酵母双杂交系统在植物病毒学中的应用

酵母双杂交系统应用有效的酵母遗传学方法分析蛋白质问相互作用,已成为鉴定蛋白质相互作用强有力的方法之一。文章从植物病毒编码的蛋白质间、植物病毒蛋白与植物蛋白间、植物病毒蛋白与介体蛋白间等3个方面阐述了酵母双杂交系统在植物病毒学中的应用现状,并对其应用前景进行了展望。     

酵母双杂交技术及其在植物与病原物互作中的应用

介绍了酵母双杂交系统的基本原理及其优缺点,以及十几年来此项技术在植物与病原物互作中的应用情况和此项技术的发展前景。     

酵母双杂交系统及其应用研究进展

酵母双杂交系统作为一种有效研究蛋白质相互作用的分子生物学方法,具有真实、高效、敏感、广泛的特点,被广泛应用于诸如蛋白质组学、基因组学等领域.主要对酵母双杂交技术的原理、特点及应用现状进行了综述.     

酵母双杂交技术研究与应用进展

酵母双杂交是利用遗传学方法在酵母真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的非常有效的一种分子生物学技术,被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域,已成为分子生物学研究领域的重要实验手段之一,获得了许多有价值的重要发现。随着分子生物学的发展,在酵母双杂交的基础上又建立起了酵母单杂、反向双杂交、三杂交及核外双杂交等多项技术,并已经成功地运用于蛋白质之间、蛋白质与DNA、RNA和配体之间相互作用的研究。对酵母双杂交及其相关技术与应用研究进展进行了综述。可以预见,在人类、水稻和拟南芥等模式生物基因组测序完成后,酵母双杂交及其衍生技术将在功能基因组学和蛋白质组学的研究中发挥越来越重要的作用。     

喉癌细胞酵母双杂交cDNA文库的构建

目的构建喉癌(Hep-2)细胞的酵母双杂交cDNA文库,为筛选包涵体膜蛋白分子的作用配体提供前期工作基础.方法从Hep-2细胞中提取总RNA,应用SMARTTM技术,构建以pGADT7-Rec为载体的Hep-2细胞酵母GAL4AD融合cDNA文库.结果所构建的文库展现出良好的多态性.结论可用于酵母双杂交系统的筛选.     

新城疫病毒HN蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

【目的】应用酵母双杂交技术构建新城疫病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白线性中和表位区的诱饵载体pGBKT7-HN-neu,为筛选靶向新城疫病毒HN蛋白的中和性纳米抗体奠定基础。【方法】合成HN蛋白的线性中和表位区HN-neu,将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,构建诱饵载体pGBKT7-HN-neu,经酶切鉴定和测序验证正确后,将pGBKT7-HN-neu转化酵母菌Y2H Gold,检测其在酵母细胞中的毒性和自激活作用。【结果】成功合成了HN-neu,构建的pGBKT7-HN-neu在酵母细胞Y2H Gold中无毒性和自激活能力。【结论】成功构建了诱饵载体pGBKT7-HN-neu。     

新孢子虫NcGRA7基因酵母双杂交诱饵载体的构建与鉴定

为筛选能与新孢子虫NcGRA7蛋白相互作用的靶蛋白,构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcGRA7。应用PCR技术从新孢子虫基因组DNA中扩增出NcGRA7基因,将其克隆至pMD-19T(simple)中,经过酶切鉴定后再连接至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7上。结果表明:试验成功获得了NcGRA7基因片段,测序结果中序列无碱基突变,与目标基因序列同源为100%。试验成功构建的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcGRA7,为使用酵母双杂交技术筛选与NcGRA7蛋白相互作用的蛋白奠定基础。     

采用酵母双杂交系统筛选梨PbTMT4互作因子

为筛选梨糖转运相关蛋白PbTMT4互作因子,基于已经建立好的砀山酥梨果实发育时期的cDNA文库,利用Matchmaker~(TM) Gold酵母双杂交系统,以构建的重组质粒pDHB1-PbTMT4为诱饵质粒,采用PEG/LiAc法转化酵母菌株NMY51。利用表型筛选法检测PbTMT4的自激活作用和毒害作用,利用氨基酸缺陷型培养基筛选PbTMT4互作因子。结果表明,诱饵蛋白PbTMT4在酵母双杂交系统中无毒性和自激活作用。通过酵母双杂交筛选以及测序和序列比对分析,共获得13个与PbTMT4蛋白相互作用的宿主蛋白。     

盐胁迫下大麦酵母双杂交文库的构建与鉴定

为研究盐胁迫下大麦耐盐相关蛋白的互作蛋白,利用Gateway技术构建盐胁迫下大麦的酵母双杂交文库。首先提取受盐胁迫的大麦总RNA,分离mRNA并合成双链cDNA,并通过位点特异重组系统(BP重组)将双链cDNA转入pDONR22载体,构建初级文库。然后,将初级文库质粒通过同源重组转入pGADT7-DEST载体,构建次级文库。最后,将次级文库质粒转入酵母菌株Y187中构建酵母双杂交文库。经鉴定,该酵母双杂交文库的滴度为7.0×10~7 CFU/mL,插入cDNA片段平均长度大于1 000 bp,重组率大于95.8%。所构建的酵母双杂交文库质量较高,可用于后续的互作蛋白筛选工作。     

蛋白质组学方法及其在农业生物科研领域的应用

随着分子生物学研究的逐步深入,蛋白质组学已经成为了一种新的重要技术手段和方法。首先,综述了蛋白质组学的主要研究内容和常用技术包括双向凝胶电泳,质谱技术,蛋白芯片技术,酵母双杂交系统、生物信息学,总结了蛋白质组学在农业生物科研领域中的应用概况,介绍其在植物保护、农业制药,食品和畜牧兽医方面的应用。最后,对蛋白质组学在农业生物领域作了展望。     

酵母双杂交技术的应用及进展

酵母双杂交技术能有效检测蛋白与蛋白之间的作用,已成为检测蛋白重要手段之一。笔者在酵母双杂交技术的建立、工作原理、优点和局限性4个方面作了叙述,并介绍其进一步的发展及展望。     

IHHNV编码蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活研究

应用酵母双杂交体系,构建凡纳滨对虾IHHNV 3个开放阅读框的酵母双杂交诱饵载体,并对该载体的表达产物对酵母细胞的毒性及其对报告基因的自激活作用进行检测,为运用酵母双杂交文库筛选与病毒互相作用的蛋白提供参考。对凡纳滨对虾IHHNV病毒3个开放阅读框的基因片段进行PCR特异性扩增,并运用In-Fusion技术将该基因片段与双酶切的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7进行连接,获得重组质粒pGBKT7-CP、pGBKT7-NS1和pGBKT7-NS2,并进行自激活和毒性检测。结果表明,pGBKT7-CP、pGBKT7-NS1和pGBKT7-NS2等3个重组质粒对MEL1报告基因无自激活性;对AUR1-C报告基因无自激活作用,pGBKT7-CP,pGBKT7-NS1,pGBKT7-NS2和空载体的酵母菌在SD/-Trp液体培养基中培养16 h后,菌液的OD_(600)均大于0.8,说明诱饵载体无毒性且不具自主激活报告基因的功能,所获得的无自激活作用的诱饵载体可用于酵母双杂交试验。     

蛋白质互作技术研究进展

蛋白质作为细胞活性及功能的执行者,以复杂有序的动态互作协调着细胞的增殖与分化、衰老与死亡以及环境应答等各种重要生理过程。重点介绍了酵母双杂交系统、双分子荧光互补、噬菌体展示技术、荧光共振能量转移技术、谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白沉降技术、免疫共沉淀技术等蛋白质互作研究技术的原理及在生物学中的应用,以及生物信息学在蛋白质互作研究中的应用,并对目前及未来蛋白质互作技术的发展方向进行了探讨。     

春兰花发育时期的酵母双杂交文库的构建及评价

为了研究春兰花发育相关蛋白之间的相互作用,文章使用gateway技术构建春兰花发育时期的酵母双杂交c DNA文库,文库质粒导入p GADT7-Rec2-DEST载体,并转化进酵母Y187中。检测表明,试验得到的初级文库库容量为1.47×107cfu,酵母双杂交c DNA文库库容量高达2.54×107cfu,文库的插入片段主要集中在1 000~2 000 bp。试验构建得到了高质量的春兰花发育时期酵母双杂交文库,为筛选相互作用的春兰花发育调控基因,研究春兰花发育的分子机制奠定了基础。     

酵母双杂交技术筛选与绵羊微管解聚蛋白相互作用的蛋白

采用TRIzol法提取绵羊卵巢组织总RNA,运用RT–PCR技术扩增绵羊微管解聚蛋白基因(STMN1)的编码区序列;通过同源重组技术构建重组诱饵表达载体p GBKT7–STMN1,鉴定该诱饵蛋白在酵母双杂交系统中的自激活活性、细胞毒性和表达情况;利用诱饵质粒p GBKT7–STMN1从绵羊卵巢组织细胞的酵母双杂交cDNA文库筛选互作的宿主蛋白。结果显示：成功构建重组诱饵质粒p GBKT7–STMN1,并对酵母细胞无自激活活性和细胞毒性作用,且能在酵母细胞中正常表达;筛选获得12个与STMN1相互作用的克隆,经测序比对分析和点对点验证,得到CREB和FOXM1共2个互作的宿主蛋白,这2个蛋白可能参与调控细胞的增殖、周期、凋亡等过程。     

应用酵母双杂交系统筛选GbVWR互作蛋白

前期研究表明海岛棉(Gossypium barbadense)GbVWR(Verticillium wilt resistance)基因参与了棉花抗黄萎病反应,但其抗病机制尚不清楚。本试验利用酵母双杂交系统筛选GbVWR互作蛋白,并通过对互作关系的分析初步探讨其介导的棉花抗病机制。结果表明:本研究成功构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-GbVWR,并利用PEG/LiAc法将其转化至酵母菌株Y2HGold感受态细胞中,结果显示重组质粒无自激活活性及毒性;用携带诱饵载体pGBKT7-GbVWR的酵母菌株与黄萎病诱导的海岛棉Pima90-53酵母双杂交cDNA文库进行杂交,通过PCR、测序和数据库比对分析插入的基因片段,共筛选到24个与GbVWR潜在互作的蛋白,为进一步探明GbVWR的抗病功能提供了理论依据。     

酵母单杂交系统在植物基因工程研究中的应用

酵母单杂交系统是由酵母双杂交系统衍生来的研究DNA与蛋白质之间相互作用的新型系统。该文系统阐述了单杂交系统的基本原理和技术路线,详细综述了其在植物基因工程各个领域的应用研究进展,即克隆抗渗透胁迫类转录因子基因,确定已知DNA与蛋白质之间的相互作用,定位已证实的具有相互作用的DNA结合结构域以及验证转录激活作用;并分析了当前该系统在植物基因工程研究中存在的问题,进而结合自己的研究对解决问题的途径进行了探讨。      

桃酵母双杂交cDNA文库的构建及生长素响应因子4互作蛋白的筛选

[目的]为解析桃果实发育成熟的机制,通过构建成熟期前后桃果实的酵母双杂交cDNA文库,筛选生长素响应因子4的互作蛋白,探究生长素响应因子4对桃果实成熟过程的调控作用.[方法]以硬溶质桃(Prunus persica L.)'突围'为材料,提取果皮的总RNA,建立酵母双杂交cDNA文库,采用Mating法筛选生长素响应因子4的互作蛋白.[结果]构建的酵母双杂交cDNA文库的总库容量1.6×107CFU,重组率100％,插入片段平均长度大于1 000 bp.构建诱饵载体pGADT7-PpARF4重组质粒,在桃果实酵母双杂交cDNA文库中筛选互作的靶蛋白,共获得有潜在互作的蛋白26个,主要功能涉及信号转导与胁迫响应、器官的形成、大分子代谢及蛋白合成与修饰因子.[结论]试验建立的酵母双杂交cDNA文库质量较高,完整性较好,为后续筛选果实成熟相关蛋白奠定基础.     

玉米胚芽鞘负向重力生长时期的酵母双杂交文库构建及评价

[目的]构建玉米胚芽鞘负向重力生长时期的酵母双杂交文库,并对其进行评价。[方法]以玉米骨干自交系B73为材料,利用Trizol试剂提取玉米胚芽鞘在负向生长时期所表达的总RNA,再利用SMART技术构建酵母双杂交文库,并转化进酵母Y187中。[结果]试验得到的原始文库库容量高达1×106个单克隆;文库中插入的片段集中在0.5～1.5 kb,平均插入长度为800 bp。[结论]试验构建得到了高质量的米胚芽鞘酵母双杂交文库,为研究胚芽鞘的负向重力反应机制奠定了基础。     

番木瓜eIF4E和eIFiso4E酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测

通过RT-PCR获得番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的编码区,将其分别克隆到pBD-GAL4载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pBD-GAL4-eIF4E,pBD-GAL4-eIFiso4E。测序正确后,将重组质粒导入YRG-2酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。结果表明,获得了正确的番木瓜eIF4E,eIFiso4E基因编码区,并成功克隆到pBD-GAL4诱饵载体中,且转化有诱饵载体的YRG-2在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,在SD/-His-Trp营养缺陷平板上不能生长,说明表达产物对酵母细胞无毒性,对报告基因也无自激活作用,这为下一步利用酵母双杂交系统检测番木瓜eIF4E,eIFiso4E蛋白与病毒的相互作用奠定了基础。