HearNPV侵染对棉铃虫中肠碱性磷酸酶活性及表达水平的影响

【目的】通过研究棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)感染宿主昆虫后对宿主中肠碱性磷酸酶(ALP)活性与基因表达水平的影响,明确病毒在侵染宿主过程中对宿主昆虫中肠ALP的调控机理。【方法】采用不同剂量的HearNPV感染3龄棉铃虫,测定感染后不同时间昆虫中肠ALP酶活性及其编码基因表达水平,分析病毒感染试虫与未感染健康试虫的ALP活性和编码基因表达水平上的差异。【结果】HearNPV感染后,能够显著抑制ALP的活性,且抑制作用与感染病毒的剂量和感染后时间的增加呈正相关。ALP活性的下降与病毒下调其编码基因ALP的表达水平有关。【结论】HearNPV感染其宿主昆虫的过程中导致宿主ALP活性显著下降,该过程可能协助病毒粒子侵染宿主。病毒对ALP活性的抑制作用机理之一是下调了ALP编码基因的表达水平。     

僵蚕乙醇提取物对HearNPV的增效作用研究

【目的】利用僵蚕乙醇提取物作为棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)的生物增效剂,研究其对棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)毒力的增效作用与内在机制。【方法】以棉铃虫3龄幼虫为标靶试虫,在HearNPV中添加0~80μg/mL僵蚕乙醇提取物,研究其对HearNPV的增效作用,并通过僵蚕乙醇提取物对试虫ALP活性的影响探讨其增效作用机理。【结果】僵蚕乙醇提取物对HearNPV具有显著的增效作用,能够显著提高病毒的毒力,40μg/mL的剂量水平就能够使病毒感染的3龄棉铃虫在第6天达到90%的死亡率、第7天达到100%的死亡率。剂量80μg/mL的僵蚕乙醇提取物能够显著缩短棉铃虫3龄试虫的LT50和LT90值,其LT50和LT90分别较对照缩短23.2%和27.8%。同时,在HearNPV中添加僵蚕乙醇提取物可以显著降低试虫中肠的ALP活性,僵蚕乙醇提取物的使用剂量达到40μg/mL以上时,试虫中肠ALP活性较对照显著下降,且差异随感染时间的延长进一步增大。【结论】僵蚕可以作为病毒增效剂新材料,其在克服传统杆状病毒制剂杀虫速度慢的缺陷方面具有极好的发展前景。     

神经毒素基因RjAa17f在Sf9细胞中的表达及活性分析

【目的】在昆虫草地贪夜蛾细胞(Sf9)中表达一种能专一阻断昆虫钠、钾离子通道的神经毒素基因RjAa17f。【方法】运用杆状病毒真核表达系统表达RjAa17f毒蛋白,并用蛋白质印迹对其进行检测;测定RjAa17f毒蛋白引起健康棉铃虫中肠膜电位的变化,并对其毒力进行测定。【结果】通过重组杆状病毒质粒的转染和Western blot检测验证,神经毒素基因RjAa17f的重组Bacmid已经成功转染到Sf9细胞中,且在Sf9中表达出与预测大小一致的RjAa17f目的蛋白;此毒蛋白作用于棉铃虫中肠3~12h后,中肠膜电位与CK相比差异显著,且随着作用时间的延长,棉铃虫中肠膜电位呈逐步升高的趋势,作用9h以后,升高的幅度逐渐降低,趋于平缓。RjAa17f毒蛋白对棉铃虫的LD50为108.12μg/g。【结论】在Sf9细胞内表达出了有活性的RjAa17f毒蛋白,且该毒蛋白对棉铃虫中肠膜电位有显著改变。     

八角茴香水提物调控宿主免疫反应抗石斑鱼虹彩病毒的机制研究

【目的】从免疫应答角度探析八角茴香（Illicium verum Hook.f.）水提物（IVE）调控宿主免疫反应而发挥抗石斑鱼虹彩病毒（SGIV）的作用机制,为八角茴香应用于石斑鱼健康养殖产业及开发绿色、健康、高效渔用药物提供理论依据。【方法】通过光学显微镜观察及CCK-8细胞活力测定确定IVE的细胞安全工作浓度,利用实时荧光定量PCR检测IVE对宿主细胞干扰素相关基因（IFN、STAT1、PKR、ISG15、KK_α、STING和IRF3）表达的影响,并以光学显微镜观察和实时荧光定量PCR分析IVE在细胞水平抗SGIV的效果,通过石斑鱼活体试验进一步验证IVE的抗SGIV效果。【结果】IVE细胞水平的安全工作浓度≤0.50 mg/mL; IVE预处理GS细胞2 h可显著（P<0.05,下同）或极显著（P<0.01,下同）激活干扰素相关基因（IFN、STAT1、PKR、IKK_α、IRF3和STING）的表达。SGIV感染GS细胞24和48 h时,经IVE预处理的细胞病变效应（CPEs）明显少于未使用IVE预处理的GS细胞,且细胞内SGIV的MCP基因相对表达量极显著降低,表明IVE可有效抑制SGIV感染;此外,IVE可增强SGIV感染GS细胞中干扰素相关基因的表达,具体表现为IFN、STAT1和IRF3基因在病毒感染后24 h极显著上调,PKR、IKK_α、ISG15和STING基因在病毒感染后24和48 h呈显著或极显著上调趋势。在石斑鱼活体试验中,IVE与SGIV混合腹腔注射后石斑鱼脾脏中SGIV的MCP基因相对表达量在病毒感染后24和48 h均极显著低于仅注射SGIV的石斑鱼。【结论】IVE具有抑制SGIV感染的功能,其作用机制可能是通过诱导干扰素相关基因表达而激活宿主的抗病毒状态,从而发挥间接抗SGIV效果;也说明八角茴香在水产疫病防控中具有研发成渔用抗病功能制剂的潜力。     

棉铃虫核型多角体病毒几丁质酶的原核表达及其协同增效作用

【目的】在大肠杆菌中表达棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒(HearNPV)几丁质酶(Chi A),利用表达产物进行病毒增效作用研究,以明确杆状病毒Chi A对HearNPV的协同增效作用。【方法】用PCR方法扩增出不含N端信号肽编码序列的Chi A基因片段,分别克隆至原核表达载体pMAL-p2x和pET-32a中,构建重组表达载体,并分别在大肠杆菌TB1和BL21(DE3)中进行融合表达,测定融合蛋白对HearNPV的增效作用。【结果】克隆的基因片段经过测序后连接表达载体,成功构建了重组表达载体pMAL-p2x-Chi A和pET-32a-Chi A。重组载体转化相应菌株并进行诱导表达,发现pMAL-p2x-Chi A在大肠杆菌TB1中的表达量占细菌总蛋白的15.8%,其中20.0%为可溶性表达;pET-32a-Chi A在BL21(DE3)中的表达量占细菌总蛋白的26.8%,其中30.2%为可溶性表达。选用pET-32a-Chi A在BL21(DE3)中的表达产物作为增效蛋白,当表达的可溶性HearNPV Chi A的添加水平为1.0μg/mL时,其能够显著提高病毒毒力,棉铃虫的死亡率较对照提高36.6%。【结论】利用大肠杆菌表达的可溶性HearNPV Chi A,对HearNPV具有明显的增效作用。     

BmNPV对家蚕BmN细胞周期及周期蛋白基因表达水平的影响

【目的】研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedroviruses,BmNPV)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞周期及细胞周期蛋白基因转录水平的影响。【方法】用BmNPV感染家蚕BmN细胞,分别在病毒感染后的不同时间(12,24,36,48h),应用实时荧光定量PCR方法检测细胞周期蛋白基因CyclinA、CyclinB、CyclinE的表达情况,用流式细胞仪检测细胞周期的变化。【结果】BmNPV感染24h后,BmN细胞出现明显感染症状,变为圆形;48h后细胞核内出现多角体。随着感染时间的延长,CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均下降,分别在感染12,24,36h后,表达量降低为0。流式细胞仪检测结果显示,在BmNPV感染后24h左右,抑制于G2/M期的BmN细胞达到68%。【结论】BmNPV感染家蚕BmN细胞后,导致CyclinB、CyclinE基因表达量降低,对CyclinA基因表达量的影响较小;同时BmNPV感染可以将BmN细胞发育抑制于G2/M期。     

Ac-MNPV lef-10在Sf9细胞中的表达与定位研究

【目的】研究苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子lef-10在宿主细胞Sf9中的时空表达及定位,为进一步研究lef-10的功能提供理论基础。【方法】利用不同的特异引物,通过PCR方法扩增lef-10及innateP-lef-10目的片段,将目的片段分别克隆到载体pTriEx-SP-GFP上,得到重组质粒pTriEx-lef10-GFP和pTriEx-innateP-lef10-GFP,经过双酶切检测构建载体。将重组质粒分别与Bacmid共转染Sf9细胞,用得到的重组病毒分别于4,8,16,24,36h再次感染宿主细胞;用激光共聚焦显微镜观察lef-10的表达及亚细胞定位情况。【结果】在感染早期,lef-10就已开始表达;随感染时间的推移,lef-10逐渐移动至细胞核,且在晚期和极晚期时相,lef-10主要集中于细胞核中。【结论】在天然条件下,lef-10是作为晩期表达因子发挥功能的,并且对其他基因的转录可能起一定的调控作用。     

四氯虫酰胺对棉铃虫生物活性的温度效应及其解毒酶相关机制

【目的】研究四氯虫酰胺对棉铃虫生物活性的温度效应及其影响程度,分析棉铃虫体内4种解毒酶系对该温度效应的影响机制。【方法】采用浸叶法,分别测定15、20、25、30和35℃条件下,四氯虫酰胺对棉铃虫的室内生物活性,测定四氯虫酰胺亚致死剂量下,棉铃虫体内羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、多功能氧化酶(MFO)和尿苷二磷酸糖基转移酶(UGT)比活力的变化。【结果】四氯虫酰胺对棉铃虫的生物活性具有明显的正温度效应,与15℃时相比,其温度系数从+5.52增长为+1 257.35。四氯虫酰胺对棉铃虫的正温度效应可能与GST和MFO有关,其中GST在较低温下的活性变化尤为显著,而CarE和UGT则未发现与四氯虫酰胺生物活性的正温度效应明显相关。【结论】四氯虫酰胺对棉铃虫表现为明显的正温度系数药剂,高温时使用生物活性最佳,低温时抑制GST活性,可能会提高四氯虫酰胺对棉铃虫的生物活性。     

地鳖虫提取物对大鼠运动能力和骨骼肌抗氧化酶活性的影响

【目的】探讨补充地鳖虫提取物对大鼠运动能力、骨骼肌抗氧化酶表达水平及活性的影响,以明确其作为运动补剂的可能性。【方法】对大负荷游泳训练大鼠按各组平均体质量的0.5,1.0和1.5g/kg剂量分别补充地鳖虫提取物,在8周大负荷训练结束后测定大鼠力竭游泳时间、骨骼肌抗氧化酶活性及其原因表达水平。【结果】8周大负荷训练后,与单纯大负荷运动组相比,补充地鳖虫提取物组大鼠运动能力显著提高,其骨骼肌SOD、CAT、GST3种抗氧化酶活性均显著增加,同时3种抗氧化酶编码基因的表达水平也显著上调。【结论】补充地鳖虫提取物能够显著提高大鼠运动能力和骨骼肌抗氧化酶活性,其可能的机理是地鳖虫提取物上调了抗氧化酶编码基因的表达水平。     

MBF2转录调控小菜蛾谷胱甘肽S-转移酶代谢氯虫苯甲酰胺的功能

【目的】探究转录调控因子MBF2 (multiprotein bridging factor 2)调控小菜蛾（Plutella xylostella）体内谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase,GST）的功能,及其在小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺中的作用,为阐明小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的解毒代谢机制提供理论依据。【方法】采用浸叶法测定敏感（SS）、广东连州（LZ）、云南通海（TH）3个小菜蛾种群对氯虫苯甲酰胺的抗性水平,酶动力学法测定3个种群的GST活性;使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析MBF2在不同抗性种群小菜蛾中的表达差异;采用氯虫苯甲酰胺LC50诱导12 h,分析其对小菜蛾MBF2的诱导表达作用;应用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术研究MBF2对GST基因的调控作用,并测定沉默MBF2后小菜蛾的GST活性;结合沉默后小菜蛾对药剂的敏感性变化,验证MBF2在小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺中的作用。【结果】两个抗性种群（TH和LZ）相较SS种群分别达到了中抗及高抗的水平,TH和LZ抗性倍数分别为54.27和289.58;TH和LZ小菜蛾...     

加州新小绥螨对截形叶螨的捕食作用

为明确加州新小绥螨Neoseiulus californicus(McGregor)对截形叶螨Tetranychus truncate(Ehara)的捕食潜力,采用捕食者功能反应方程及参数研究加州新小绥螨对截形叶螨各螨态捕食作用。结果表明,加州新小绥螨对雌成螨、若螨、卵的选择性捕食系数分别为0.365、1.276和1.390。在不同温度条件下,加州新小绥螨对截形叶螨的功能反应均属于HollingⅡ型;对猎物卵和幼若螨的控制能力最强。在试验温度范围内,加州新小绥螨的捕食能力随温度升高呈先增后减趋势,28℃时最强,对截形叶螨雌成螨、若螨和卵的攻击系数(a)最大,分别为0.639、0.730和0.842;处理时间最短,分别为0.126、0.075和0.039d;最大日捕食量分别为7.943头、13.405头和25.575粒。加州新小绥螨的捕食作用存在较强的种内干扰反应,随着捕食者密度的增大,平均捕食量逐渐减少,捕食作用率也相应降低,捕食作用率与其自身密度的关系为E=0.423P-0.747。     

兰州百合和有斑百合的核型研究

【目的】研究兰州百合及有斑百合的染色体核型。【方法】利用染色体常规压片的方法,对兰州百合和有斑百合的染色体数目及核型进行了研究和分析。【结果】兰州百合的核型公式为2n=2x=24=2m+2sm+6st+14t,相对长度为6.35%～12.07%,核型不对称系数为83.25%,染色体相对差异较大。有斑百合的核型公式为2n=2x=24=4m+12st+8t,相对长度为6.11%～12.90%,核型不对称系数为80.11%。【结论】兰州百合的核型类型属于3A型,有斑百合的核型类型为3B型,以有斑百合核型的进化较高,可见不同居群的百合间核型存在差异。     

深绿木霉对青蒿的促生作用

为了研究深绿木霉对青蒿的促生作用,用深绿木霉菌丝体和孢子分别施用于苗期和成株期的青蒿,统计比较各项生长发育指标和生理指标.结果表明:与清水对照相比,深绿木霉菌丝体和孢子均能显著促进青蒿幼苗生长,但对大田成株青蒿没有显著促生作用.深绿木霉适合作为青蒿苗肥,部分替代化肥.     

紫荆黄萎病病原菌研究

在紫荆树上发现1种紫荆新病害 紫荆黄萎病,病叶症状有2种类型：一种为灰绿色干枯型,主要表现为叶片从边缘开始失水萎蔫,逐渐向叶片中心扩展,后期整个叶片皱缩卷曲、质地较脆,呈现灰绿色焦枯状;另一种为黄色萎蔫型,前期叶片从边缘开始变黄萎蔫,逐渐向内部扩展,病健交界处有明显界限,后期叶片皱缩,颜色呈现淡黄色到淡橘黄色。发病枝条的维管束呈浅橘红色或褐色,病叶不脱落。依据Koch’s准则证明,分离物CC001是引起该病害的病原菌。对CC001菌株的rDNA ITS区段进行PCR扩增和测序,并结合形态学特征鉴定为大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）。寄主范围测定结果表明,该病菌还可以侵染马铃薯和棉花。该研究是国内关于紫荆黄萎病的首次报道。     

甘蓝型油菜与黑芥双倍体减数分裂的原位杂交分析

【目的】探明植物杂种后代减数分裂异常与花粉败育之间的关系。【方法】通过甘蓝型油菜与黑芥种间杂交和基因组加倍,获得芸薹属三基因组双倍体,采用基因组原位杂交方法,观察三基因组双倍体花粉母细胞的减数分裂规律。【结果】与单倍体相比,双倍体花粉育性得到一定恢复,但可育花粉的比例较低,只有10%~20%。基因组原位杂交结果显示,双倍体花粉母细胞减数分裂终变期染色体以形成同源二价体为主,但也有部分染色体形成四价体或六价体。四价体有3种形式:B基因组染色体形成的四价体、AC基因组染色体形成的四价体及B与AC基因组之间形成的异配四价体。减数分裂后期Ⅰ染色体均等分离的细胞占总数的70%左右,在第2次减数分裂期也观察到非正常分裂如非四分孢子、微核等现象。【结论】减数分裂过程中的染色体异常行为可能是导致花粉育性不高的重要原因;虽然不正常的减数分裂导致花粉育性下降,但双亲染色体的异源联会可为双亲遗传物质的交换提供条件。     

基于mt DNA COI基因的宁夏烟粉虱及温室白粉虱分子鉴定

基于线粒体COI基因(Cytochrome coxidase subunit I gene)对宁夏地区粉虱进行分子鉴定。选取宁夏19个粉虱地理种群的77个样本作为试验材料,用Bioedit 7.2.5软件对COI基因序列进行读取、整合、对齐比对处理,用软件MEGA 7.0中的Kimura 2-parameter模型计算种内与种间遗传距离,并用邻接法(NJ法)构建系统发育树,用软件DNASP 5.10进行遗传多样性的分析,用软件Network 5.0构建单倍型网络图。结果显示,77个样本中的46个为Q型烟粉虱(Bemisia tabaci),31个为温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum),表明目前Q型烟粉虱已经传入宁夏银川市、石嘴山市、中卫市等,亟需对其危害和扩散进行有效控制。     

长枝木霉T6菌株对美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用

为探明长枝木霉T6菌株对美洲南瓜枯萎病菌的作用机理,采用对峙培养、显微观察、孢子萌发、室内防效测定等方法研究其抑制能力和防治效果。结果表明:长枝木霉T6菌株对美洲南瓜枯萎病菌具有较强的抑制作用,对峙培养7d时,长枝木霉T6菌株对该病菌的抑制率为60.09%;显微形态观察表明:长枝木霉T6菌株菌丝与美洲南瓜枯萎病菌菌丝发生缠绕;长枝木霉T6菌株发酵液对美洲南瓜枯萎病菌分生孢子萌发具有明显的抑制作用,抑制率为31.00%;长枝木霉T6菌株对美洲南瓜枯萎病具有较好的防治效果,室内盆栽防效为69.06%。     

不同木霉菌株对黄瓜枯萎病菌的拮抗作用

比较不同木霉菌株对黄瓜枯萎病菌的竞争作用、重寄生作用、抗生作用和防病作用的差异,筛选出高效菌株,为利用木霉菌防治土传病害提供理论依据。通过与致病菌对峙培养,研究竞争作用。结果表明:供试木霉菌能限制黄瓜枯萎病菌的菌丝扩展,哈茨木霉(Trichoderma harzianum)TH菌株竞争作用最强,菌丝扩展抑制率为67.70%。试验发现木霉菌株能够通过紧贴、缠绕、穿透等方式寄生于黄瓜枯萎病菌的菌丝上,最后引起菌丝断裂,细胞内容物外泄。通过无菌滤膜过滤获得的不同木霉菌代谢产物抗生作用明显,TH菌株代谢产物的抑菌圈直径达到3.9cm,对黄瓜枯萎病菌的菌丝生长和孢子萌发的抑制率分别为57.19%和68.35%。盆栽试验结果显示,育苗时施加木霉菌株不同程度控制苗期黄瓜枯萎病的发生,TH菌株防病作用最强,防效为64.34%,绿色木霉(Trichoderma viride)TV菌株促进黄瓜生长作用最强,地上部分和地下部分鲜质量分别增加42.81%和86.92%。     

异尖科线虫诱导长江刀鲚免疫反应研究

为探究长江刀鲚TH1细胞、MIF、IL-10、TNF-α、IgM、IgT和IgD的常规水平及异尖科线虫寄生所导致的免疫变化,采用ELISA法分别测定了空白组和3个寄生组的脾脏、头肾和血清中7种免疫分子的表达水平。结果显示：（1）空白组脾脏、头肾和血清中免疫分子水平均表现为IgD（P<0.01）> IgM(P<0.001）>IgT（P<0.001）> MIF(P<0.001)> TH1细胞(P>0.05)>TNF-α(P>0.05)>IL-10,且血清中免疫分子水平显著高于脾脏和头肾（P < 0.001）;（2）各寄生组脾脏中7种免疫分子水平均显著高于空白组（P<0.001）,头肾中除IgM外的6种免疫分子水平均显著高于空白组（P<0.05）,血清中仅IL-10水平显著高于空白组（P<0.001）;（3）整体而言,长江刀鲚寄生组IL-10水平随着寄生数量增加而下降,TH1细胞随着寄生数量的增加呈下降后上升趋势,MIF、TNF-α、IgD、IgM和IgT则与TH1细胞相反,且脾脏（IgT、TNF-α、TH1细胞、MIF、IgM）、血清（TH1细胞、IgD、IL-10、TNF-α）和头肾（IgT、TNF-α）中免疫分子水平与寄生虫数量间的相关关系均达到显著水平。综上,异尖科线虫寄生可增加长江刀鲚免疫分子的表达水平,诱导炎症反应和适应性免疫反应的发生,脾脏、头肾和血清中部分免疫分子水平与异尖科线虫数量间的相关性显著,其中血清TH1细胞、脾脏中IgT和TNF-α可作为长江刀鲚应对异尖科线虫寄生的免疫功能测定优选指标。     

沙门菌、巴氏杆菌和大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立

旨在建立一种可以应用于临床样本同时检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌感染的多重PCR方法。根据NCBI上已收录的沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌 kmt1基因和大肠埃希菌23SrRNA基因的全基因序列,设计并合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能够同时检测3种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法可以从沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌以及3种细菌的混合物中扩增出3条大小分别为286 bp、457 bp和652 bp的特异性条带,其他对照组检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×10　、1.99×10　、2.01×10　 CFU/mL;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。可见：所建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的混合感染。