鼠防御素Crp4基因的克隆及序列分析

从昆明鼠回肠末端提取总RNA,经逆转录PCR(RT-PCR)扩增出鼠防御素Crp4基因片段。将回收的基因片段插入pMD-18T载体,小提质粒经限制性酶切鉴定后进行测序。结果表明:扩增出的基因片段长度为279 bp。该基因编码93个氨基酸,其中成熟肽由34个氨基酸组成。通过序列分析发现1对引物克隆到2个不同的防御素基因(Crp4-1和Crp4-2)中,与2个鼠防御素基因(AY746426和AY746425)的同源性分别为97.8%和97.1%。在与家鼠、人、猕猴和兔的防御素成熟肽序列进行比较后,发现它们均含有6个保守的半胱氨酸。这一发现有助于对鼠防御素的结构和功能进行深入研究。     

猪β防御素3表达载体的构建及其 在大肠杆菌中的表达

根据Gen Bank上发表的猪β防御素3(p BD3)基因的序列,通过生物学软件预测其成熟肽序列。提取猪舌组织RNA,设计引物,通过PCR的方法扩增得到约150 bp的p BD3成熟肽基因序列,构建其原核表达载体p ETp BD3,并获得工程菌株BL21-pET-p BD3。IPTG诱导表达后,比对照多表达了1条约16 k D的蛋白条带,通过免疫蛋白印记说明所表达的蛋白为带有His·Tag的融合蛋白,证明p BD3成功表达。     

鸡β-防御素3(Gal-3)基因的克隆、表达及抑菌活性研究

【目的】克隆和表达鸡β-防御素3(Gal-3)基因,并对其抑菌活性进行研究,为寻找替代抗生素的抗菌肽提供试验依据。【方法】利用RT-PCR方法,从鸡心脏中分离并克隆了鸡Gal-3基因,将其与分子伴侣基因SUMO相融合,再将该融合基因与原核表达载体pET-20b连接后转化至BL21(DE3)宿主细胞中,经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析;最后,对Gal-3融合蛋白进行纯化,并对表达产物进行体外抑菌试验。【结果】通过RT-PCR扩增获得了约240bp的鸡Gal-3基因,经IPTG诱导获得约26ku的蛋白。IPTG在终浓度为0.6mmol/L,33℃诱导4h,诱导时菌体A600为0.6,蛋白表达量最高,且多数以可溶形式存在,33℃上清中的蛋白含量比37℃上清高。纯化的蛋白对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌活性。【结论】成功克隆并表达了鸡Gal-3基因,其原核表达产物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑菌活性。     

鸡β 防御素Gal 3在大肠杆菌中的诱导表达

利用 IPTG 作为诱导剂进行鸡β 防御素 3 基因重组蛋白的表达,探讨工程化生产的可能性。分别对影响重组蛋白表达的因素（IPTG浓度、诱导时机、诱导时间、诱导温度和溶氧量）进行优化,最终得到最佳的IPTG诱导条件： IPTG的终浓度为0.6 mmol/L,诱导起始吸光度A₆₀₀为0.6,最适溶氧量为150 mL 三角瓶装50 mL培养基,且在 33 ℃ 下诱导4 h 重组蛋白表达量达到最大。该方法为工程化生产提供良好的试验依据。     

猪白细胞介素-2基因在大肠杆菌中的表达及其生物学活性测定

【目的】在大肠杆菌中表达猪白细胞介素-2(pIL2),并鉴定其生物学活性。【方法】以含猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增IL-2基因。将猪IL-2基因定向克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下表达融合蛋白GST-pIL2,并应用甲基噻唑基四唑(MTT)试验测定融合蛋白的生物学活性。【结果】以含有猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增出1条约420bp的带。所获重组质粒pGEX-pIL2经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。SDS-PAGE电泳结果显示,可检测到相对分子质量约为42ku的GST-pIL2,Western-blot证实GST-pIL2能与兔抗猪IL-2单克隆抗体发生特异性反应。表达蛋白经薄层层析扫描分析,表达量约占菌体总蛋白的40%。MTT试验证实,表达产物经变性、复性后能极显著促进猪脾淋巴细胞增殖。【结论】猪IL-2基因在大肠杆菌中得到表达,表达的蛋白具有一定的生物学活性。     

猪α干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测

【目的】利用基因工程技术寻求能够高效、稳定表达猪α干扰素,且表达产物易于纯化的表达系统。【方法】以含猪α干扰素(IFN-α)基因的重组质粒pGEM-T-IFN-α为模板,PCR扩增猪α干扰素基因。将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-IFN-α,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。【结果】SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为45 ku的GST-IFN-α,Westernblot证实GST-IFN-α能与猪IFN-α单克隆抗体发生特异性反应。重组猪α干扰素经谷胱苷肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在Vero细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为2.24×103U/mg。【结论】建立的表达系统能够表达重组猪α干扰素,表达的重组猪α干扰素具有一定的生物活性。     

奶牛β-防御素5基因的克隆与原核表达

根据已发表的β-防御素5基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增奶牛白细胞β-防御素5基因片段,构建原核表达载体并进行诱导表达.结果表明:将PCR产物插入pGEM-T easy载体后,经琼脂糖凝胶电泳、PCR、酶切及DNA测序证明构建的重组克隆载体完全正确,以该重组质粒为模板扩增目的基因的成熟肽片段,产物用EcoR I+NotⅠ双酶切并与原核表达载体PET28a连接,获得了预期的重组表达质粒.将重组表达质粒转化到BL21(DE3)宿主菌中,用异丙基--βD-硫代半乳糖苷诱导表达,经尿素-SDS-PAGE检测表明表达产物为6.4 kda的融合蛋白.     

鸡β- 防御素7 的克隆及表达

以NCBI已登录的鸡β-防御素7(登录号:NM_001001194)为模板,设计特异性引物,扩增鸡β-防御素7基因,目的基因与pET32a载体相连,构建表达质粒并导入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达和抗菌试验。结果表明,PCR扩增的目的片段,经测序证明与鸡β-防御素7基因NM_001001194序列同源性达99%,经IPTG诱导表达的重组蛋白与预期大小相符。平板抑菌试验结果表明,该重组多肽对金黄色葡萄球菌有较强的抗菌活性。     

猪轮状病毒VP4蛋白基因在大肠杆菌中的表达

[目的]研究猪的轮状病毒VP4蛋白基因在BL21大肠杆菌中的表达。[方法]以猪肺脏组织中分离的总RNA为模板,采用反转录聚合酶链式反应（1it—PCR）技术扩增VP4蛋白的部分基因,将PCR产物克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒PGEX-4T-1-VP4并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。将重组载体PGEx4T-1-VP4转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达和SDS—PAGE分析,并对重组大肠杆菌进行可溶性分析。[结果]对猪肺脏组织中分离的总RNA进行RT—PCR扩增,获得875bp的VP4部分基因,重组质粒PGEX-4T-1-VP4经BamHI和Xho Ⅰ双酶切和测序鉴定后,插入的猪轮状病毒VP4的eDNA编码区序列与已公布的猪GenBank核酸序列比对结果为99．5％;将重组质粒pGEX-4T-1-VP4-一转化至大肠杆菌B121（DE3）中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约58kDa融合蛋白带。[结论]该研究为进一步研究轮状病毒的疫苗研制奠定了基础。     

猪RBP-4基因原核表达载体的构建及表达

为构建猪RBP-4基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达蛋白。取成年母猪正常卵巢组织提取总RNA,RT-PCR后回收扩增产物,构建表达载体pEASY-E1-RBP4,转化BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长序列与GenBank中的序列基本一致。原核表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定,其以包涵体形式表达。试验成功构建了猪RBP4基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,为后续蛋白纯化及抗体的制备奠定基础。     

大肠杆菌多重耐药调控基因marA的克隆及其原核表达

根据GenBank中大肠杆菌的marA基因序列设计引物,以大肠杆菌ATCC25922的基因组为模板,PCR扩增出约384 bp的marA基因片段,将所得片段与pMD18-T simple vector连接,转化至JM109大肠杆菌中,筛选阳性克隆,其质粒中插入序列测序结果与GenBank中报道一致.从阳性克隆中提取质粒,经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶解,回收384 bp目的片段,定向克隆到pET-28a表达载体中,提取质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,获得阳性克隆.经IPTG诱导阳性菌,收集表达产物,通过SDS-PAGE分析证实marA基因得到表达.     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因的原核表达

大肠杆菌(Escherichia coli)不耐热肠毒素B亚单位(LTB)不仅是重要的黏膜免疫原,而且作为佐剂在黏膜免疫中起着重要的作用.试验采用PCR方法扩增了肠毒素性大肠杆菌的LTB基因,并将其克隆到pGEX-KG原核表达栽体上,构建了重组质粒pKG-LTB,经酶切和测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,克隆的LTB基因与谷胱甘肽转移酶(GST)基因获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-LTB分子量约为35kDa,并具有免疫反应活性.这为进一步研究LTB蛋白黏膜免疫原性和黏膜佐剂的作用奠定了基础.     

罗曼鸡白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

应用RT-PCR技术从罗曼鸡脾淋巴细胞RNA中扩增鸡白细胞介素18(ChIL-18)全基因,并克隆和测序。结果表明,获得了ChIL-18全序列,其大小为597 bp。将其成熟蛋白基因(510 bp)亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下表达融合蛋白(GST-ChIL-18)。SDS-PAGE可检测到分子质量为约46 kDa的融合蛋白,Western blot证实该融合蛋白可与鼠抗鸡IL-18单克隆抗体发生特异性反应。用MTT法测定表明,重组蛋白能明显促进鸡T细胞转化的活性。     

犬传染性肝炎病毒Hexon基因原核表达条件的优化与表达蛋白的活性

[目的]为了提高犬传染性肝炎Hexon蛋白基因在大肠杆菌中的表达量,研究Hexon基因蛋白的最佳表达条件和表达蛋白的活性.[方法]在大肠杆菌菌株BL21(DE3)培养过程中,选择诱导剂(IPTG)的最佳加入时间、诱导剂(IFTG)浓度、诱导时间以及不同温度条件观察对Hexon融合蛋白表达的影响,以确定最佳表达条件,并用Westem-blot检测重组蛋白的生物活性.[结果]大肠杆菌BL21(DE3)在37℃培养2.25h后,添加终浓度为2.0 mmol/L的IPTG,27℃培养8 h,Hexon重组蛋白表达量最高(1.67mg/mL),所表达的重组蛋白能与犬传染性肝炎阳性血清相结合.[结论]在高浓度IPTG诱导和冷培养条件下,Hexon蛋白基因的表达量最高,表达出的重组蛋白具有很好的反应原性,为进一步研究六邻体蛋白的作用机理及亚单位疫苗的研究提供了实验基础.     

溶菌酶基因合成及其原核表达

根据T4噬菌体溶菌酶的氨基酸序列,选用植物偏爱的密码子设计并人工合成了溶菌酶基因,并在N-端加上23个氨基酸残基的α-淀粉酶信号肽序列和信号肽酶切位点HQP;用苷氨酸残基替代C-端的酰胺;新基因全长为576 bp,共编码190个氨基酸.为了检测该基因生物活性,将其克隆到原核表达载体pET28b( )中,导入宿主细菌E. coli BL21(DE3) pLysS,经IPTG诱导后,宿主细菌在2 h内全部被溶菌酶基因的表达产物裂解,说明该溶菌酶基因对细菌具有很强的抗性.     

大肠杆菌外膜蛋白A在原核表达载体中的克隆表达

对大肠杆菌的外膜蛋白A基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达,为大肠杆菌重组疫苗的构建奠定基础.以大肠杆菌分离株308-2菌株基因组DNA为模板,用PCR法对基因ompA进行扩增,产物与T载体连接,经测序鉴定正确后与表达载体pET32a(+)连接构建表达ompA的重组质粒,将此重组质粒转化入表达宿主E coli Ros...     

长喙田菁植物螯合肽合成酶PCS1的原核表达及纯化

为了获得纯化的长喙田菁(Sesbania rostrata)植物螯合肽合成酶PCS1,本研究以原核表达载体pMAL-c2x为基础,构建了含有SrPCS1开放阅读框序列的原核表达载体pAM56,并将其转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),对融合蛋白的表达进行了优化,通过Western blotting鉴定融合蛋白,且用...     

鸡 PD 1胞外区基因的克隆表达及其蛋白生物学活性鉴定

为研究鸡程序性细胞死亡因子1（PD 1）胞外区的生物学活性,根据 GenBank 中的鸡 PD 1基因序列,经生物信息学比对分析,设计鸡 PD 1胞外区特异性克隆引物,扩增目的基因,连接原核表达载体 pET 28a（＋）,构建重组表达载体 pET 28a PD 1,转化至 Rosetta（DE3）大肠杆菌,并对IPTG 浓度、诱导温度、诱导时间进行优化,对表达产物进行 SDS PAGE 和 Western blot 分析,应用流式细胞术对所获得重组蛋白的生物学活性进行鉴定。结果显示,成功克隆了鸡 PD 1胞外区基因;SDS PAGE 和 Western blot 分析结果表明,37℃、0．1 mmol/L IPTG 诱导4 h 时,PD 1胞外区融合蛋白表达量最高,以包涵体形式存在;流式细胞术分析结果表明,PD 1胞外区重组蛋白具有一定的生物学活性。