昆明白小鼠卵母细胞去核研究

为了提高昆明白小鼠MⅡ期卵母细胞的去核效率及质量,该研究在不同条件下,比较了小鼠卵母细胞的去核效果:将小鼠MⅡ期卵母细胞放入含蔗糖浓度分别为0.01、0.02、0.03 g/mL的M2-液微滴中,在体式显微镜下观察显核效果以确定最佳浓度;将有清晰可见细胞核的卵母细胞放入含细胞松弛素B(Cytocha-lasin-B,CB)浓度分别为5、7.5、10μg/mL操作液中去核,显微镜下确定去核率。结果表明:操作液中加入蔗糖浓度为0.02g/mL时显核效果最好;去核时操作液中细胞松弛素B浓度为10μg/mL时去核死亡率最低。     

EGF和β-巯基乙醇对羔羊卵母细胞体外受精和体外发育的影响

[目的]为优化幼畜卵母细胞体外培养体系提供理论基础。[方法]研究在成熟液中添加EGF和β-巯基乙醇对绵羔羊卵母细胞受精和卵裂、囊胚情况的影响,并与成年绵羊卵母细胞进行比较。[结果]在成熟液中添加不同浓度的EGF对羔羊卵母细胞卵裂率和囊胚率无显著影响(P0.05)。添加不同浓度的β-巯基乙醇可以提高羔羊卵母细胞囊胚率,其中添加100μmol/Lβ-巯基乙醇有显著影响(P0.05),但对卵裂率影响不显著(P0.05)。羔羊卵母细胞卵裂率和囊胚率均显著低于成年羊(P0.05)。添加100μmol/L的β-巯基乙醇能显著提高羔羊卵母细胞正常受精率(P0.05),且与成年羊卵母细胞受精率差异不显著(P0.05)。未添加β-巯基乙醇多精入卵率显著高于成年羊(P0.05),而添加100μmol/L的β-巯基乙醇多精入卵率与成年羊差异不显著(P0.05)。成熟液中不添加β-巯基乙醇时未受精率(20.0%)高于成年羊组(12.3%)和β-巯基乙醇(13.5%),但差异不显著(P0.05)。[结论]添加100μmol/L的β-巯基乙醇能显著提高羔羊卵母细胞发育能力,提高正常受精的比例并减少多精子受精的发生,但羔羊卵母细胞发育能力仍显著低于成年羊。     

Effect of GPAG Supplement on Porcine Oocyte Maturation and Its Following Embryonic Development by Parthenogenetic Activated

The aim of this study was to compare the effect of GPAG and commonly used FCS on porcine oocyte maturation and subsequent embryonic development after the fertilization. COCs were aspirated from follicles and cultured for 16, 24, 32, 40 and 48 h in TCM-199 medium either with GPAG or FCS. After 24 h with GPAG, 89.4% of oocytes reached M Ⅰ stage while in the medium supplemented with FCS, only 27.7% of oocytes reached the same stage （P〈0.05）. Prolonged incubation for up to 32 h clearly demonstrated that some of oocytes cultured in GPAG medium were at M Ⅱ stage （35.7%）, few of oocytes from FCS medium were at M Ⅱ stage （7.5%） （P〈0.05）. Both groups of oocytes reached the same stage of maturation within 48 h. After 48 h of culture, the oocytes with extruded polar bodies were inseminated. Fertilized oocytes were cultured in PZM3 medium supplemented with 3 mg.mL of BSA. After 7 days, the development and the quality of embryos were evaluated. The results showed that the maturation of oocytes in the presence of GPAG significantly increased their subsequent developmental ability when compared with FCS supplementation （29.2% ： 18.9% of blastocysts, P〈0.05）. However, differential staining revealed that once blastocysts were formed in either group, they had the same total cell number （39 ： 38） and the ICM/total cell ratio （0.26 ： 0.28）     

催乳素和牛卵泡液对胚胎体外成熟及未成熟的牛卵母细胞的影响

对催乳素和牛卵泡液在水牛卵母细胞体外成熟中的作用进行了探讨．来自屠宰场水牛卵巢的卵母细胞和卵丘细胞复合体,在含体积分数为5％CO2的培养箱中培养24～26h,然后通过体外受精测定其受精和胚胎发育能力．实验1在成熟液中添加1．0μg/mL催乳素(PRL),卵母细胞的囊胚发育比例(12．8％)比对照组(9．1％)高但不显著．实验2添加5％牛卵泡液(BFF),卵母细胞卵裂的比例明显高于对照组,但囊胚形成率则几乎一样;添加1．0μg/mL PRL和5％ BFF组卵母细胞卵裂的比例为38．1％,而发育成囊胚阶段的卵母细胞的比例为14％．试验结果表明：添加适宜浓度的BFF和PRL能促进未成熟的水牛卵母细胞体外成熟后的胚胎发育能力．     

磷酸二酯酶抑制剂对水牛卵母细胞体外成熟的影响

[目的]探讨磷酸二酯酶抑制剂米力农(milrinone)对水牛卵母细胞成熟的影响。[方法]水牛卵母细胞分成3组,分别在含0、50、100μmol/L的milrinone的成熟液中培养16 h后,每组的一半卵母细胞用来染色,检验核成熟情况;另一半卵母细胞再在不含milrinone的成熟液中培养12 h,挑选形态正常的卵母细胞受精后培养。[结果]添加50和100μmol/L milrinone的成熟液成熟的卵母细胞的生发泡破裂(GVBD)比率分别为25.9%和12.1%,显著低于对照组(76.9%);但另一半卵母细胞再培养、受精后试验组(50、100μmol/L mil-rinone)的分裂率(59.3%和61.2%)和囊胚率(35.9%和31.1%)与对照组(56.7%和28.8%)相比均无显著性差异(P0.05)。[结论]milrinone对水牛卵母细胞的成熟具有明显的抑制作用,成熟抑制解除后水牛卵母细胞仍可保持较高的发育潜能。     

绵羊卵巢卵母细胞体外成熟培养的研究

研究了绵羊卵巢卵母细胞体外成熟培养,并就影响体外成熟的因素进行了探讨。试验表明:添加10%和15%的胎牛血清(FCS)绵羊卵巢卵母细胞的体外成熟率(81.25%和83.75%)明显高于不添加FCS的对照组的卵母细胞成熟率(65.00%);在基础培养基中10%的FCS存在的条件下,添加一定质量分数的促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)时,卵母细胞的体外成熟率明显高于不添加FSH和LH的对照组的绵羊卵母细胞的体外成熟率;培养24 h和26h卵母细胞体外成熟率(75.00%和80.00%)明显高于培养20 h的卵母细胞体外成熟率(63.30%);从3~6 mm卵泡中抽取的卵母细胞体外成熟率(81.50%)明显高于从1~3 mm卵泡中抽取的卵母细胞的体外成熟率(53.30%)。     

尿嘧啶和ATP对牛卵母细胞成熟及激活后孤雌胚胎发育的影响

[目的]探究尿嘧啶(Uracil)和三磷酸腺苷二钠盐(ATP)对牛卵母细胞成熟及激活后孤雌胚胎发育的影响。[方法]在体外成熟培养液中添加不同浓度的尿嘧啶和ATP,研究其对牛卵母细胞体外成熟及激活后孤雌胚胎发育能力的影响。[结果]在成熟培养液中添加50μg/ml尿嘧啶能够显著提高卵母细胞的成熟率、分裂率及孤雌胚胎囊胚率;在成熟培养液中分别添加0、250、500、750μg/mlATP,对卵母细胞成熟率影响不大,但添加500μg/ml ATP能显著提高激活后孤雌胚胎囊胚率。[结论]该研究为牛卵母细胞IVM研究提供了参考资料。     

不同渗透压及山梨醇浓度对猪体外受精卵早期发育的影响

探讨胚胎培养液中不同渗透压及山梨醇浓度对猪体外受精卵早期发育的影响。结果表明,用NaCl调节渗透压时,猪体外受精卵的囊胚率随着渗透压的升高而增加,当渗透压为320~335mOsm时囊胚率最高;而用山梨醇调节渗透压时,以1.8mg/mL山梨醇调节渗透压至270~285mOsm的效果较好;同一渗透压水平下,培养液中添加山梨醇与未添加的处理组间差异不显著。说明本研究条件下,适当提高胚胎培养液渗透压有利于猪体外受精卵的早期发育。     

促卵泡素对犬卵母细胞体外成熟的影响

为探究基础培养基中添加促卵泡素(FSH)对犬卵母细胞体外成熟的影响,采用切割法收集卵巢表面的卵丘卵母细胞复合体(COCs),培养在添加不同浓度FSH(0,0.1,1,10 IU/mL)的TCM-199基础培养液中.体外培养72 h后,对卵母细胞进行染色观察其细胞核成熟情况.结果表明,FSH的添加没有增加犬卵母细胞恢复减数分裂的细胞数量.此外,不同处理对卵母细胞卵丘扩散无差异.     

绵羊卵母细胞孤雌发育的研究

系统地研究了绵羊卵母细胞成熟培养时间、6-DMAP激活时间以及改进的培养液对绵羊卵母细胞孤雌发育的影响.结果表明：卵母细胞成熟培养25 h和26 h激活组的囊胚率和孵化率显著高于成熟培养24 h激活组;6-DMAP激活液作用2 h,激活效果较好;培养液改进后,孤雌胚的囊胚率有上升趋势,但差异不显著.在本试验条件下,卵母细胞体外成熟培养25 h后在6-DMAP中激活2 h,利用改进后的培养液进行培养,能获得较好的发育效果.     

乙二胺四乙酸钠、能量基质、氨基酸对猪卵母细胞体外成熟和早期孤雌发育的影响

猪的卵巢卵母细胞在含不同剂量葡萄糖+丙酮酸钠的成熟培养基中体外成熟培养44-48 h,检查核成熟率(试验一),进行化学法孤雌激活后,在含不同浓度的乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na)和不同剂量的葡萄糖+谷氨酰胺+牛磺酸+亚牛磺酸的培养基中进行体外培养,检查孤雌激活胚第48小时的卵裂率和第168小时的囊胚发育率(试验二),研究成熟培养基中葡萄糖+丙酮酸钠剂量对卵母细胞体外成熟核成熟率的影响及培养基中不同浓度EDTA-Na和葡萄糖+谷氨酰胺+牛磺酸+亚牛磺酸的剂量对孤雌激活胚胎体外发育的影响.结果表明:(1)葡萄糖+丙酮酸钠在1倍剂量时,猪卵母细胞体外成熟的核成熟率为(59.3±5.0)%;当剂量加倍时,核成熟率极显著下降(P<0.01),为(51.0±4.4)%.(2)当EDTA-Na浓度增高,囊胚发育率上升,当浓度达50μmol.L-1时囊胚发育率最高,为(7.2±4.1)%,此后随浓度升高囊胚发育率下降;添加适当浓度(25-100μmol.L-1)EDTA-Na对猪孤雌激活胚的囊胚发育有利(P<0.05),当浓度达200μmol.L-1时其有利作用消失.(3)培养基中葡萄糖+谷氨酰胺+牛磺酸+亚牛磺酸的剂量过高对卵裂率无显著影响(P>0.05),但对囊胚发育不利(P<0.05).可见:(1)适当浓度(25-100μmol.L-1)EDTA-Na对猪早期胚胎体外发育具有促进作用;(2)成熟培养基中能量基质剂量过高会抑制猪卵母细胞体外成熟;(3)胚胎培养基中葡萄糖+谷氨酰胺+牛磺酸+亚牛磺酸的剂量过高会抑制猪早期胚胎的体外发育.     

透明质酸对绵羊卵母细胞体外成熟与早期胚胎发育的影响

[目的]探讨不同浓度透明质酸对绵羊卵母细胞的体外成熟和早期胚胎发育效果的影响。[方法]以绵羊卵母细胞为试验材料,分别在绵羊卵母细胞体外成熟和体外胚胎培养液中添加0、1.5、3.0、4.5 mg/ml的透明质酸（HA）,研究其对绵羊卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响。[结果]当HA浓度为1.5和3.0 mg/ml时,绵羊卵母细胞的成熟率分别为72.54%和62.17%,显著高于对照（P〈0.05）。当HA浓度介于1.5～3.0 mg/ml时,HA对绵羊卵母细胞体外成熟有促进作用。当HA浓度为1.5 mg/ml时,绵羊卵母细胞的卵裂率和囊胚率均显著高于对照组与其他组（P〈0.05）,囊胚细胞总数显著高于其他各组（P〈0.05）。这说明HA可以促进绵羊卵母细胞的早期胚胎发育。[结论]HA不仅可以促进绵羊卵母细胞成熟,而且在细胞分化中也会起作用。当HA浓度为1.5 mg/ml时,最有利于绵羊的早期胚胎发育。     

N-乙酰半胱氨酸对玻璃化冻存小鼠GV期卵母细胞成熟和后续胚胎发育能力影响

冷冻保存后的GV期卵母细胞内大量积累ROS,影响胚胎发育。NAC作为一种抗氧化剂,可缓解氧应激造成的损伤。但NAC对冷冻GV期卵母细胞是否存在维持作用尚待研究。为探究NAC在冷冻、解冻后小鼠GV期卵母细胞发育中作用,检测冷冻保存后小鼠GV期卵母细胞在添加不同浓度NAC成熟培养液后成熟情况,观察其卵裂率与囊胚率、线粒体分布、ROS水平和受精后胚胎发育等。结果表明,添加1.5 mmol·L~(-1)NAC,冷冻保存后,小鼠GV期卵母细胞,线粒体排布均匀,卵母细胞比例显著提高,ROS水平降低。NAC可改善小鼠GV期卵母细胞经冷冻保存后复苏和体外成熟水平,提高其发育能力。     

生长激素和胰岛素对猪卵母细胞体外成熟及卵裂的影响

研究了生长激素(STH)、胰岛素(insulin)单独或者联合作用对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活后卵裂的影响。结果表明:STH、胰岛素对卵母细胞体外成熟及孤雌激活后卵裂呈现双重效应。在mNCSU-23基础液中添加0.15μg/mLSTH组的成熟率和卵裂率显著高于对照组及0.01,0.05,0.1,2μg/mL组(P<0.05);添加5μg/mL,8μg/mL胰岛素组的成熟率显著高于对照组及0.5,2,10μg/mL组;添加5μg/mL胰岛素组的卵裂率也显著高于对照组及0.5,2,8,10μg/mL组;0.15μg/mLSTH与2μg/mL胰岛素联合添加组的成熟率和卵裂率最高,同其他组相比,差异显著。     

猪卵泡液和胎牛血清对猪小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响

本研究探讨了猪卵泡液(pFF)和胎牛血清(FCS)对猪小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响。将猪小腔卵泡(直径<2mm)卵母细胞-卵丘复合体(COCs)以15～35枚为一组随机置于添加不同浓度(0、5%、10%、20%)pFF(试验一)或不同浓度(0、5%、10%、20%)FCS(试验二)的改良TCM-199成熟液中培养44～48h,观察卵母细胞的核成熟率和卵丘扩散情况。试验一结果显示,成熟液中添加10%pFF与对照组和添加5%、20%pFF组相比,显著提高猪小腔卵泡卵母细胞的核成熟率(28 2%比20 5%、20 9%、22 3%;p<0 05);添加5%和20%pFF组与对照组相比,它们的小腔卵泡卵母细胞核成熟率之间差异不显著(p>0 05);添加5%pFF组的COCs卵丘细胞呈现第3类扩散,添加10%和20%pFF组的COCs卵丘细胞呈现第4类扩散,而不添加pFF的对照组的COCs卵丘细胞呈现第2类扩散。试验二结果显示,成熟液中添加10%FCS与对照组和添加5%、20%FCS组相比,明显提高猪小腔卵泡卵细胞的核成熟率(60 0%比37 5%、40 2%、43 9%;p<0 05);添加5%和20%FCS组与对照组相比,它们的小腔卵泡卵细胞核成熟率之间差异不显著(p<0 05);FCS在COCs体外成熟培养的前22～24h促进了卵丘扩散(3个处理组的COCs卵丘细胞呈现第3类扩散,而对照组COCs的卵丘细胞呈现第2类扩散)。研究结果表明:(1)成熟液中添加pFF可促使猪小     

颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

试验系统研究了颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响。COCs、机械裸卵和自然裸卵的体外成熟率分别为68.3%、45.6%和6.1%,组间差异显著(P<0.05),卵裂率分别为41.5%、8.1%和0,差异显著(P<0.05)。对照组和15×104个/ml、150×104个/ml颗粒细胞组卵母细胞体外成熟率分别为65.9%、60.2%和64.6%,无显著差异(P>0.05),但均显著高于1 500×104个/ml(50.0%)和1.5×108个/ml(30.3%)颗粒细胞组(P<0.05)。颗粒细胞单层共培养系统卵母细胞成熟率为75.8%,显著高于150×104个/ml颗粒细胞条件培养液组(63.4%)和M199培养液组(66.7%)(P<0.05)。颗粒细胞单层共培养系卵裂率为50.0%,显著高于150×104个/ml条件培养液组(36.7%)和M199培养液组(38.2%)(P<0.05)。     

家兔原始卵泡卵母细胞体外发育的培养体系研究

本研究根据家兔卵巢的发育特征初步探讨了家兔卵巢卵母细胞体外发育的培养体系。采集新生或30日龄家兔卵巢在不同培养液中培养,并分析家兔卵母细胞的体外发生与成熟情况与体内正常发育的兔卵巢卵母细胞之间的差异,来筛选和优化家兔卵巢卵母细胞的体外培养体系。本试验从高糖DMEM、FSH浓度、BSA/血清等3个方面来筛选较好的培养条件,结果表明:①不添加高糖DMEM的M199培养液与添加的相比,卵巢上卵母细胞数量要多,但随着培养时间的延长,组织块上卵母细胞的形态会变得不清楚;②家兔卵巢组织在FSH浓度为50和100m IU/m l、添加血清的DMEM/F12培养液中生长较好,体外培养24d后,卵母细胞数量多,直径增加到65μm;③与添加BSA的培养液相比,添加血清的培养液中的卵巢卵母细胞生长状态较好,体外培养28d后,卵母细胞数量多,并且直径可达65μm。     

卵泡大小及卵泡液对牛卵母细胞体外受精后发育的影响

 以屠宰场牛卵巢为材料，研究了卵泡大小和卵泡液对牛卵母细胞体外成熟、受精和培养后发育潜力的影响。试验1：按照卵泡大小将卵丘卵母细胞复合体（COCs）分为4个试验组：＞8 mm组、2～8 mm组、腔前卵泡（PF）卵母细胞组和混合（将前3种卵母细胞混合）组。结果表明，卵泡大小直接影响卵母细胞受精后的发育，同时，源自不同大小卵泡的卵母细胞混合培养，可以促进未成熟的腔前卵泡内卵母细胞的发育。试验2：将源自优势卵泡（＞8 mm）、小卵泡（2～8 mm）和混合（所有卵泡液混合）的牛卵泡液（BFF），按照10%添加到成熟培养液中，3个试验组的卵裂率和囊胚率均高于没有添加BFF的对照组(P<0.05)，但添加10%的优势卵泡液使卵母细胞和胚胎发生粘连，易于造成丢失。试验3：与未添加BFF的对照组相比，成熟培养液中分别加入10%、20%和40%的混合BFF，均可明显促进卵母细胞受精后的发育(P<0.05)，但20%组和40%组出现卵母细胞及胚胎粘连。因此，成熟培养液中添加10%的混合BFF较为适宜。     

影响山羊卵母细胞OPS法冷冻效果因素的研究

研究了不同玻璃化液、冷冻基础液以及卵母细胞的成熟阶段等因素对山羊卵母细胞OPS法玻璃化冷冻后发育效果的影响。结果表明,玻璃化液20%EG+20%DMSO和EDFS40对卵母细胞的冷冻保护效果间差异不显著。与成熟卵母细胞相比,未成熟卵母细胞对低温更敏感,使用现有的冷冻方法和冷冻保护液冷冻保存未成熟的山羊卵母细胞尚无法得到满意的结果。DPBS和M199均可作为配制冷冻保护液的基础液。     

成熟培养基对猪卵母细胞的影响

评估NCSU23和TCM199两种培养基对猪卵母细胞体外成熟、孤雌激活以及核移植重构胚发育的影响。分别以NCSU23和TCM199为基础培养基,向其中添加相同浓度的半胱氨酸、激素和生长因子,作为猪卵母细胞体外成熟培养液,培养44 h(5%CO2、39℃、饱和湿度),挑选第一极体;成熟后的卵母细胞进行孤雌激活和核移植重构胚操作,144 h后观察囊胚数。结果表明,NCSU23组与TCM199组对卵母细胞体外成熟(68.18%和67.55%)、孤雌囊胚率(38.40%和37.60%)与核移植囊胚率(23.79%和21.38%)无显著影响(P>0.05),但是两者对孤雌囊胚细胞数的影响差异显著(分别为38.4和37.6个细胞)(P<0.05)。NCSU23成熟培养基能够使胞质成熟完全,提高囊胚细胞数,有利于妊娠的发生。可见,以NCSU23为基础培养基的体外成熟液有利于猪卵母细胞体外发育。