黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶性质鉴定

对黄海黄杆菌YS-9412-130菌株产低温碱性蛋白酶的理化性质研究表明，该酶由256个氨基酸组成，分子量为33000Dar，等电点pI为9.45，米氏常数Km为5×10-3mmol/L；酶的最适作用pH范围为9.5～10.5，最适作用温度30℃，具有一定的抗氧化稳定性。Ca2+、Mn2对酶有激活作用，而Hg2+、Ag+对酶有抑制作用。DFP、NBS严重抑制酶的活性,而同时该酶也能被EDTA抑制。结果表明该低温碱性蛋白酶为一新型的丝氨酸蛋白酶。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶发酵过程动力学研究

应用自动控制发酵设备，对黄海黄杆菌YS－9412－130碱性蛋白酶发酵动力学和工艺条件进行了研究。从基本的动力学概念和方程出发，通过分批发酵试验摸索了黄海黄杆菌YS－9412－130生长与代谢的基本规律，证明了发酵过程中低温碱性蛋白酶的形成为生长部分关联型。采用补料分批培养方法限制生长基质浓度，确定其一系列数值，从而推导出细胞生长与产物合成的动力学数学模型。     

产低温碱性蛋白酶黄海黄杆菌YS-9412-130的复合诱变原生质体选育

以黄海黄杆菌YS－9412－130突变株SW1－104为出发菌,在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体,对原生质体进行复合诱变,对大量再生突变株进行筛选和淡水驯化,最终获得了高产、稳定的碱性蛋白酶产生菌SW2－104,在自来水培养基中能够大量产酶,产酶活力为3910U／ml。从而解决了黄海黄杆菌YS－9412－130低温碱性蛋白酶大规模工业化生产设备和产业化区域的局限性。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶多克隆抗体的制备

利用纯化的黄海黄杆菌海洋低温碱性蛋白酶（Marine Low-temperature Alkaline Protease,MLAP),采用背皮内多点注射和皮下组织注射免疫相结合的方法对新西兰白兔进行免疫,制备了多克隆抗体,并对多克隆抗体进行了纯化。用ELISA的方法对其效价检测表明,其效价为128000。作者所做的Western印迹实验证明了抗原抗体的结合具有高度的特异性。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的基因克隆和序列测定

黄海黄杆菌YS－9412－130具有稳定的分泌低温碱性蛋白酶的能力。将其染色体DNA用Sau3AⅠ部分酶切后,低熔点琼脂糖回收2－10Kb的DNA片段,用Klenow大片段酶半补齐,与用SalⅠ酶切且半补齐的质粒pUC19连续后,转化E.Coli.JM109,构建基因文库。且酪蛋白平板法和酶联免疫吸附（ELISA）的活性筛选方法从基因文库中筛选到一株产海洋低温碱性酶的阳性克隆（命名为pHH1）。序列测定分析表明,此重组质粒包含有长度为768bp低温碱性蛋白酶基因的完整的开放读码框架（ORF）和上游基因调控序列。此片段编码由256个氨基酸组成的酶,计算分子量为83000Dal。通过Southern杂交证实了此片段来自于黄海黄杆菌YS－9412－130基因组DNA。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的制备工艺研究

对黄海黄杆菌所产低温碱性蛋白酶的工业生产技术和电泳纯级试剂酶的分离纯化工艺进行了实验。按照设计的中试生产技术，每吨发酵液可得酶粉20kg，粗酶比活大于20×10     

产低温碱性蛋白酶黄海黄杆菌YS-9412-130高产菌株的选育

以黄海黄杆菌YS－9412－130菌株为出发株,经亚硝基胍、硫酸二乙酯、紫外线（UV）与微波（MI）复合诱变和自然选育,获得1株产低温碱性蛋白酶高产稳定的突变株YS－9412－130－SW1－104,其产低温碱性蛋白酶为出发株的16倍。在摇瓶发酵培养条件下,酶活力达2320U／ml(20℃测定）,该诱变株具有Ref^r、Str^r、Amp^r和Met^-、Lys^-标记。突变株与出发菌株在细胞形态上比较,结果表明二者没有显著差异。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶活性必需基团分析

用化学修饰法结合酶的紫外吸收光谱变化研究黄海黄杆菌YS－9412－130分泌的海洋低温蛋白酶的功能基团性质，结果表明，羟基、咪唑基、ε－氨基及胍基均与酶活性有关，而羟基、巯基与酶活性无关。酶的性质与丝氨酸蛋白酶有很大的相似性。     

黄海黄杆菌YS-9412-130产酶发酵条件的优化

以产低温碱性蛋白酶的黄海黄杆菌YS－9412－130突变株SW2－104为培养菌株,进行碳源、氮源、无机盐、起始pH值、培养时间、接种量和接种龄等发酵条件的优化实验。实验结果证明,在以1％葡萄糖为碳源,以3.5％豆饼粉为氮源,无机盐：0.4%Na2HPO4、0.03%KH2PO4、0.02%MgSO4、0.1%Na2CO3、0.2?Cl2,起始pH值7.0,接种12h种龄的种子4％,20℃、250r/min的条件下在旋转摇床中培养36h,菌株产酶活性最高。     

产虾青素海洋酵母菌YS-185原生质体制备与紫外诱变

对海洋酵母菌YS-185原生质体制备、再生条件及紫外诱变育种进行了研究。结果显示,对数生长中后期菌龄较易形成原生质体,用EDTA和β-巯基乙醇混合溶液预处理15min有更高的原生质形成率,原生质体形成及再生率最佳条件为:0.5%蜗牛酶,35℃、酶解60min,对原生质体紫外线辐射60s诱变出YS-185-19突变株,其色素产量较出发菌株提高了93.4%。     

一株产低温碱性蛋白酶嗜冷海洋细菌YS-9412-130的分离和培养条件研究

自海水贝类中取样,经分离培养基和酪蛋白培养基复合培养,用检测蛋白酶产生水解圈和Folin-酚碱性蛋白酶活性测定相结合的方法从1000多份样品中初步筛到了产碱性蛋白酶活力高、性能优良的菌株YS－9412－130。对其初步研究结果表明,该菌只能利用有机氮源生长;在接近自然海水盐度、温度20℃、pH在7.0-9.0条件下,菌体生长和产酶较好。