福建山樱花总RNA提取方法比较分析

以福建山樱花嫩叶为试验材料,采用Trizol法、CTAB法、CTAB-Li Cl法、百泰克试剂盒法和天根试剂盒法5种方法提取福建山樱花叶片RNA,用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性,以微量紫外分光系统检测总RNA的纯度和浓度。结果表明:Trizol法和天根试剂盒法不适于福建山樱花叶片RNA的提取;CTAB法和百泰克试剂盒法提取的RNA完整性好,纯度及浓度高,但百泰克试剂盒法提取的RNA有DNA污染;CTAB-Li Cl法提取的RNA浓度低,且含杂质。RT-PCR试验结果进一步表明CTAB法提取的RNA能够用于后续的分子生物学研究,是福建山樱花叶片RNA提取的最佳方法。     

草珊瑚叶片总RNA提取方法及效果的比较研究

采用CTAB法、CTAB-Li Cl法、CTAB-Trizol法、Trizol法、天根RNA提取试剂盒及百泰克RNA提取试剂盒提取草珊瑚(Sarcandra glabra)叶片总RNA,并通过微量紫外分光光度计、电泳检测等对提取的结果进行了分析比较。结果表明:CTAB-LiCl法和天根RNA提取试剂盒比较适合提取草珊瑚叶片的总RNA。这两种方法提取的总RNA的完整性和纯度较高,无明显的蛋白质及其他杂质污染,OD_(260)/OD_(280)的值在1.9~2.1,OD260/OD230在2.0~2.4。获得质量高、完整性好、纯度高的总RNA,为后续构建cDNA文库以及相关基因的克隆提供了试验基础。     

枣花蕾总RNA提取方法的比较

为了探究枣花蕾总RNA提取的最优方法,以沾化冬枣的花蕾为材料,利用改良CTAB法、Trizol法和2种RNA提取试剂盒(PureLinkTMRNA小提试剂盒和北京奥莱博生物技术有限公司提供的植物RNA提取试剂盒)分别提取花蕾的总RNA,并对RNA浓度和电泳图谱进行比较分析,利用奥莱博生物技术有限公司提供的植物RNA提取试剂盒法可提取到纯度较高,完整性好的总RNA,并可用于Northern杂交、cDNA文库构建和半定量RT-PCR等分子生物学试验。     

樟叶越桔叶芽总RNA提取方法比较研究

本项实验采用改良CTAB、改良SDS、RNApure Plant Kit和Plant RNA Kit 4种方法提取樟叶越桔叶芽总RNA,以期获得适合于樟叶越桔叶芽高质量总RNA的最佳提取方法。总RNA纯度和完整性分别用紫外分光光度计法和琼脂糖凝胶电泳法检测。结果表明,采用改良CTAB和Plant RNA Kit法获得的RNA完整性好,纯度高,A260/A280值分别为2.07和2.08,28S和18S rRNA条带清晰,且前者的亮度约为后者的2倍,无弥散现象。将改良CTAB和Plant RNA Kit法获得的总RNA进行RT-PCR扩增,成功克隆获得了樟叶越桔花色苷5-芳香族酰基转移酶基因长316 bp的cDNA序列。证明改良CTAB和Plant RNA Kit法是樟叶越桔叶芽高质量总RNA的最适提取方法。     

3种方法提取菠萝蜜叶片和种子总RNA的比较

为了筛选最适的菠萝蜜总RNA提取方法,采用Trizol提取法、Tris-硼酸提取法和试剂盒提取法提取菠萝蜜叶片和种子总RNA,通过紫外分光光度计检测、琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR检测以及Agilent2100检测,对提取结果进行比较分析。结果表明:采用这3种方法均能从菠萝蜜叶片和种子中提取到总RNA,Tris-硼酸提取法较其他2种方法所提取的总RNA产率高,但杂质较多;采用Tris-硼酸提取法能提取完整性较好的总RNA,28S、18S和5S清晰可见,但提取质量较试剂盒提取法差;试剂盒提取法省时省力,有明显的28S和18S条带,A260/A280分布在1.92~1.98,A260/A230分布在2.04~2.09,叶片总RNA产率42.3ng/μL,种子总RNA产率15.6ng/μL。RT-PCR检测结果表明在约200bp处存在清晰整洁的电泳条带,Agilent2100检测结果显示杂峰极少,28S峰积分面积约是18S峰积分面积的2倍。经综合评定认为,试剂盒提取法是适合菠萝蜜叶片和种子总RNA提取的方法。     

樟树不同组织总RNA提取方法比较及RT-PCR检测

采用Invitrogen Total RNA Purification Kit直接提取法,Trizol试剂盒法和本实验室改良的CTAB法,分别提取樟树不同组织(根、茎、叶和花)的总RNA,并对提取效果进行了检测和比较分析。结果表明:(1)采用本实验室改良的CTAB法提取的RNA完整性好,无杂质污染且得率高,稳定性好,可满足半定量RT-PCR等试验需要;而Invitrogen Total RNA Purification Kit直接提取法和Trizol试剂盒法提取的樟树不同组织总RNA,结果均不理想,存在RNA 28S rRNA谱带模糊不清、有DNA污染、降解严重和得率低等问题,这两种方法均不适用于樟树不同组织RNA的提取。(2)樟树不同组织总RNA提取的得率不同,其中叶片的总RNA得率最高,达到782.34 mg/kg;茎的得率最低,为514.33 mg/kg。(3)以Actin作为内参基因,对樟树根、茎、叶和花中的Fad2基因片段进行半定量RT-PCR检测,结果表明,Fad2基因片段在樟树叶片中的表达量相对较高,而在花中的表达量较低。     

木本植物根系总RNA提取方法的比较和分析

以杂种马褂木不定根和杨树、柳树、柽柳根系组织为材料,比较异硫氰酸胍法、Tiangen试剂盒、CTAB改良法、Trizol法和改良Trizol法提取总RNA的效果。结果表明,改良Trizol法通过在离心后的匀浆上清液中加入低浓度的无水乙醇以及结合后续的高盐溶液,能有效去除多糖,提取的RNA中28S rRNA亮度约为18S rRNA的两倍,OD260/OD280值介于1.7～2.1之间,各林木树种根系组织RNA得率均大于150μg/g,而且整个提取时间只要2～3 h。表明改良Trizol法方便、快捷、高效,完全适用于林木树种根系组织RNA的提取。     

蚬壳花椒种子总RNA提取方法比较与优化

蚬壳花椒种子中富含油脂、多糖和多酚类等成分复杂的次生代谢物质,影响其总RNA的提取,一般的提取方法无法获得总RNA或者总RNA降解严重。本实验采用改良CTAB法、TRNzol法、试剂盒法、传统CTAB法提取总RNA,通过琼脂糖凝胶电泳,核酸蛋白检测仪检测以及RT-PCR验证等对提取结果进行比较与分析。结果表明:TRNzol法、试剂盒法、传统CTAB法未能从蚬壳花椒种子中提取到总RNA,改良CTAB法能提取完整性较好、纯度较高的RNA,28S及18S条带清晰整齐,D260/D280值为2.07,提取的总RNA适用于RT-PCR实验,可以为后续的分子生物学研究奠定了基础。     

山核桃花芽总RNA提取方法研究

以山核桃的花芽为材料,利用改良CTAB法、异硫氰酸胍法和改良热酚法提取其总RNA,并对RNA产率、纯度、电泳图谱和RT-PCR进行分析,结果表明:改良CTAB法明显优于其它两种提取方法,用它提取的28S rRNA、18S rRNA条带清晰、稳定,无降解,OD260/OD280值保持在1.9～2.0,产率相对较高;经RT-PCR检测发现,改良CTAB提取的RNA能被成花基因特异引物扩增出清晰的条带,说明该法完全适合于山核桃花芽总RNA的提取,并可用于Northern杂交、cDNA文库构建等分子生物学操作.     

杉木叶片原生质体分离及RNA提取体系的建立

【目的】以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分析不同因素对杉木原生质体分离的影响,建立杉木叶片原生质体分离体系,以期为杉木基因功能验证提供有效的技术平台;比较不同RNA提取方法,筛选获得杉木原生质体总RNA提取的有效方法,为今后利用杉木原生质体开展分子生物学研究提供技术支持,也可为其他林木原生质体的总RNA提取研究提供参考。【方法】选取杉木组培苗最上端未分轮的幼嫩叶片为材料,通过分析5种不同酶组合、真空处理时间(0、5、10、15、20 min)、渗透压(0.3、0.4、0.5、0.6 mol·L-1甘露醇)、BSA浓度(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)及酶解时间(1、2、3、4、5 h)5个条件,进行杉木叶片原生质体的分离。采用改良Trizol法、改良Trizol+10μg糖原法、CTAB-Li Cl法、CTAB-Li Cl+10μg糖原法、改良CTAB-异丙醇法、改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法、天根RNA提取试剂盒法共7种方法提取杉木原生质体RNA,通过杉木内参基因和2个特异基因进行RNA质量验证,比较不同方法的提取效果。【结果】在1.5%纤维素酶R-10、1%离析酶R-10、0.2%果胶酶Y-23、0.5 mol·L-1甘露醇以及0.3%BSA的混合酶液中,真空处理10 min,酶解2 h,可分离出高活力的纯净杉木原生质体,其产量可达到7.27×106个·g-1,活力可达到94%。7种方法皆能提取出杉木叶片原生质体的总RNA,但不同方法间存在明显差异,其中改良Trizol法、改良Trizol+10μg糖原法、改良CTAB-Li Cl法、改良CTAB-Li Cl+10μg糖原法提取的RNA有不同程度的降解现象,其余方法所提取的RNA完整性较好,且OD260/280和OD260/230值均在1.8~2.0范围内;在RNA得率方面,改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法可高效提取杉木原生质体RNA,106个细胞RNA产量平均可达到6.89μg,分别是改良CTAB-异丙醇法和天根RNA提取试剂盒法的1.73倍和1.58倍;综合考虑,改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法提取杉木原生质体RNA的效果最好。【结论】以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分离条件为纤维素酶R-10浓度1.5%、离析酶R-10浓度1%、果胶酶Y-23浓度0.2%、甘露醇浓度0.5 mol·L-1、BSA浓度0.3%,真空处理10 min,酶解2 h,可大量获得高质量的杉木原生质体;利用改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法,可高效提取杉木原生质体RNA,106个细胞RNA产量平均可达到6.89μg。研究结果为杉木重要性状关键基因的功能研究及其在育种中的应用提供了重要基础。     

不同化学类型樟树叶片总RNA提取方法比较

采用SDS/酸酚法、Trizol试剂法、常规CTAB法及改良的CTAB法,分别提取5种化学类型樟树叶片总RNA,并对提取效果进行了比较分析。结果表明:Trizol法难以提取樟树叶片总RNA,得率很低;SDS/酸酚法和常规CTAB法得到的RNA存在DNA污染,富含蛋白、多糖、多酚等杂质;这3种方法均不适于富含多糖多酚类物质的樟树叶片总RNA的提取。改良的CTAB法能够提取得到樟树5种化学类型叶片总RNA,且在操作过程中,异樟比油樟和脑樟更易提取。此法能有效去除多糖和蛋白,提取得到的RNA 28S和18S rRNA条带清晰,OD260/OD280值为2.0左右,平均产率分别为115.8μg/g FW。经RT-PCR检测,所得总RNA质量高、完整性好、成功率高,可以满足下一步实验的要求,可作为樟树叶片总RNA提取的首选方法。     

适于转录组测序的枣不同器官总RNA提取方法筛选

为获得适用于转录组测序的枣花、结果枝和果实的总RNA提取方法,以中秋酥脆枣为材料,比较分析了Ambiogen和Autolab 2种总RNA提取试剂盒和基于Autolab试剂盒改良的CTAB法的总RNA的提取效果。结果表明:3种方法提取RNA的OD260/OD280差别不大,但用2种试剂盒提取的RNA有降解,其中Ambiogen试剂盒提取的花、结果枝和果实3个器官的RNA质量浓度分别为126、284和222 ng/μL;Autolab试剂盒提取的RNA质量浓度分别为307、402和266 ng/μL;基于Autolab试剂盒改良的CTAB法提取的RNA质量浓度分别为401、417和296 ng/μL。与2种试剂盒相比,基于Autolab试剂盒改良的CTAB法提取出来的RNA完整性好、纯度和浓度高,能够满足转录组测序的要求。     

菠萝叶片总RNA提取方法的比较

为了探究不同提取方法对菠萝叶片组织总RNA提取质量的影响,以‘台农16号’菠萝品种的叶片为材料,采用改良Tirs-硼酸法、改良SDS法、试剂盒法提取菠萝叶片组织总RNA,并对提取的总RNA浓度、OD260/OD230、OD260/OD280、琼脂糖电泳结果进行了比较分析。结果表明:改良Tris-硼酸法和试剂盒法能较好地去除菠萝叶片组织的多糖、皂苷元、蛋白质以及纤维等次生代谢物质,OD260/OD230大于2.000,OD260/OD280在1.900~2.100之间。改良SDS法提取总RNA产率最高,达到290.9μg/m L。试剂盒法提取总RNA产率为30.1μg/m L,远小于其它2种提取方法所得总RNA产率。改良Tris-硼酸法所得电泳图谱条带完整度最好。比较分析3种提取总RNA方法的结果,以改良Tris-硼酸法提取总RNA的效果较理想,可满足后续研究工作的需要。     

白草种子基因组DNA五种提取方法的比较

用5种方法 (传统CTAB法、改良CTAB法、高盐低p H法、改良SDS法、试剂盒法)对白草种子基因组DNA进行提取,分别用紫外分光光度计法、琼脂糖凝胶电泳法、PCR扩增检测提取的DNA的质量。结果表明,传统CTAB法提取的DNA浓度低,含有较多杂质,抑制PCR反应;改良SDS法和改良CTAB法提取的DNA纯度低,不符合检测要求;高盐低pH法和试剂盒法提取的DNA纯度高、完整性好,但试剂盒法成本高、DNA得率低。所以高盐低pH法为5种方法中最经济、效果最好的白草种子DNA提取方法。     

适用于转录组测序的灰毡毛忍冬体胚总RNA提取方法筛选

为了找到适用于转录组测序要求的灰毡毛忍冬体胚总RNA的提取方法,以体胚发育过程中的球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚为实验材料,比较分析了EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒法、RNA Cleanup Kit试剂盒法及改良CTAB法3种方法的RNA提取效果。结果表明:改良CTAB法提取的RNA浓度较低,提取过程中发生降解;RNA Cleanup Kit试剂盒法提取的RNA完整性较差,RIN值没能达到转录组测序的要求。EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒法提取的RNA质量最高,且完整性好,能够满足转录组测序的要求。     

油茶总RNA的提取与内参基因的初选

为得到高质量的油茶总RNA及稳定的内参基因,以油茶良种‘华硕’为试验材料,采用ambion试剂盒结合CTAB法进行总RNA提取。获得的总RNA完整性好,纯度高;从前期构建的油茶转录组数据中选取ACT(肌动蛋白基因)等14个基因作为候选内参基因,共设计22对引物,通过RT-PCR反应体系的优化及琼脂糖凝胶电泳检测,快速筛选出了适合油茶不同组织(器官)的内参基因。ALB(清蛋白基因),EF1α(延伸因子基因),ETIF3H(启动因子基因),UBC2(泛素结合酶基因)可以作为油茶果实初选内参基因,EF1α可以作为油茶根、茎、花及果实内参基因,ETIF3H可以作为油茶根、茎、叶、花瓣的内参基因。     

油茶种子总RNA提取及Cod8FAD基因的鉴定

油茶种子胚乳中富含脂肪、多糖和酚类公合物,要获得高质量的RNA难度较大。本研究以油茶优良无性系湘林1号近成熟种子的胚乳为实验材料,在试剂盒的基础上应用改良的CTAB法提取总RNA。结果表明,使用改良后的CTAB法配合试剂盒提取RNA操作简单,且能够有效去除油茶种子中多糖和多酚类等次生物质,从而得到高质量的RNA。以获得的RNA为模板,设计简并引物,通过RT-PCR,成功从油茶种子中鉴定出了油脂合成的关键酶基因之一△8脂肪酸脱饱和酶基因,命名为Cod8FAD(Camellia oleifera delta 8 fatty acid desaturase),该基因与茶树△8脂肪酸脱饱和酶基因相似性最高,为97%,与耧斗菜△8脂肪酸脱饱和酶基因相似性最低,为62%。     

拟单性木兰种子DNA提取方法的研究

以云南拟单性木兰种子为材料,对三种DNA的提取方法(CTAB法、SDS法、高盐-低pH值法)进行了比较.结果表明:CTAB法最适于拟单性木兰种子DNA的提取,且适宜于RAPD分析,SDS法次之,高盐-低pH值法不适合.     

天女木兰

天女木兰(Magnolia parviflora Sieb.et Zuce)(见照片1)是稀有珍贵树种之一。分布于我国安徽黄山、我省东部林区,其中以本溪地区为多,日本、朝鲜有分布。叶、花可供提炼香精、油脂,是天然香料资源。从花到种子,香味四溢,适合植於庭园,供观赏。本溪地区的天女木兰,作为香料资源在八十年代,受到科委、经委部门重视,列为重点科研项目之一。     

山核桃胚和胚乳总RNA的提取与cDNA的合成

为了快速高效地提取山核桃胚/胚乳的总RNA,满足后续实验的要求,借鉴Jaakola等的总RNA提取方法,针对山核桃种仁富含油脂及次生代谢物质的特点,对山核桃胚/胚乳总RNA提取的方法进行了改良,这种改良的CTAB法与TRIzol试剂盒法相比,虽然消耗时间较长,但得到的总RNA完整性好,纯度高,所提取的总RNA在体外能成功进行反转录.