北京怀柔地区樱桃上发现李属坏死环斑病毒

 李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)属雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus),是我国二类检疫性有害生物。PNRSV主要危害李属和蔷薇属植物。如,樱桃、桃、李、月季等。春季感染PNRSV的樱桃早期幼叶会出现深棕色坏死斑和线纹,叶片展开期坏死斑脱落造成穿孔症状。受PNRSV危害后,果树树势减弱,产量降低,甚至死树。我国学者调查陕西、辽宁和山东等省的果树病害时发现并报道了该病毒^[1~3]。     

两种主要甜樱桃病毒RT-PCR检测方法的改进

李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)和李矮缩病毒(Prune dwarf virus,PDV)是较为常见且危害严重的两种植物病毒,1992年被我国列为进境检疫危险性有害生物,主要危害李属和蔷薇属植物.反转录-聚合酶链式反应检测法(RT-PCR)因操作简便且灵敏度高而备受青睐.利用该方法已分别从北京怀柔[1-2]及大连地区[3]栽培的桃、樱桃中检测到PNRSV和PDV两种病毒.由于PNRSV和PDV同属雀麦花叶病毒科等轴不稳环斑病毒属,且传播方式相似,往往同时发病.已有的RT-PCR检测方法,一次反转录操作仅能检测一种病毒,耗时长、效率低,急需建立新的RT-PCR检测体系.本试验采用随机六聚体引物进行反转录,对RT-PCR检测方法进行了改进.     

北京月季病原病毒的高通量测序鉴定和RT-PCR检测

本研究利用高通量测序技术对北京地区的月季染病样品进行了病毒鉴定,通过序列比对和拼接获得了李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)、柑橘碎叶病毒(citrus tatter leaf viru...     

四个李属坏死环斑病毒分离物的检测鉴定及CP基因序列分析

采用RT-PCR方法,从北京昌平、云南昆明、陕西西安和浙江海宁的樱桃和月季罹病叶片中检测到李属坏死环斑病毒,为分析我国李属坏死环斑病毒分子生态学特性,克隆了病毒分离物的CP基因并进行序列分析。结果显示,北京分离物的CP基因长675nt、编码224aa,而西安、昆明和海宁分离物的CP基因均为681nt、编码226aa。序列相似性分析表明,4个分离物的CP基因之间具 有很高的同源性, 各个分离物间的核苷酸同源性在94.8%~99.3%之间, 氨基酸同源性在94.2%~98.7%之间。序列比对与系统发生树的分析结果显示,北京分离物属于GroupⅡ组,昆明、西安和海宁分离物属于Group Ⅰ组。     

实时荧光RT-PCR检测香蕉苞片花叶病毒方法的建立

香蕉苞片花叶病毒(Banana bract mosaic virus, BBrMV)是我国对外检疫性有害生物。为防止该有害生物传入我国,根据BBrMV不同分离株外壳蛋白基因(coat protein, CP)的保守序列,设计特异性引物与TaqMan荧光探针,建立了BBrMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,该方法检测BBrMV的2个不同来源毒株,均能够得到典型扩增曲线,Ct值分别为26.65和27.52;而马铃薯Y病毒、李属坏死环斑病毒以及桃丛簇花叶病毒等其它毒株则没有典型扩增曲线,也无Ct值。灵敏度比较发现,该方法比普通RT-PCR检测方法的灵敏度提高1000倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合对BBrMV的检测。     

进境玫瑰鲜切花李属坏死环斑病毒的检测鉴定

近期上海口岸连续多次从进境的玫瑰鲜切花中检出我国检疫性有害生物李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV),通过DAS-ELISA、RT-PCR、SYBR Green I实时荧光RT-PCR和序列分析等4种方法分别检测和复验该病毒,结果均为阳性,由此确定从进境玫瑰鲜切花中检出了PNRSV。同时本文分别检测玫瑰叶片、花瓣、茎干和花萼,结果均带有PNRSV,确定该病毒系统侵染玫瑰。     

值得关注的大豆新病害

大豆病害在世界上报道有上百种 ,其中大豆疫病菌、菜豆细菌性萎蔫病菌、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒等危害大豆的有害生物是我国检疫性有害生物 ,但近年国外大豆病害的发生情况有了一些变化 ,一些新兴的、重要的病害引起了广泛的关注。为防止这些新的危险性有害生物随进口大豆传入我国 ,避免对国外大豆上病害的了解停留在大豆疫病菌等有害生物上 ,现着重介绍几个近年在国外发生普遍、经济影响大、中国没有分布、随大豆传入风险高的新的危险性真菌病害 ,从而对大豆真菌病害有新的认识。1　大豆突死综合症一种镰刀菌引起的大豆突死综合症 (英…     

北京怀桑地区李矮缩病毒的检测鉴定

在北京怀柔地区核果类果树病毒疫情调查中,对樱桃树上有矮缩、斑驳、皱缩等症状的叶片样品,通过酶联免疫检测为阳性反应,进行RT-PCR鉴定、外壳蛋白基因扩增片段测序,发现该序列与李属坏死环斑病毒(PDV)ch株系分离物(L28145.1)序列的同源性为100%,与分离物(AF208746.1,AF208747.1,AF208743.1)序列的同源性大干97%,说明被检测样品感染有PDV.这是PDV病毒在北京地区发生的首次报道,对该病毒来源及其流行趋势也进行了分析.     

诱导剂对番木瓜环斑病毒病的防治效果

为了探讨水杨酸、茉莉酸甲酯和壳聚糖对番木瓜环斑病毒病的病情指数和防治效果的影响,在番木瓜上喷施不同浓度的诱导剂,然后在叶腋处接种番木瓜环斑病毒,观察和记录番木瓜的病情指数,计算其防治效果.结果表明,诱导剂提高了番木瓜对环斑病毒病的抗性,其中水杨酸的效果优于茉莉酸甲酯和壳聚糖.水杨酸、茉莉酸甲酯和壳聚糖的最佳施用浓度分别为50 mg/L、0.05 mmol/L和1％,最佳防治效果则分别为77.19％、53.11％和22.95％.水杨酸、茉莉酸甲酯、壳聚糖与对照之间的防治效果差异极显著,3种诱导剂在最佳浓度下防治效果差异极显著.50 mg/L水杨酸对番木瓜环斑病毒病防治效果最佳,在生产上施用具有一定的经济效益.     

单管多重RT-PCR同时检测大豆种子中三种检疫性植物病毒

我国大豆年进口量持续增长,快速、准确地检测进境大豆种子中可能携带的病原物是防止检疫性有害生物入境传播和扩散的有效手段。菜豆荚斑驳病毒(BPMV)、烟草环斑病毒(TRSV)和番茄环斑病毒(ToRSV)均是被大豆种子携带的检疫性有害生物。本研究建立了在单一PCR管中同时检测这3种检疫性植物病毒及大豆内源基因Bd-30K的多重RT-PCR方法。研究结果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有较好的特异性和灵敏度,检测含BPMV、TRSV和ToRSV RNA的最低浓度分别为0.45、0.0093和0.004ng/μL,从大豆种子中同时检测3种病毒的最低RNA浓度为0.58ng/μL。     

番茄环斑病毒和烟草环斑病毒复合型胶体金免疫层析试纸条的研制

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记番茄环斑病毒和烟草环斑病毒的兔多克隆抗体,用微定量喷头在硝酸纤维素膜上喷好2条病毒检测线（T线）和1条羊抗兔抗体质控线（C线）,制成复合型免疫层析检测试纸条。一张试纸条在10min内,可同时检测出这两种病毒。试纸条检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒粗提纯液,检测灵敏度在1μg/mL,试纸条检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒的混合病汁液可稀释1000倍（重量/体积）。用健康叶片和缓冲液对照测试,试纸条结果都为阴性。     

文心兰病毒病病原鉴定

在云南省昆明市的文心兰栽培基地发现了具有病毒病典型症状的感病文心兰植株。感病样品在电镜下可观察到长460-500 nm的线状病毒粒体和长约300 nm的杆状病毒粒体中的一种或两种,分别与已报道的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒粒体大小一致。感病样品可以和建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒血清中的一种或两种呈阳性反应。利用建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的特异性引物,运用RT-PCR方法可以扩增到与引物设计预期大小一致的核酸条带。由此证明,云南文心兰病毒病的病原是建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒中的一种或两种。     

从进境印度尼西亚辣椒种子中截获番茄环斑病毒

本文利用DAS-ELISA方法从印度尼西亚进境的辣椒种子中初步筛选出疑似感染有番茄环斑病毒(ToRSV)的样品,利用IC-RT-PCR(immune capture RT-PCR)扩增特异性片段,进而对扩增的PCR产物进行了测序和序列比对,确认我们在进境的辣椒种子中检出了我国关注的检疫性有害生物——番茄环斑病毒。此前该病毒未有在印度尼西亚辣椒上危害的报道,是系统内首次在蔬菜种子上截获该病毒。     

RT-PCR检测李坏死环斑病毒的研究

为了从植物组织中快速检测李坏死环斑病毒９ＰＮＲＳＶ）,根据该病毒ＲＮＡ３序列设计引物,对感病和健康组织总ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ,结果从感病组织中扩增出了大约４５０ｂｐ的目的片段,而健康组织中无此扩增带。将此ＰＣＲ产物连接到ｐＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙ载体也能转化大肠杆菌ＤＨ５５α菌株,得到了含有目的片段的重组子。并采用双脱氧终止法进行序列配美国报道的李坏死环斑病毒ＲＮＡ３序列对应部分核苷酸基本一致,这表     

侵染昆明玫瑰的李坏死环斑病毒的鉴定及其分子检测

采集昆明地区种植的花叶症状明显的玫瑰样品,运用现代分子生物学技术与常规技术相结合的方法,初步鉴定引起玫瑰花叶病的主要病毒病原为李坏死环斑病毒.该病毒引起玫瑰植株的系统花叶、畸形和皱缩等症状;电镜下病毒粒体为球形,直径为22～23nm;ELISA检测发现该病毒在植株芽、花粉和顶部叶片的浓度最高;同时,根据外壳蛋白的保守区利用Primer 5.0设计该病毒的特异引物,对该病毒进行分子检测,得到450bp的预期DNA片断,并在此基础上,进行了巢式RT-PCR的分子检测,表明巢式RT-PCR的检测能力最强.并通过序列的同源性分析得知该病毒的外壳蛋白与已知PNRSV的同源性为98.0%,进一步证明了该病毒为李坏死环斑病毒.     

萝卜花叶的病毒类羣和复合病侵染的研究初报

北京郊区的蘿卜花叶往往是蕪菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒,以及一种环斑病毒的复合病。这种环斑病毒在蘿卜上产生花叶;但在心叶烟上产生环斑,逐渐在心叶烟上会复元而带病的。可注意的是从蘿卜上分离的黃瓜花叶病毒和环斑病毒单独不能侵染蘿卜白菜。初步試驗这两个病毒能和蕪菁花叶病毒混合汁液接种时才侵入十字花科植物。     

韩国首次报道蓝莓红环斑病毒侵染蓝莓

蓝莓红环斑病毒(Blueberry red ringspot virus,BRRSV)属Caulimovididae科大豆萎黄(退绿)斑驳样病毒属(Soymovirus),引起蓝莓(Vaccinium corymbosum)叶、茎和果的红环斑病。美国、日本、捷克、斯洛文尼亚、     

李属坏死环斑病毒CP基因在大肠杆菌中的表达及其抗血清制备

本实验用RT—PCR的方法获得李属坏死环斑病毒的印基因，并将其连接到表达载体pET-22b（＋）上，得到重组质粒pET—PNRSVCP，转化大肠杆菌BL21（DE3）后，用IPTG进行诱导表达。SDSPAGE和Westernblot分析结果表明，印基因在大肠杆菌中获得了高效表达，获得的融合蛋白分子量约为29．0kDa。将该融合蛋白免疫兔子，获得PNRSV特异性抗血清。酶联法（ELISA）测定的效价为1／1024。为用血清学方法检测该病毒提供了基础条件。     

李属坏死环斑病毒怀柔分离物CP基因的克隆、原核表达及其抗血清制备

本研究通过RT-PCR技术获得了包含李属坏死环斑病毒怀柔分离物CP蛋白基因的DNA片段,构建了针对pET29a载体的两种表达质粒;〖JP2〗转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导表达了带不同融合肽段的PNRSV1（25 ku）〖JP〗和PNRSV2（29 ku）融合蛋白。经过Ni NTA亲和柱与SDS PAGE分离纯化,获得大量表达融合蛋白,并免疫家兔制备了融合表达蛋白的特异性抗体。间接ELISA测定其效价分别为8×103和3.2×104。     

番茄环斑病毒单克隆抗体的制备及检测

将纯化的番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)制剂免疫BALB/c小鼠,末次免疫后第3天取其脾细胞与SP2/0细胞融合,采用选择性培养基、有限稀释法克隆和间接ELISA方法进行筛选,成功获得了2株分泌ToRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株并分别命名为1H8、1D4.用间接ELISA方法对所获得的2个杂交瘤细胞株进行亚型鉴定均为IgG1亚类.间接ELISA效价测定结果1H8为1:105,1D4为1:106.TAS-ELISA实验结果表明此2株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体均能与本研究室保存的从德国引进的番茄环斑病毒分离物、从美国ATCC引进的番茄环斑病毒分离物PV-100、PV-174、PV-239发生特异性反应,而不与同属其它3种病毒:烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)、南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)、马铃薯黑环斑病毒(Potato black ringspot virus,PBRSV)发生反应.