华南虎血巴尔通体感染的诊疗

了解华南虎血巴尔通体的临床诊断和PCR检测方法,介绍对症治疗的方法.笔者对1头患病的华南虎进行症状观察、血液涂片检查和PCR检测,利用土霉素进行治疗.患病动物出现高热稽留、厌食、贫血等症状,血液涂片中红细胞发生皱缩、每个视野中有多个巴尔通体,并通过PCR检测证实华南虎源血巴尔通体为大型猫血巴尔通体,利用土霉素治疗使动物康复,从症状观察结合实验室检查可以诊断华南虎的血巴尔通体病,土霉素对猫科动物血巴尔通体感染有较好的治疗效果.     

上海浦东地区家养猫和流浪猫汉赛巴尔通体感染情况调查

对上海市浦东地区家养猫和流浪猫汉赛巴尔通体感染情况进行了调查。共采集全血标本89份,采用间接免疫荧光试验(IFA)检测汉赛巴尔通体抗体,并分离鉴定汉赛巴尔通体。结果显示:家养猫和流浪猫汉赛巴尔通体抗体阳性率分别为38.1%(8/21)和47.1%(32/68),但两者间无显著差异(P0.05)。从被检血样中共分离到8株疑似巴尔通体,经形态观察、PCR鉴定并结合抗体检测结果,证实其中1株为汉赛巴尔通体。     

布鲁氏菌、弓形虫及巴尔通体多重TaqMan荧光PCR检测方法的建立及应用

为建立一种应用于宠物布鲁氏菌、弓形虫及巴尔通体的高通量、高灵敏、高特异的检测方法,根据各自保守序列合成了特异性引物及Taq Man探针,通过优化反应体系,建立了多重Taq Man荧光PCR检测方法,并利用该方法对2021年厦门市抽检的304份犬猫全血样品进行了检测。结果显示：该方法特异性好,可特异性扩增布鲁氏菌、弓形虫和巴尔通体阳性核酸,其他对照菌株核酸均无扩增信号;抗干扰性强,检测混合模板时,不同成分间无交叉干扰反应;灵敏度高,最低检出限均为3×10⁰ copies/μL;重复性好,批内及批间重复试验变异系数均小于2%。应用该方法在4 h内即可完成304份临床样品的快速检测,此次临床抽检样品中未检出布鲁氏菌、弓形虫及巴尔通体阳性核酸。该方法大大提高了检测效率,为多种动物布鲁氏菌、弓形虫及巴尔通体感染的早期诊断及筛查提供了技术支持。     

华南虎蛔虫ITS及5.8S rDNA序列扩增及分析

以从我国广州动物园华南虎肠道中采集的2条蛔虫作为研究对象,利用核糖体DNA(rDNA)中转录间隔区序列(ITS)的遗传标记特点,用保守引物NC5和NC2对提取的DNA进行PCR扩增,经胶回收纯化后,连接到pGEM-TEasy载体上,然后转化并鉴定出阳性菌落。对菌落进行PCR扩增并测序,将测序结果与GenBank公布的相关蛔虫ITS序列进行比对分析。结果显示,来自广州动物园的2条蛔虫ITS及5.8S rDNA序列总长均为858 bp,序列相似性为100%,与狮弓蛔虫(Toxascaris leonina)、猫弓首蛔虫(Toxocara cati)、犬弓蛔虫(T.canis)的ITS-1序列相似性分别为97%、81%、82%;5.8S序列的相似性分别为100%、98%、99%;ITS-2序列与GenBank上公布的狮弓蛔虫序列相似性94.6%,与猫弓首蛔虫、犬弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫(T.malaysiensis)序列相似性均小于60%。研究结果证明此次分离的华南虎蛔虫属于狮弓蛔虫。     

四川省松潘县牦牛体表蜱、高原鼠兔携带巴尔通体和无形体的PCR检测与进化分析

旨在了解四川省松潘县牦牛体表蜱、高原鼠兔巴尔通体和无形体感染情况。采集牦牛体表的蜱和捕获高原鼠兔，对蜱进行形态学初步鉴定后，提取蜱和高原鼠兔脾总DNA，PCR扩增蜱16S rRNA、巴尔通体rpoB和无形体16S rRNA基因，对PCR产物阳性产物测序、比对及构建系统进化树，从而确定蜱种类及蜱和高原鼠兔感染巴尔通体和无形体的种类及感染率。结果显示：在松潘县进安乡、山巴乡、下八寨乡各采集到蜱102、97和131只，共计330只，经鉴定均为青海血蜱。蜱巴尔通体仅检出1种巴尔通体，与B.melophagi亲缘关系最近，进安乡、山巴乡和下八寨乡检出率分别为16.7%、8.2%和18.3%，其中下八寨乡检出率显著高于进安乡（P<0.05）；蜱源无形体进安乡、山巴乡和下八寨乡检出率分别为9.8%、12.4%和26.7%，下八寨乡检出率显著高于进安乡（P<0.01），检出的无形体均为1种，与牛无形体（A.bovis）亲缘关系最近；下八寨乡检出的鼠兔源巴尔通体与B.queenslandens亲缘关系最近，感染率为6.7%；进安乡、山巴乡和下八寨乡检出的鼠兔源巴尔通体与B.grahamii亲缘关系最近，感染率分别为8.7%、17.9%和13.3%，3个点检出率无显著差异；未定种Bartonella sp.（MN296294）和Bartonella sp.（MN296293）仅分别在进安乡和下巴乡检出；与蜱均检出无形体不同，高原鼠兔均未检出无形体。此外，蜱和高原鼠兔均未发现2种及2种以上病原混合感染。松潘县青海血蜱携带巴尔通体和无形体，高原鼠兔感染巴尔通体，且首次在高原鼠兔体内检测到疑似B.queenslandens的病原体，提示当地居民有感染这两类病原风险。     

西藏羊蜱蝇中巴尔通体检测及gltA基因序列分析

为了明确西藏部分地区绵羊体外寄生羊蜱蝇携带病原巴尔通体的感染情况,作者于2019年1—9月采集了西藏林芝、日喀则、那曲地区绵羊体外寄生羊蜱蝇298只,通过形态学鉴定、PCR扩增羊蜱蝇18S rRNA基因进行虫体鉴定,并对病原巴尔通体的gltA基因进行检测,将部分阳性PCR产物连接pMD~(TM)-18T后转入DH5α感受态细胞,将阳性结果进行测序并进行遗传进化分析。结果显示,雌性阳性率49.8%(113/227),雄性阳性率42.3%(30/71),雌雄之间差异不显著(χ~2=0.944,P=0.267);羊蜱蝇携带病原巴尔通体的总感染率为48.0%(143/298),林芝极显著高于日喀则、那曲地区(χ~2=13.801,P0.01;χ~2=17.067,P0.01),日喀则和那曲地区无显著差异(χ~2=0.084,P=0.771);散养模式羊蜱蝇携带阳性率44.3%(102/230),圈养阳性率85.0%(34/40),屠宰场阳性率23.3%(7/30),宿主散养和圈养、屠宰场存在极显著差异(χ~2=20.929,P0.01;χ~2=24.38,P0.01),宿主散养和屠宰场存在显著差异(χ~2=3.989,P=0.046);将测序结果上传GenBank数据库获得3个巴尔通体gltA基因登录号(MN623006、MN623007、MN623008);序列比对表明和云南、新疆巴尔通体相似性为99.6%～100%。本次研究首次检测出西藏羊蜱蝇携带病原巴尔通体,为了解西藏绵羊体外寄生虫携带病原巴尔通体和病原防控提供依据。     

猫血巴尔通体病的诊治

猫血巴尔通体病又称猫传染性贫血,是由猫血巴尔通体引起的一种立克次体病,该病以贫血、脾脏肿大为特征。笔者在华南农业大学附属动物医院实习期间遇到一个典型病例,现将诊治过程报道如下。     

一例猫血巴尔通体病的诊治及体会

1只体重为3.2 kg的1岁雄性中华狸猫,就诊前出现精神沉郁,食欲、饮欲废绝,呕吐的症状,为了对该例家猫进行诊治,试验采用血常规、血涂片、实时荧光定量PCR、血液生化指标等检查方法进行诊断,并根据诊断结果进行治疗。结果表明:红细胞数、血红蛋白含量、血细胞比容、血小板数均低于参考值;血涂片镜下观察可见变形的红细胞表面有数个紫染的小体。全血实时荧光定量PCR检测为猫血巴尔通体阳性,确诊为猫血巴尔通体病。患猫通过对症治疗、预防细菌继发感染、促进食欲等治疗7 d后,恢复食欲、饮欲,临床症状消除。说明该病通过综合治疗方法可取得良好的治疗效果。     

猫血巴尔通体研究概况

猫血巴尔通体是引起猫发生传染性贫血的病原之一,在分类学上归属于立克次体目、无形体科.最近有很多新的研究指出这类病原体应归属于支原体目,"血巴尔通体"和"附红细胞体"也应该合称为"血营养性支原体"(Hemotrophic mycoplasmas).猫血巴尔通体作为血营养性支原体的重要代表,己经被广泛深入地研究,文章对其病原学、流行病学、发病机制、防治等方面的研究成果进行回顾与总结,以期对本病有进一步认识,对其他血营养性支原体的研究提供参考.     

西藏羊蜱蝇中巴尔通体检测及gltA基因序列分析

为了明确西藏部分地区绵羊体外寄生羊蜱蝇携带病原巴尔通体的感染情况,作者于2019年1-9月采集了西藏林芝、日喀则、那曲地区绵羊体外寄生羊蜱蝇298只,通过形态学鉴定、PCR扩增羊蜱蝇18S rRNA基因进行虫体鉴定,并对病原巴尔通体的gltA基因进行检测,将部分阳性PCR产物连接pMD^TM-18T后转入DH5α感受态细胞,将阳性结果进行测序并进行遗传进化分析。结果显示,雌性阳性率49.8%（113/227）,雄性阳性率42.3%（30/71）,雌雄之间差异不显著（χ²=0.944,P=0.267）;羊蜱蝇携带病原巴尔通体的总感染率为48.0%（143/298）,林芝极显著高于日喀则、那曲地区（χ²=13.801,P<0.01;χ²=17.067,P<0.01）,日喀则和那曲地区无显著差异（χ²=0.084,P=0.771）;散养模式羊蜱蝇携带阳性率44.3%（102/230）,圈养阳性率85.0%（34/40）,屠宰场阳性率23.3%（7/30）,宿主散养和圈养、屠宰场存在极显著差异（χ²=20.929,P<0.01;χ²=24.38,P<0.01）,宿主散养和屠宰场存在显著差异（χ²=3.989,P=0.046）;将测序结果上传GenBank数据库获得3个巴尔通体gltA基因登录号（MN623006、MN623007、MN623008）;序列比对表明和云南、新疆巴尔通体相似性为99.6%~100%。本次研究首次检测出西藏羊蜱蝇携带病原巴尔通体,为了解西藏绵羊体外寄生虫携带病原巴尔通体和病原防控提供依据。     

塔乌库姆冰草肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

根据其他植物Actin基因的保守序列设计一对简引并性物,以塔乌库姆冰草叶片总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并连接到载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果表明：该片段长约600bp,编码199个氨基酸,所得序列与GenBank中注册的其他植物Actin基因序列同源性均在81%以上,与其他肌动蛋白的氨基酸序列同源性达88%。     

虎MHC ClassⅠ基因的克隆及测序

根据猫的主要组织相容性复合体Ⅰ类分子cDNA序列设计PCR引物,从基因组上成功扩增并克隆了MHCClassⅠ基因片段,命名为TLA-A。该片段全长2 820 bp,包含MHC ClassⅠ分子基因约85%的长度,包括Exon 1部分序列、intron 1、exon 2、intron 2、exon 3、intron 3、exon 4、intron 4、exon 5、intron 5、exon 6、intron 6和exon 7部分序列。与其他物种的ClassⅠ基因相比,虎与家猫、猎豹、豹猫、大熊猫、狗、马、松鼠猴、人、黄猩猩等物种的同源性依次为93.4%、91.8%、87.3%、86.4%、85.1%、85.1%、84.6%、84.3%、83.7%,种间序列差异主要表现在exon 2、exon 3两个肽结合区。     

猪附红细胞体16S rRNA基因的序列测定和系统进化分析

从确诊为猪附红细胞体感染的猪场，无菌采集血样，抽提猪附红细胞体基因组DNA，采用真细菌的通用引物进行16S rRNA基因扩增，对扩增产物进行克隆和测序。从3个地理位置不同的猪场均成功地扩增出长度为1469bp的核苷酸序列。系统进化分析表明，3个猪场样品所测序列一致性达99．52％以上，具有相同的基因型，但与国外报道的猪附红细胞体Illinois株同源性为95％，属于同一基因群，但基因型不同；所有种类的附红细胞体和血巴尔通氏体组成同一进化分支，这类血营养菌与支原体科，支原体属的病原最靠近(75％)，而与立克次氏体目的病原较远(70％)。上述研究证实，广东所流行的猪附红细胞体是一种新基因型的猪附红细胞体，建议命名为猪附红细胞体广东株型；为反映进化关系，猪附红细胞体和其它血营养菌应划归于支原体科的支原体属。     

猪附红细胞体SRP54基因的克隆及真核表达质粒的构建

为了研究猪附红细胞体信号识别颗粒54（SRP54）基因的功能,试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体KI₃806全基因组序列（登录号为NC₀15153.1）中信号识别颗粒（SRP）蛋白基因设计合成1对特异性引物,采用PCR方法扩增猪附红细胞体SRP54基因片段,将扩增产物克隆至pMD18-T载体上,重组质粒经PCR和酶切鉴定后测序,并将SRP54基因与pVAXⅠ真核表达载体连接。结果表明:克隆的SRP54基因片段长1 173 bp,与GenBank中原序列同源性为97%,构建的真核表达质粒pVAXⅠ-SRP54经PCR和酶切鉴定正确,为猪附红细胞体SRP54基因的后续研究奠定了基础。     

大熊猫蛔虫ITS及5.8SrDNA序列的克隆与分析

基于核糖体DNA第一与第二转录间隔序列以及5.8S序列,以分离自广州动物园大熊猫体内的蛔虫为研究对象,用保守引物NC_5和NC_2对核糖体DNA（rDNA）的内转录间隔区ITS-1,ITS-2及5.8S序列进行PCR扩增,扩增后的片段纯化后克隆至pGEM-Teasy载体,重组质粒通过菌液PCR鉴定后,对阳性菌落进行序列测定及分析,鉴定大熊猫蛔虫的种类。结果显示,目的片段总长为910 bp,2个不同样品之间的ITS及5.8S序列没有差异,与GenBank~（TM）中的拜林蛔线虫（Baylisascaris transfuga）、猪蛔虫（Ascaris suum）和人蛔虫（Ascaris lumbricoides）的ITS序列相似性分别为96.6%、82.9%和82.7%。结果表明,此次分离的大熊猫蛔线虫可能为拜林蛔线虫。     

猪伪狂犬病病毒XIN-W株gD和gE基因的克隆及序列分析

根据已发表的PRVgD、gE基因序列 ,设计合成了两对引物 ,对猪伪狂犬病病毒XIN W株相关的毒力基因gD、gE序列进行测定和分析。经PCR扩增分别得到了全长为 12 0 9bp,1 743bp的gD、gE全基因序列 ,将它们克隆到pGEM T Easy载体中 ,并转化JM1 0 9,挑取阳性菌落的质粒进行PCR、酶切、测序鉴定 ,与其他参考毒株的gD、gE基因进行比较。结果表明 ,XIN W株与其它毒株相比 ,gD、gE基因核苷酸序列的同源性分别为 97.9%～99.3 % ,98.0 %～ 98.7% ;氨基酸序列的同源性分别为 97.0 %～ 99.3 % ,97.1 %～ 98.1 %。不同的PRV毒株间gD、gE基因在核苷酸水平和氨基酸水平高度保守。遗传进化树显示 ,XIN W株和国内其它毒株起源相同 ,属同一进化分支     

中国人源蓝氏贾第虫病毒基因组全长cDNA克隆及序列测定

从中国人源蓝氏贾第虫北京株(BEIJ88／BTMR1／1)体外纯培养的电镜负染和超薄切片观察到蓝氏贾第虫病毒粒子。该病毒位于感染早期贾第虫的细胞质中，感染晚期的细胞核中。根据国外发表的蓝氏贾第虫病毒序列设计了6对互相重叠的引物。用这6对引物对从中国人源蓝氏贾第虫北京株发现的蓝氏贾第虫病毒基因组进行RT—PcR，将产物连接到pMD18-T载体中并转化入DH5a感受态菌，送上海生工测序，通过BLAST对Gen-Bank进行同源性搜索。结果 测得我国人源蓝氏贾第虫病毒基目组全长为6273bp，与国外报道的蓝氏贾第虫病毒序列同源性为95％，编码的氨基酸同源性为90％。     

由禽波氏杆菌和奇异变形杆菌共感染为主所致鸡胚发病死亡的生物学鉴定

2010年,辽宁铁岭某种鸡孵化场出现孵化率低、死淘率高的现象。通过对送检病死鸡胚进行病原检测,最终检测出5株革兰阴性杆菌和3种病毒,其中禽波氏杆菌和奇异变形杆菌的检出率分别为76．44％、61.36％,两者混合感染率达51．83％,而其他病原菌（大肠杆菌、沙门菌、绿脓杆菌）和病毒（AI,V、REV、CIAV）的检出率均较低。采用1对根据病原菌23SrRNA基因的共同保守序列设计的引物,以及根据临床常见致病菌16s～23SrRNA基因间隔序列（ISR）两端的16S及23SrRNA保守序列而设计的通用引物分别对分离菌进行PCR扩增。并分别测定所得片段的DNA序列。结果显示,所得DNA片段分别与GenBank中收录的登录号为HM545299的禽波氏杆菌和登录号为AY993943的奇异变形杆菌的相应核苷酸序列同源性达99．5％和98．7％。本研究最终确定禽波氏杆菌和奇异变形杆菌的混合感染是引起该场疫情发生的主要原因。     

犬细小病毒上海分离株全基因的克隆及进化树分析

为研究上海地区犬感染细小病毒（Canine parvovirus,Cpv）的基因特点和基因型,参考GenBank上细小病毒3个基因型的全基因设计6对扩增引物进行PCR,分段扩增出目标片段,克隆于T载体上,测定序列并拼接,用MEGA软件、NJ法构建进化树。结果显示,犬细小病毒全基因为4758bp,命名为CPV-SH．提交到GenBank上的序列号为FJ792845,与GenBank中4神基因型爽细小病毒的VP2基因核苷酸序列同源性比较发现,CPV-SH克隆与2a亚型犬细小病毒核苷酸同源性为最高99．7％,与2型、2b亚型。2e亚型的同源性分别为98．8％、99．5％．99．5％。CPV-SH属于2a亚型犬细小病毒,与国内北京分离株CPV／BJ082亲缘关系最近,同源性为99．9％。     

天祝白牦牛ANGPTL4基因的单核苷酸多态性研究

[目的]本研究旨在对牛ANGPTL4基因进行SNPs检测,并研究其与天祝白牦牛部分经济性状的相关性。[方法]以36头天祝白牦牛为研究对象,采集其血样并提取基因组DNA,设计ANGPTL4基因的特异引物对P1和P2,对ANGPTL4基因的部分序列进行扩增,并利用PCR-SSCP结合测序的方法检测扩增产物序列的多态性。[结果]以自行设计的上述两对引物扩增分别获得长为260 bp（位于GenBank公布序列NC-007305.2的296~555 bp间）和170 bp（位于序列NC-007305.2的4 610~4 779 bp间）的天祝白牦牛ANGPTL4基因的两个片段。引物对P1的扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,出现两种带型：AA和AB。AA和AB两种基因型频率分别为0.9444和0.0556。多态信息含量是0.1000,为低度多态。对具有不同带型的个体测序结果表明,引物对P1的扩增片段上有两处发生碱基突变,分别位于ANGPTL4基因的第466 bp处（T→C）和479 bp处（T→C）,导致相应的氨基酸改变Cys→Arg,Phe→Ser。在引物对P2的扩增片段上没有发现SNPs位点。[结论]引物对P1的扩增位点可以尝试作为天祝白牦牛品质改良的辅助选择标记。