棉花纤维特异表达基因GhF1的分离及鉴定

采用mRNA荧光差异显示结合cDNA末端快速扩增技术,克隆了一个棉纤维特异表达基因的全长cDNA,命名为GhF1,该cDNA全长622 bp,含有一个编码66个氨基酸蛋白的开放阅读框。Southern杂交分析表明该基因在陆地棉(Gossypium hirsutumL.)中含有两个拷贝。Northern杂交分析表明该基因在棉花纤维细胞特异表达,在纤维发育过程中,GhF1转录产物的累积主要发生在纤维细胞发育的早期阶段。尽管未发现该基因与已知基因有任何同源性,但其分布的组织特异性和表达的发育阶段性暗示该基因在纤维伸长中起作用。     

海岛棉GbMYB5基因的克隆及表达分析

为了挖掘鉴定棉纤维发育相关基因,本研究根据海岛棉RIL群体定位的纤维强度QTL位点,结合转录组数据及海岛棉全基因组数据库注释信息,筛选出1个R2R3类MYB转录因子基因Gbar_A11G032760.1,根据该基因的注释信息,克隆并命名该基因为GbMYB5,qRT-PCR分析发现,在纤维发育15、20、25 DPA (Days post anthesis),该基因在高FS (Fiber strength)材料中的表达量显著高于低FS材料,且在高FS材料中明显上调表达;氨基酸序列分析表明,GbMYB5基因的编码区长747 bp,编码248个氨基酸残基,氨基酸序列包含1个高度保守的HTH-myb DNA-binding domain;序列同源比较及系统发育进化表明,该基因与不同物种的MYB5相关蛋白氨基酸序列都存在1个高度保守的HTH结构域;GbMYB5和雷蒙德氏棉的MYB5聚集在同一分支上,该基因与雷蒙德氏棉的同类基因亲缘关系较近。利用qRT-PCR分析不同组织表达情况,发现GbMYB5基因在花瓣和花萼中极显著表达量,雌蕊和雄蕊中显著表达一般,茎组织中表达不显著。研究初步分析了该基因的氨基酸序列及表达模式,为今后棉花MYB转录因子在纤维发育阶段的功能及分子机制的研究提供依据。     

三个陆地棉水孔蛋白基因的克隆与表达分析

从陆地棉SSH-cDNA文库的测序结果中得到一条具有完整ORF的陆地棉水孔蛋白基因序列,将其命名为GhAQP2。以该基因编码的氨基酸序列为探针,在棉花EST数据库经同源搜索得到2个相似性较高的EST,利用RACE技术获得其全长cDNA序列,将其基因命名为GhAQP3和GhAQP4。基因结构分析发现GhAQP2和GhAQP3各有4个外显子,3个内含子;GhAQP4有3个外显子,2个内含子。生物信息分析表明3个基因编码蛋白均含有6个跨膜区,2个NPA结构域,其氨基酸序列具备MIP超家族典型的蛋白保守区序列特征。多序列比对发现3个基因的氨基酸序列与其他物种PIP2类水孔蛋白氨基酸序列具有很高的同源性。qRT-PCR分析表明,GhAQP2在纤维伸长后期优势表达,GhAQP3在下胚轴和子叶中高表达,GhAQP4在纤维伸长前期优势表达,推测3个基因在不同的组织中发挥作用。GhAQP2在20DPA优势表达,为研究该基因在纤维伸长向次生壁加厚期转化过程中的表达调控提供了重要信息。     

棉花中两个新的F-box蛋白基因的克隆与表达分析

 以棉花EST序列分析为基础,利用电子克隆和RT-PCR技术,从棉花中克隆了2个新的F box蛋白基因,分别命名为GhFB1 (GenBank核酸数据库登录号：EF419428)和GhFB2 (GenBank登录号：EF503623)。GhFB1cDNA全长866bp,编码162个氨基酸;GhFB2 cDNA全长657bp,编码161个氨基酸,而且两者均含有植物F-box蛋白家族特有的F-box结构域。序列比较分析表明,GhFB1和GhFB2蛋白与水稻OsGID2,拟南芥AtSLY1具有高同源性,是棉花中F-box蛋白家族的新成员。RT-PCR结果表明,GhFB1和GhFB2在根、下胚轴、叶、茎、花和纤维中都有表达,而且均在棉花纤维起始和伸长时期有优势表达,推测这2个基因在棉纤维早期发育中可能起重要作用。     

海岛棉GbDET2基因的克隆及表达分析

类固醇5α-还原酶(DET2),被认为是油菜素类固醇物质(BRs)生物合成的限速酶。为了明确BRs在棉花纤维发育中的作用,本研究利用RT-PCR方法从纤维组织中获得基因开放阅读框(ORF)全长,经测序验证、Blast比对与同源性分析发现该序列编码的蛋白质与其他植物的DET2蛋白具有较高的相似性,故命名为Gb DET2基因。生物信息学分析结果表明,Gb DET2基因ORF长777 bp,可编码1个包含258个氨基酸的蛋白。氨基酸多序列比对发现Gb DET2序列保守性较高,具有的DET2的典型特征。通过物种间系统发育树可以看出Gb DET2与Gh DET2进化关系最接近,二者属于同一进化分支。实时荧光定量PCR分析表明,Gb DET2基因在纤维发育的不同时期中均有表达,在开花后5 d的胚珠、10 d的纤维中其表达量最高。研究结果显示Gb DET2基因在棉花纤维的起始和快速伸长过程中发挥着重要的作用。     

苎麻Actinl基因克隆及其在韧皮部纤维不同发育阶段的表达

通过cDNA文库的PCR筛选法获得苎麻内源肌动蛋白基因片段,采用苎麻[Boehmeria nivea (L.) Gaud]中苎1号为材料,结合RACE技术获得了苎麻的Actin1蛋白编码基因(BnACTIN1)的cDNA全长序列(GenBank登录号为DQ665832,2009年8月1日公布), 该基因全长cDNA序列1 782 bp,编码区长1 134 bp,编码377个氨基酸残基。Blastn分析表明,BnACTIN1基因与桑树(Morus alba: DQ785808)、蓖麻子(Ricinus communis: AY360221)、棉花(Gossypium hirsutum: AY305723-305736)等植物的肌动蛋白基因序列有高度的同源性。对推导的氨基酸序列进行分子进化分析表明,该基因与棉花Actin蛋白家族AAP73451.1、AAP73457.1聚为一类,三者之间的亲源关系最近。建立荧光定量PCR体系,用18S rRNA和Histone3内参基因对表达水平均一化,分析BnACTIN1基因在苎麻纤维细胞伸长过程中的表达水平变化。结果表明,在株高97 cm时最高,约为株高11、150和220 cm时表达量的230倍以上,是株高47 cm时期的20倍。本研究揭示的所获得BnACTIN1序列为苎麻的Actin1蛋白编码基因,其最高表达时期开始于纤维快速伸长时期,但稍早于纤维发育的高峰期,推测该基因可能与韧皮部纤维伸长过程中的肌细胞骨架形成有关。     

海岛棉DELLA蛋白编码基因GbGAI的克隆与功能初步分析

赤霉素在棉花纤维发育过程中起着重要作用。DELLA蛋白是赤霉素信号传导通路中的一类重要负调节因子。通过同源克隆的方法,克隆了新疆特有棉花栽培种海岛棉中DELLA蛋白的同源基因GbGAI。序列比对分析表明GbGAI编码的氨基酸序列具有DELLA蛋白的典型结构域。构建其过量表达载体,通过农杆菌侵染花序的方法转入野生型拟南芥中,观察表型。转基因株系表现出晚花,株高变矮等赤霉素不敏感突变体的表型。     

苎麻Actin1基因克隆及其在韧皮部纤维不同发育阶段的表达

通过cDNA文库的PCR筛选法获得苎麻内源肌动蛋白基因片段,采用苎麻[Boehmeria nivea(L.)Gaud]中苎1号为材料,结合RACE技术获得了苎麻的Actin1蛋白编码基因(BnACTIN1)的cDNA全长序列(GenBank登录号为DQ665832,2009年8月1日公布),该基因全长cDNA序列1782bp,编码区长1134bp,编码377个氨基酸残基。Blastn分析表明,BnACTIN1基因与桑树(Morusalba:DQ785808)、蓖麻子(Ricinus communis:AY360221)、棉花(Gossypium hirsutum:AY305723-305736)等植物的肌动蛋白基因序列有高度的同源性。对推导的氨基酸序列进行分子进化分析表明,该基因与棉花Actin蛋白家族AAP73451.1、AAP73457.1聚为一类,三者之间的亲源关系最近。建立荧光定量PCR体系,用18SrRNA和Histone3内参基因对表达水平均一化,分析BnACTIN1基因在苎麻纤维细胞伸长过程中的表达水平变化。结果表明,在株高97cm时最高,约为株高11、150和220cm时表达量的230倍以上,是株高47cm时期的20倍。本研究揭示的所获得BnACTIN1序列为苎麻的Actin1蛋白编码基因,其最高表达时期开始于纤维快速伸长时期,但稍早于纤维发育的高峰期,推测该基因可能与韧皮部纤维伸长过程中的肌细胞骨架形成有关。     

陆地棉果胶甲酯酶GhPME6的克隆及功能分析

结合陆地棉SSH-cDNA文库的测序结果,与棉花EST数据库进行序列比对和分析,获得1条在棉纤维次生壁加厚期特异表达的EST序列,该序列编码果胶甲酯酶(PME)。利用RACE技术获得其全长cDNA序列,命名为GhPME6。基因结构分析表明,GhPME6包含1个长度为1560 bp的开放阅读框、2个外显子和1个内含子,编码含有519个氨基酸的蛋白。其氨基酸序列具有PMEI和Pectinesterase两个保守结构域。通过对不同棉属基因组中的PME6基因进行比对分析,发现PME6在进化过程中具有高度保守性。qRT-PCR分析显示,GhPME6在纤维发育次生壁加厚期大量表达,推测该基因可能对棉纤维比强度有重要影响。构建GhPME6基因的大肠杆菌表达体系,获得与预期大小一致的目的蛋白,为深入研究GhPME6对棉纤维比强度的影响奠定了基础。     

棉花亲环素基因(GhCYP1)克隆及在干旱胁迫下的表达分析

本研究从已构建的棉花(Gossypium hirsutum)干旱胁迫抑制性差减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)cDNA文库分离得到一个含有植物亲环素保守结构域的EST片段,测序并结合cDNA末端快速扩增(5'-RACE)技术获得了1个779bp的cDNA序列。序列分析表明,该cDNA5'非翻译区为70bp,3'非翻译区为187bp,并含有一个编码174个氨基酸蛋白的开放阅读框。Blast分析表明,该基因的编码产物为一个亲环素蛋白,将该基因命名为为GhCYP1,序列提交到GenBank,登录号为GQ292530。半定量RT-PCR分析表明,干旱胁迫处理后,该基因在叶片中的表达量迅速提高,并在胁迫2h达到最高,这一研究暗示该基因的表达与棉花抗旱胁迫相关。     

两个陆地棉过氧化物酶cDNA的克隆和鉴定

从陆地棉优质材料7235不同发育时期的棉纤维混合cDNA文库中分离出2个与过氧化物酶相关的cDNA克隆GhPOD1和GhPOD2。GhPOD1是利用5’RACE技术得到的长度为1 489 bp的完整cDNA序列,开放读码框长度为816 bp,编码271个氨基酸,BLAST结果表明,该基因和拟南芥中已报道的过氧化物酶基因同源性最高。GhPOD2是通过对cDNA克隆直接测序获得,其插入片段长度为1 355 bp,开放读码框长度为999 bp,编码332个氨基酸,BLAST结果表明,该cDNA序列与已报道的1个陆地棉纤维过氧化物酶基因（pod8, L08199）氨基酸相似性达99％。RT－PCR分析表明GhPOD1是一个组成性表达的基因,而GhPOD2在根中不表达,而在茎、叶、胚珠和纤维细胞中表达,并从开花后14 d起,在纤维细胞中表达量逐渐减弱。进化树分析显示GhPOD1与已知的11个过氧化物酶基因距离都较远,是1个新的陆地棉过氧化物酶基因;GhPOD2与相似性高的pod8在同一分支,但与其余的第3类过氧化物酶也有较大的差异。Southern杂交结果表明这两个基因在陆地棉基因组中都存在2个拷贝,推测A、D亚组中各有1个拷贝。GhPOD1和GhPOD2的棉花转基因功能验证正在进行。     

棉花腺苷高半胱氨酸水解酶cDNA的克隆、表达及染色体定位

腺苷高半胱氨酸水解酶是调节细胞内甲基反应的一个关键酶。通过对高品质纤维陆地棉品系7235的棉纤维混合cDNA文库随机测序, 得到一个棉花腺苷高半胱氨酸水解酶(编号: g073a03a,GhSAHH)的cDNA序列。该cDNA序列长1 598 bp, 利用5′RACE技术得到上游318 bp的片段,序列拼接获得全长为1 916 bp的cDNA序列, ORF为1 458 bp, 编码485个氨基酸, 其理论上的等电点pI＝5.69, 分子量MW＝53.2 kD。该基因在不同组织、器官中均表达, 在根、下胚轴和纤维发育早期优势表达。根据Southern杂交结果推测GhSAHH基因在陆地棉基因组中为单拷贝。利用本实验室陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉海7124培育的含140个单株的BC1作图群体, 将GhSAHH基因定位在第20号染色体上。     

Transcriptome Profiling and Analysis during Cotton Fiber Cell Development

In this project,we aim to elucidate the molecular mechanism controlling initiation and elongation of tetraploid Gossypium hirsutum fiber cells by setting up a high throughput custom-designed cDNA microarray and a systematic gene expression profiling during cotton fiber development.We first constructed a microarray consisting of more than 28,000 cotton UniESTs that we obtained by deep-sequencing of several cotton ovule cDNA libraries.     

一个新的棉纤维表达蛋白cDNA的克隆、表达及功能初步分析

通过陆地棉高品质纤维种质系7235的棉纤维混合cDNA文库随机测序,得到一个开放阅读框(open reading frame,ORF)完整的棉纤维表达蛋白(GhCFE,GenBank登录号:DQ073045)cDNA序列。该cDNA序列全长1274bp,最大的ORF为996bp,编码332个氨基酸,其理论上的等电点pI=6.14,分子量Mw=37.7KD。它的N-末端存在一个长度为27个氨基酸残基的信号肽。RT-PCR分析表明,该基因在根、茎中不表达,在叶片中微弱表达,在不同发育时期的纤维细胞中均表达,且在纤维伸长期表达量最高。进化树显示GhCFE与已报导的3个棉纤维表达蛋白cDNA有很高的同源性。通过构建酵母表达载体,发现该基因对酵母细胞的伸长和细胞壁加厚没有显著影响。利用pBI121质粒构建了含35S启动子的正义表达载体和含棉纤维特异表达启动子E6的正义和反义表达载体,正在通过农杆菌介导的遗传转化,开展该基因的功能验证。     

棉花微管结合蛋白基因GhMAP1-LC3的克隆与表达分析

应用RT-PCR从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)石远321开花当天胚珠中分离到一个553 bp的片段,含有一个360 bp的开放读码框,推导的氨基酸序列（119个氨基酸）与水稻、拟南芥的MAP1-LC3 (Microtubule-associated Protein 1-Light Chain3)分别具有94%与90%的同源性,由此推测该基因为编码棉花微管结合蛋白基因家族的一     

棉花4个栽培种纤维初始发育的比较研究

利用扫描电镜技术,对棉花4个栽培种陆地棉（泗棉3号）、海岛棉（海7124）、亚洲棉（定远小花）以及非洲棉（A_1-50）开花前后的胚珠进行比较观察,并探讨延迟授粉对各棉种纤维初始发育的影响。结果表明,在南京大田气候条件下,除亚洲棉外其他3个棉种均在开花前1 d出现纤维细胞突起。在开花当天和开花后1 d,所有棉种的纤维突起（或伸长）密度均在珠柄顶部的脊突处最大,合点端和胚珠中部其次,珠孔附近最小。除陆地棉外,其他棉种在开花后1 d的纤维伸长密度均低于开花当天的纤维突起密度。说明随着棉胚珠体积的膨大,其他3个棉种胚珠表面的纤维细胞“稀释”程度大于陆地棉。在棉纤维初始发育阶段,纤维密度不仅受气象因子如温度的影响,而且与授粉时柱头的生活力密切相关;延迟授粉对纤维初始发育的影响以非洲棉较大,海岛棉较小,亚洲棉和陆地棉最小。本研究为理解棉纤维的分化和发育机理, 探讨4个栽培棉种纤维发育的亲缘关系,及人工授粉棉纤维的杂种优势利用提供了一定的理论依据。