群体感应信号物质对吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007在杨树内定殖的影响

为了明确杨树溃疡病生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007的群体感应系统是否与其内生定殖相关,本文通过群体感应指示菌紫色杆菌CV026和液相色谱串联四级杆飞行时间质谱技术(HPLC-Q-TOF-MS)确定其群体感应信号物质种类,并利用结晶紫染色、菌体回收、GFP标记等技术,研究其群体感应信号物质对该菌株生物膜及在杨树苗内的定殖能力的影响。结果表明,菌株JK-SH007产生的群体感应信号物质为含8个碳原子酰基侧链的辛酰基-L-高丝氨酸内酯(C8-HSL)。群体感应信号物质C8-HSL的添加对该菌株生物膜及在杨树苗内的定殖能力有影响,并且呈现低浓度促进,较高浓度抑制的规律。C8-HSL的添加与菌株JK-SH007生物膜的OD值和菌体量具有显著相关性,相关系数分别为0.923和0.756。当添加1.0%C8-HSL终浓度达到5×10^-8 g/L时,菌株JK-SH007生物膜的形成量达到峰值。荧光显微镜镜检发现,当添加100μL C8-HSL时,杨树组培苗根和茎中GFP荧光标记的菌株JK-SH007的定殖数量明显较CK多。菌株JK-SH007的群体感应与其在杨树内的内生定殖能力密切相关,群体感应信号物质C8-HSL具有增强菌株JK-SH007内生定殖的能力,同时也表明该物质有利于该菌株生防效果的发挥。     

梨火疫病菌的实时荧光PCR检测

 根据梨火疫病菌16S~23S间的ITS保守序列,设计并合成了一对特异性引物REA/FEA,应用荧光染料SYBR Green I,对10个梨火疫的菌株和其它相关参试菌株进行了检测。结果表明,10个梨火疫菌株都产生荧光信号而其它参试菌株都不产生荧光信号,成功建立了梨火疫病菌的实时荧光PCR检测方法。整个检测过程只需3h,完全闭管,降低了污染的机会,无需PCR后处理。检测的灵敏度是4个菌体细胞,比常规PCR电泳检测提高了10倍。用该特异性引物对梨枝条浸泡液进行实时荧光PCR检测,结果可特异性检测到目标菌的存在,并且检测的灵敏度是24个菌体细胞,比常规PCR电泳检测提高10倍。     

粤、桂、苏、皖四省稻瘟病菌有性态的研究

应用国际稻瘟病菌标准交配型菌株KA3和THl6对2000年从广东、广西、江苏和安徽4省采集的145个稻瘟病菌菌株的育性和交配型测定结果表明,广东、广西和安徽3省稻瘟病菌群体中存在着Matl.1和Matl.2两种交配型,江苏省的23个可交配菌株均为Matl.1。各省间稻瘟病菌群体的可交配率差异不大,总的可交配率为48.3%。有9个菌株与标准菌株交配产生了子囊孢子,可育率为6.2%。检测到2个两性菌株,不同地区稻瘟病菌群体雌雄性别的比例有显著性差异。用不同交配型的可育菌株进行互交,14个组合中只有1个组合产生子囊壳,但没有形成成熟的子囊孢子。     

北方五省(区)马铃薯晚疫病菌对甲霜灵和精甲霜灵的敏感性检测

为了明确我国不同地区马铃薯晚疫病菌对甲霜灵和精甲霜灵的抗性状况,2007-2009年从河北、黑龙江、吉林、辽宁和内蒙古马铃薯主产区采集马铃薯晚疫病菌,采用菌丝生长速率法和叶盘漂浮法测定其对甲霜灵的敏感性,采用叶盘漂浮法测定其对精甲霜灵的敏感性.结果表明:以菌丝生长速率法检测的380株晚疫病菌中和以叶盘漂浮法检测的222株晚疫病菌中对甲霜灵的抗性菌株分别占80％和73.5％;菌丝生长速率法检测结果显示,河北省对甲霜灵的抗性菌株所占频率从2007年的100％降为2008年的66.4％,2009年又回升至74.2％,而吉林和黑龙江两省对甲霜灵的抗性菌株分布频率呈上升趋势.叶盘漂浮法检测的95个菌株中对精甲霜灵的抗性菌株占54.5％,其中河北省40个菌株对精甲霜灵的中间型菌株占优势(62.5％),抗性菌株仅占34.9％,而其他4省55个菌株对精甲霜灵的抗性菌株占优势(69.1％).受检测的北方五省(区)马铃薯晚疫病菌群体中对甲霜灵和精甲霜灵的抗性菌株已占优势,马铃薯晚疫病菌已普遍对甲霜灵及精甲霜灵产生抗性.在对甲霜灵和精甲霜灵普遍产生抗性的地区,应优先选用与甲霜灵、精甲霜灵作用机理不同的药剂防治马铃薯晚疫病.     

申氏杆菌37-1中群体感应淬灭内酯酶AiiS的功能分析

许多植物病原细菌通过群体感应(quorum sensing,QS)系统调控相关毒性因子的表达,而群体感应淬灭(quorum quenching,QQ)是通过干扰QS系统,达到防治植物细菌性病害的重要策略之一.本研究利用原位培养法分离得到2000多株不同菌株形态的植物根围细菌,结合QS系统信号分子检测平板筛选到7株具有Q...     

中国4省份葡萄霜霉病菌群体对烯酰吗啉的抗性及适合度

为明确我国山西、山东、河北和云南省葡萄霜霉病菌对烯酰吗啉的抗性以及田间病菌群体的适合度,本研究采用Taqman-MGB技术检测了2020年-2021年采自上述4省份292株葡萄霜霉病菌对烯酰吗啉的抗性频率;采用叶盘法测定了田间抗性菌株与敏感菌株的适合度。结果表明,上述4个地区的平均烯酰吗啉抗性频率及抗性等位基因频率分别为64.0%和74.7%,其中山东省蓬莱区最高(91.2%和96.3%),河北省廊坊市(73.8%和85.0%)和云南省宾川县(75.0%和82.6%)次之,山西省清徐县(16.7%和34.7%)最低。适合度分析发现,田间抗性菌株的产孢能力明显高于敏感菌株,但二者的复合适合度指数无显著差异。上述结果表明,4省份霜霉病菌群体均对烯酰吗啉产生了不同程度的抗性,田间抗性菌株与敏感菌株相比无明显适合度变化。     

假单胞菌WX14群体感应淬灭酶基因的克隆及其功能研究

本研究采用报告菌平板法及β-半乳糖苷酶活性测定并筛选到10株具有较强降解酰基高丝氨酸内酯（AHLs）能力的细菌,其中菌株WX14降解AHLs能力较强,且菌体和菌体外泌物均具有降解活性。利用PCR法从菌株WX14中克隆到hacA和hacB两个群体感应淬灭酶基因,基因全长分别为2286和2370 bp,氨基酸序列比对分析结果表明,HacA属于阿库来菌素A酰化酶蛋白家族,HacB属于青霉素G酰化酶蛋白家族。这两个基因编码产物均为N末端亲核（N-terminal nucleophile,Ntn）水解酶家族成员。将hacA和hacB导入到软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum后,可减弱该细菌在马铃薯块和白菜上的致病性,因此这2种AHLs降解酶对依赖于群体感应的软腐病有一定防病作用。经16S rDNA序列同源性分析鉴定,3株为假节杆菌Pseudarthrobacter spp.、1株节杆菌Paenarthrobacter sp.、4株假单胞菌Pseudomonas和2株芽胞杆菌Bacillus spp.。     

小麦赤霉病菌多菌灵抗性群体的扩散路径分析——基于致病菌种类及所产毒素化学型鉴定和抗药性检出的时序性

通过对江苏、安徽、山东、河南、湖北、河北和四川7省小麦赤霉病菌对多菌灵抗性及敏感菌株Fusarium asiaticum和F.graminearum的鉴定、所产生毒素的化学型及多菌灵抗性菌株检出时序性的分析,初步推测了小麦赤霉病菌对多菌灵抗性群体在中国麦区的扩散路径。结果表明:江淮流域的江苏、安徽、湖北3省和四川省小麦赤霉病菌对多菌灵的抗性或敏感菌株优势群体均是F.asiaticum,而黄淮流域的山东、河南2省及河北省小麦赤霉病菌对多菌灵的敏感菌株优势群体为F.graminearum,抗性菌株优势群体则为F.asiaticum。江苏、安徽、山东和河南抗多菌灵菌株F.asiaticum产生毒素的化学型为3-AcDON和NIV,并以3-AcDON为主。江苏省连续使用多菌灵防治小麦赤霉病长达20多年后才检测到田间抗性菌株,而近年来检测到田间抗性菌株的山东、河南2省用多菌灵防治赤霉病的历史较短,且为偶尔使用,药剂的选择压力相对较小,因此推测山东和河南麦区出现的小麦赤霉病菌抗多菌灵菌株可能是通过种子调运及联合收割机跨区作业等方式从抗药性发生较早的江淮麦区流入的。     

长江中下游地区亚洲镰刀菌NX-2毒素群体的检测

由禾谷镰刀菌复合种(Fusarium graminearum species complex,FGSC)引起的麦类赤霉病,是农业生产上的重要病害。为明确中国长江中下游冬小麦主产区小麦赤霉病菌种的构成及其地理分布,对2008年从江苏、浙江和湖北3省采集的656株小麦赤霉病菌株进行了分类鉴定。结果显示,其中558个菌株为亚洲镰刀菌(Fusarium asiaticum),98个菌株为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum sensu stricto),表明中国长江中下游冬小麦主产区小麦赤霉病的主要致病菌是亚洲镰刀菌。选择亚洲镰刀菌(F.asiaticum)为研究对象,通过PCR-RFLP的方法对其进行产NX-2毒素菌株的检测。结果没有检测到产NX-2毒素菌株,表明中国长江中下游冬小麦主产区并未出现NX-2毒素群体。本研究旨在了解NX-2毒素群体在中国长江中下游地区的地理分布,为进一步研究麦类赤霉病菌群体遗传多样性和演化趋势奠定基础,为麦类赤霉病的防治和毒素污染的控制提供理论依据。     

利用错配碱基引物的ASO-PC R检测小麦赤霉病菌对多菌灵中抗菌株Codon200TTC→TAC基因型

采用在引物3'端引入错配碱基,建立了特异性检测小麦赤霉病菌对多菌灵中抗菌株(Codon200TTC→TAC)基因型的ASO-PCR分子检测技术.结果表明含有错配碱基的引物对NT-7 Rl/NT-7 Err5 F能够特异性检测小麦赤霉病菌对多菌灵的中抗菌株(Codon200TTC→TAC),扩增条件为94℃预热5 min;94℃变性60S,56℃退火60S,72℃延伸60S,35个循环;最后72℃延伸15 min.并利用26种常见植物病原真菌验证了所设计引物的PCR扩增特异性.整个检测过程快速,操作简单,结果准确,在6小时内完成.     

Enzyme-linked immunosorbent assays for study of serological relationships and detection of three luteoviruses

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) systems were used to examine serological relationships and to detect three luteoviruses; a vector-non-specific strain of barley yellow dwarf virus from Illinois (BYDV-PAV-IL), a strain of beet western yellows virus from California (BWYV-CA) and a dwarfing strain of soybean dwarf virus from Japan (SDV-D). Indirect ELISA (IND-ELISA) systems detected distant reciprocal serological relationships among all three viruses. This is the first report of a serological relationship between a vector-non-specific strain of BYDV and any strain of SDV. Double antibody sandwich ELISA (DAS-ELISA) systems detected the purified homologous viruses at concentrations as low as 1.6 ng/ml. hut did not detect heterologous viruses as concentrated as 800 ng/ml. In contrast, when DAS-ELISA systems were used for detection of the three viruses in sap extracts from infected plants some weak but significant (P=0.05 ) heterologous reactions occurred. The BYDV-PAV-IL DAS-ELISA system usually detected BWYV-CA and sometimes detected SDV-D; the BWYV-CA DAS-ELISA system never detected BYDV-PAV-IL and rarely detected SDV-D; the SDV-D DAS-ELISA system sometimes detected BYDV-PAV-IL and consistently detected BWYV-CA.     

三种ELISA方法检测苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒的比较

苹果褪绿叶斑病毒（ＡＣＬＳＶ）和苹果茎沟病毒（ＡＳＧＶ）是感染苹果和其它一些果树的重要病毒。作者应用ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ法成功地检测了苹果组培苗中的这两种病毒。为了简化操作步骤,试验了ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ和改良ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ法,并与ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ的检测结果比较。试验结果表明,ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ能检测出ＡＳＧＶ,却不能检测出ＡＣＬＳＶ,与此同时,这两种病毒均可用改良ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ检测。ＤＡＳ     

植原体TaqMan探针实时荧光PCR检测鉴定方法的建立

 本研究成功建立了植原体分类鉴定和检测的TaqMan探针实时荧光PCR方法,该方法根据植原体16S rDNA保守区设计了1个TaqMan广谱探针和3个植原体组间点突变特异性探针,并对9种植原体和5种细菌以及3个植物样本进行实时荧光PCR。结果表明,用广谱探针可检测到所有植原体产生荧光信号,而细菌不产生荧光信号。当用植原体组间特异性探针检测时,仅能检测到该组植原体产生荧光信号,检测的敏感性比常规的PCR-电泳检测高约100倍、检测速度有较大提高。由于PCR产物是荧光探针检测,本方法特异性强,并可以用组特异探针直接确定植原体种类。实验采用完全闭管检测,降低了污染机会。本研究为其它原核生物、特别是不能培养菌、难培养菌的检测鉴定和分类提供了新方法。     

胡杨根际可培养细菌的分离及抑制瓜列当种子萌发研究

从胡杨生存的干旱强光照逆境中获得新的细菌资源,从中筛选新的可抑制瓜列当种子萌发的生防菌。采用3种分离培养基,以稀释涂布法对塔里木河流域3处胡杨根系样品进行可培养细菌分离,通过分析分离菌株16S rRNA基因序列确定其种属分类。采用皿内培养法测定其对瓜列当种子萌发的抑制活性,利用盆栽试验检测分离菌株M2-3对瓜列当寄生的防治效果。结果分离获得98株细菌,分属于28个属,马赛菌属Massilia、Pontibacter、玫瑰单胞菌属Roseomonas为优势菌属。其中,菌株M2-3与Pontibacter salisaro HMC5104T的相似度最高,为97.92%,其菌体发酵液10倍稀释液对瓜列当种子萌发抑制率为87.8%,盆栽试验表明该菌株对瓜列当防效可达36.9%,具备进一步开发可能性。     

苜蓿萎蔫病菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立

苜蓿萎蔫病菌是我国对外检疫性二类有害生物，目前国内尚无发生6在出入境捡验检疫中主要是采用生物学和血清学方法进行检测，劳动强度大，耗费时间长。根据苜蓿萎蔫病菌与其它细菌菌株16SrDNA序列差异，设计出对苜蓿萎蔫病菌具有稳定点突交特异性探针，利用该探针对棒形杆菌属4个种及其它属细菌进行了实时荧光PCR检测实验。结果表明，只有苜蓿萎蔫病菌能检测到荧光信号，其它细菌没有荧光产生。该方法特异性强，灵敏度高，能检测到21．4fg质粒DNA，比常规PCR灵敏100倍，而且整个过程只需要2～3h。该方法可有效地应用于进出境病原菌检测之中。     

黄槐丛枝病植原体的检测及鉴定

 应用植原体16S rRNA基因通用引物,对自然表现丛枝的黄槐植株进行巢式PCR检测,得到约1.2 kb的特异片段,证明此植株中存在植原体.将此特异片段与pGEM-T Easy载体连接并转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中,通过PCR鉴定、序列测定及同源性比较分析,结果表明此植原体株系(STWB)16S rDNA片段G+C含量为45.8%,与榆树黄化植原体组(Elm yellows group,16SrV group)中的各株系最高同源率可达99.4%,而与其它组中的株系明显低于97.0%,故认为该植原体株系为榆树黄化植原体组中的成员之一.     

Antibody Capture Immunoassay for the Detection of Permethrin Carboxylesterase in Colorado Potato Beetle,Leptinotarsa decemlineata Say

Polyclonal antibodies were generated against the three denatured forms (30-, 48-, and 59-kDa proteins) of permethrin carboxylesterase from Colorado potato beetle. Each antiserum showed cross-reactivities to all the denatured forms of permethrin carboxylesterase as judged by antibody capture immunoassay. An antibody capture immunoassay was developed using the immunoglobulin purified from the 30-kDa antiserum in conjunction with denatured Colorado potato beetle hemolymph as the antigen source. In this antibody capture immunoassay, the hemolymph from the permethrin-resistant strain produced 1.1–5.3 times higher signal levels than that from the susceptible strain depending on assay conditions, suggesting that the hemolymph from the resistant strain contains more permethrin carboxylesterase. These results corroborate our original findings that permethrin carboxylesterase is overexpressed in the hemolymph of the permethrin-resistant strain of Colorado potato beetle and contributes to overall permethrin resistance. The relative quantities of permethrin carboxylesterase in four different strains of Colorado potato beetle with different levels of permethrin resistance were assessed with this immunoassay and with a carboxylesterase activity assay using α-naphthyl caproate as substrate. The average levels of permethrin carboxylesterase determined by the antibody capture immunoassay were better correlated with the levels of permethrin resistance than those determined by the carboxylesterase activity. Thus, the antibody capture immunoassay can be utilized as a sensitive means to detect the levels of permethrin carboxylesterase as a resistance marker in field populations of Colorado potato beetle.     

苯醚甲环唑降解菌BMJHZ-01的分离鉴定及降解影响因素

从江苏某农药厂污水区污泥中分离筛选出一株对苯醚甲环唑降解能力较强的细菌BM JHZ-01,对其进行形态学观察、生理生化鉴定、16S r DNA序列同源性比对及系统发育树分析,初步确定其为硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens。通过研究该菌株降解苯醚甲环唑的影响因素,得出其最适宜降解条件为:培养箱转速200 r/min,培养温度30℃,初始p H值为7.0。在此培养条件下,采用高效液相色谱法检测,发现菌株BMJHZ-01在5 d内对180 mg/L苯醚甲环唑的降解率可达90%以上。BMJHZ-01可以以最高质量浓度为180 mg/L的苯醚甲环唑为惟一碳源进行生长繁殖并将其降解,对不良环境的高度适应性使其在环境治理中具有明显优势。     

云南泡桐丛枝病植原体核糖体蛋白基因片段序列分析

 应用植原体核糖体蛋白基因通用引物对rpF1/rpR1,对采自云南省曲靖市的泡桐丛枝病植原体DNA (PaWB-QJ)进行PCR扩增,得到1.3 kb的特异片段,证明此病株中存在植原体。将此片段与pGEM-T Easy载体连接并转化大肠杆菌JM109感受态细胞,进行PCR鉴定、核糖体蛋白基因部分核苷酸序列测定及分析。结果表明,该株系(PaWB-QJ)核糖体蛋白基因片段长1 244 bp,包含rps19、rpl22和rps3基因。对PaWB-QJ株系的核糖体蛋白基因序列的同源性比较结果显示与16S rI-B亚组的翠菊黄化(Aster yellows,AY)、长春花黄化(Periwinkle yellows,PY)和泡桐丛枝德国株系(Paulownia witches'-broom,PaWB-German)的亲缘关系最近,达到99.0%以上,而与其它组中的株系明显低于97.0%,所以认为该植原体株系属于翠菊黄化组B亚组(16SrI-B)。