均表现为APOC3基因mRNA表达量高于APOA5,江口萝卜猪心脏、肝脏、脾脏、小肠和背最长肌中同样呈现上述表达差异。相关及回归分析表明,IMF沉积量与可乐猪APOC3 mRNA表达丰度呈线性正相关（p〈0.05）。根据研究结果,可以推测APOA5和APOC3基因与IMF沉积有一定关联性。     

一种新的猪α-干扰素基因克隆及其在大肠杆菌中表达

提取经新城疫病毒诱导培养的猪外周血白细胞总RNA,RT-PCR扩增出猪α-干扰素基因并克隆到T载体.测序结果表明,扩增片段含有信号肽的猪α-干扰素完整基因,与GenBank上登录的猪α1-干扰素基因同源性为97.2%.亚克隆猪α-干扰素成熟蛋白编码基因并对其5'段前1个稀有密码子进行大肠杆菌(Escherchia coli)偏嗜性改造.构建了猪α-干扰素原核单纯表达载体pCIFNA,实现了猪α-干扰素在大肠杆菌中的表达,表达产物约占菌体总蛋白的15.6%.表达产物以包涵体形式存在,用含6 mol/L盐酸胍的变性液溶解及含GSH-GSSG复性液复性处理,复性后的表达产物经凝胶层析纯化后,细胞病变抑制法测定结果表明,重组猪α-干扰素具有较高抗病毒活性,约为1.66x106U/mg.     

莱芜猪和杜洛克猪心脏脂肪酸结合蛋白基因(H-FABP) 表达差异和肉质性状的关系

肌内脂肪(Intramuscular fat,IMF)含量是猪肉品质的一个主要的决定因子,心脏脂肪酸结合蛋白基因(heart fatty-acid-binding protein,H-FABP)是影响肌内脂肪含量的候选基因(Gerbens et al.,2001),本研究利用荧光定量RT-PCR方法.以遗传基础相距较远、肌内脂肪含量差异较大的莱芜猪和杜洛克猪为研究对象,对该基因在两品种背最长肌中的表达及与肌内脂肪等肉质性状相关关系进行了初步研究.     

猪肥胖基因片断的克隆及不同日龄猪肥胖基因表达的差异

从杜长嘉(Duroex Landracex Taihu)猪的皮下脂肪中提取基因组RNA，用RT-PCR扩增肥胖基因(obesegene；ob)，获得1条504bp的片断，以pGEM-T Easy Vector为载体，将该基因片断克隆到大肠杆菌(Eschenchia coli)中。从筛选到的阳性克隆中分离出肥胖基因，测定其序列，分析表明该片段为肥胖基因cDNA的部分序列，编码167个氨基酸组成的多肽，是成熟肽的主体部分。研究得到的基因片段与报道的猪脂肪组织中ob cDNA部分序列同源性达到99．41％。氨基酸序列同源性达到98．94％。以ob基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT-PCR法，以β-actin为内标，研究不同日龄的猪脂肪组织ob基因表达的差异，1-28日龄ob基因表达呈上升趋势，28日龄达到最高，随后，到56日龄ob基因表达又呈下降趋势。     

Comprehensive Analysis of Plant Gene Expression in Soybean Root Nodules at Different Growth Stages

Gene expression profiles in early (12 d after sowing, DAS), mature (35 DAS) and senescent (77 DAS) soybean ( Glycine max (L.) Merr. cv. Enrei) root nodules were analyzed using Lotus japonicus cDNA macroarray. The cDNA macroarray membranes contained 18,144 independent cDNAs of L. japonicus isolated from various organs. The membranes were hybridized to ³³P-labeled single-strand cDNAs transcribed from mRNA extracted from the soybean root nodules at three different growth stages. The results showed that over 75% of the cDNA clones gave a relative signal intensity (RSI) lower than 300, irrespective of the soybean growth stage. cDNA with an RSI value over 5,000 accounted for 2.1, 1.2 and 0.5% of the total cDNA clones at 12, 35 and 77 DAS, respectively. The highest RSI value was detected in a clone hybridized to putative pectinesterase (MWM097c10_r) at 12 DAS, while the RSI value of lycopene β-cyclase (MWL025d06_r) was the highest at 35 and 77 DAS. At 77 DAS, the percentage of transferase gene cDNA clones accounted for 20.5% of the total cDNA clones showing an RSI value over 500, a value clearly lower than that at 12 and 35 DAS. On the other hand, the percentage of hydrolase gene cDNA clones accounted for 45.2% at 77 DAS, a value around 1.5 times higher than that at 12 and 35 DAS. The chronological RSI profiles of individual cDNA clones were classified into nine patterns, and the profiles of the cDNA clones belonging to 15 homologous gene groups encoding enzymes of nitrogen and carbon metabolism, nodule specific proteins, enzymes of RNA and protein hydrolysis, and synthesis of jasmonic acid precursor were compared within and between groups. As a result, significant variations both within- and between-groups were revealed.     

猪骨骼肌NDUFS7基因的克隆、染色体定位和表达谱分析

摘要：本研究用辐射杂种克隆板对猪的NDUFS7基因进行了染色体的物理定位，克隆了该基因的完整CDS序列，用相关软件进行了基因结构和功能的预测，并用半定量RT-PCR技术分析了NDUFS7基因在猪的11种组织以及在33天、65天、90天胚胎和成年猪的骨骼肌中的表达情况。分析结果首次将NDUFS7基因定位于猪的2号染色体２q21-q24， 与标记 SW395紧密连锁。该基因的CDS全长648bp，编码215个氨基酸，预测编码的产物具有一个高度保守的与能量生成有关的NouB结构域和３个酶的磷酸化位点。同时，RT-PCR结果显示，NDUFS7基因在猪的11种组织中均有表达，但表达量有差异；在不同发育阶段的骨骼肌中，65天和90天胚胎时的表达量较高，而33天胚胎和成年猪的表达量相对较低。     

猪TNNC2基因的克隆及其融合蛋白在大肠杆菌中的表达

根据GenBank上猪TNNC2（Fast skeletal muscle troponin C2）基因序列（GenBank accession No. DQ629177）设计一对引物,采用RT-PCR方法克隆得到617 bp TNNC2 cDNA片段（GenBank accession No. EF673726）,包括完整的开放阅读框（ORF）,与GenBank上公布的猪TNNC2基因（GenBank accession No. AY575058）的ORF核苷酸序列同源性达99 %,并发现开放阅读框内的5个点突变,319位点T→C,320 位点G→A,321位点C→T,导致氨基酸107位Ala（丙氨酸）→Met（蛋氨酸）,322位点A→G为同义突变,433位点A→T,导致氨基酸144位Glu（谷氨酸）→Asp（天冬氨酸）。根据已获得的TNNC2基因开放阅读框序列,重新设计引物扩增得到包含BamH I和EcoR I酶切位点的完整阅读框,将其首先克隆到pMD18-T载体中,经菌液PCR筛选和酶切鉴定后,用BamH I和EcoR I将目的片段切下,再克隆到原核表达载体pRSET A中构建重组表达质粒pRSET A-TNNC2。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG不同诱导条件诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot分析证实重组表达质粒pRSET A-TNNC2表达出24 kD左右的融合蛋白,最佳诱导时间为4 h,最佳的IPTG诱导浓度为0.6 mmol/L,表达产物以可溶性蛋白的形式存在。     

河南良杂猪白细胞介素18基因的克隆及其成熟蛋白在大肠杆菌中的表达

白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)又称为干扰素γ诱生因子(interferon gamma inducing factor,IGIF).Okamura and Tsutsui(1995)首次从中毒性休克的鼠肝脏中克隆出了该因子.Muneta et al.(1999,2000)从猪肺泡巨嗜细胞中克隆到pIL-18,并证明表达pIL-18的成熟蛋白比前体蛋白具有更高的活性.本研究选择河南省普遍喂养的良杂猪,对其IL-18基因进行扩增及序列测定,并实现了成熟蛋白在大肠杆菌中的初步表达.