鸡三种免疫抑制性病毒多重荧光PCR的建立

针对禽白血病病毒（Avian leukosis virus, ALV）-p27、禽网状内皮组织增殖病病毒（Reticuloendotheliosis Virus, REV）-LTR和鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus, CIAV）-VP3基因保守序列,分别设计引物和TaqMan-MGB探针。人工合成目的基因在内的序列,并与载体连接后构建重组质粒ALV-p27、 REVLTR和CIAV-VP3基因,测序正确后作为标准质粒。对反应条件进行优化后建立了多重荧光定量PCR方法,对方法的敏感性、特异性、重复性进行评价并利用该方法对临床样本进行检测。结果表明,该方法特异性良好,灵敏度高,重复性好。用建立的方法对142份临床样品进行检测,分别检出ALV、 REV和CIAV阳性样品39、 27、51份。同时用商品荧光PCR试剂盒做对比,二者符合率达到100%。研究建立的多重荧光定量PCR检测方法,特异性和敏感性强、稳定性高,可快速准确的鉴别ALV、 REV和CIAV。     

不可忽视的禽网状内皮组织增生症病毒

禽网状内皮组织增生症(RE)是由网状内皮组织增生症病毒引起的一种传染病,此病性质为肿瘤性,会引起病禽多种临床症状,贫血、消瘦、生长缓慢等。目前,对本病尚无有效治疗方法。因此,对REV的结构功能的研究,有效的检测鉴定技术的研发是目前禽网状内皮组织增生症防控工作的重点。     

禽网状内皮组织增殖病的组织病理学和超微结构的动态变化

一日龄雏鸡腹腔接种禽网状内皮组织增殖病病毒(REV),观察感染后不同时期肝、脾、心、脑、胸腺、腔上囊、腺胃、十二指肠、盲肠、胰腺和性腺等器官组织的肉眼,组织学和超微结构的变化。根据组织病理学和超微结构检查表明:禽网状内皮组织增殖病(RE)的典型病变是实质细胞坏死和网状细胞增生。本病的靶器官主要是肝脏,其次是心、脾、腺胃、腔上囊、胰腺和性腺等。本病增生的网状细胞,通过光镜和电镜观察,能区别于鸡马立克氏病和淋巴性白血病。此外REV可导致雏鸡发生生长抑制和腔上囊萎缩,因此对病畜的增重和其它禽病的免疲预防具有较大的影响。     

番鸭中网状内皮组织增生症病毒感染的检测

网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)是一种可感染多品种禽的免疫抑制病病原,禽类感染REV后会导致机体发生免疫抑制并由此引发多种病原的继发感染(或混合感染),给养禽业造成极大损失。本研究利用针对REV基因组长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)的特异性引物,对21份2013年收集的福建(12份)和浙江(9份)两省的番鸭源病料(肝脏和脾脏组织)进行检测。其中来源于福建漳州(1株,记为REV-FJ-MD01)和浙江宁波(1株,记为REV-ZJ-MD01)的番鸭源病料检测到REV感染阳性。将目的片段经克隆后进行序列测定分析发现,REV-FJ-MD01和REV-ZJ-MD01在该扩增区域的核苷酸同源性为100%,与GenBank中的REV参考株(除鸽源REV和鸭源713株仅1个碱基差异外)核苷酸同源性也为100%;从遗传进化关系可以看出,REV-FJ-MD01和REV-ZJ-MD01与REV参考株遗传进化较近,处于相同的遗传进化分支。本研究首次证实在福建番鸭中存在REV感染。     

J亚群禽白血病病毒TD-PCR检测方法的建立及初步应用

采用J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染DF1细胞提取的总DNA作为模板,以H5和H7为特异性引物,建立检测ALV-J的降落PCR(TD-PCR)方法,并对反应体系进行优化。结果表明:建立TD-PCR方法灵敏度高、特异性强,可检测0.105 ng的DNA,该方法与网状内皮组织增生症病毒、马立克病病毒、鸡贫血病毒及I群禽腺病毒没有交叉反应。运用TD-PCR、ELISA以及病毒分离对临床病料进行检测,TD-PCR方法与ELISA检测结果一致(100%),均比病毒分离检出率(75%)高。证明TD-PCR检测ALV-J的方法具有快速、灵敏、特异等优点,可满足临床、生产实际检测的需要。     

蛋鸡网状内皮组织增生病病毒分离鉴定

山东某鸡场饲养的10000只父母代海兰蛋种鸡于育成前期出现进行性消瘦、生长发育不良等症状;剖检以腺胃肿胀、淋巴器官萎缩为特征,至70日龄发病率达90%;经ELISA方法检测抗体及间接免疫荧光原位病原检测证明该病与网状内皮组织增殖病病毒(REV)感染有关。取7只病鸡肝脏研磨处理后接种鸡胚成纤维细胞(CEF),用REV单抗11B118进行间接免疫荧光检测,结果均呈阳性;根据REV-HA株前病毒基因组DNA env囊膜糖蛋白基因序列设计引物,提取阳性CEF基因组DNA作为模版,PCR扩增后得到438 bp的目的片段;PCR产物测序结果比对显示,该毒株与其他中国野毒株的同源性高于与REV-HA株的同源性。综合诊断判定该病可能与鸡群早期感染致病力较强的REV有关。     

黔东南小香鸡种群禽白血病、禽网状内皮组织增生症和鸡白痢感染情况检测与分析

为了解黔东南小香鸡种群禽白血病（AL）、禽网状内皮组织增生症（RE）和鸡白痢（PD）的感染状况,便于有效预防、净化疫病,更好地保护黔东南小香鸡的种质资源,从鸡群采集524份血清样品,采用ELISA检测禽白血病病毒p27抗原（ALV-p27）、禽网状内皮组织增生症病毒（REV）及鸡白痢感染抗体水平,采用PCR核酸检测进行禽白血病病毒A、B、J亚群（ALV-A、B、J）鉴定。结果表明：样品中ALV-p27抗原的阳性率为85.88%、ALV-J亚群的阳性率42.67%,REV抗体的阳性率为25.57%,鸡白痢抗体的阳性率为3.82%。根据检测结果,建议尽早对种群采取净化措施,以避免AL进一步发生及流行。     

鸡病防治中网状内皮组织增殖病病毒(REV)的有害作用

本文报道对禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)进行的一些研究,电镜观察表明REV是典型的RNA肿瘤C型病毒,具有“苯环状结构”,动物感染试验表明REV与火鸡疱疹病毒(HVT)之间可产生协同作用来危害鸡群。作者采用了冰冻切片结合荧光抗体或酶标抗体技术来检测组织中的REV抗原,采用间接荧光抗体试验对广东10个鸡场进行了血清学调查,结果表明只有2个鸡场是REV抗体阴性的,其余8个场均呈不同程度的抗体阳性,特别值得提到的是,其中1个场两批鸡因注射不同来源的HVT疫苗而表现出REV抗体阳性率的显著差异,这显示了“HVT疫苗失效”一个很可能的原因是REV污染了HVT疫苗。     

冰冻切片免疫酶和免疫荧光技术快速检测REV抗原

以禽网状内皮组织增生病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)的单克隆抗体11B154作一抗,建立了在冰冻切片中快速检测REV的免疫酶(IHC)和免疫荧光技术(Mc-IFA)。运用两种技术对人工接种REV的肉种鸡和疑似REV田间病例的肝脏、脾脏、腺胃、心脏、骨髓等器官的组织进行了检测,并同病毒分离方法进行了敏感性和特异性的比较。结果表明:在人工接种的肉种鸡中,采用IHC、Mc-IFA和病毒分离方法结果一致,均为阳性;在送检的疑似RE的24份病料中,用IHC检测出阳性率51.7%(13/24),Mc-IFA检测出阳性率62.5%(15/24),其中13份存在交叉;病毒分离的阳性率为37.5%(9/24),阳性数包括在13份IHC阳性病料中。由此表明冰冻切片免疫酶和免疫荧光技术都可用于临床快速检测,其中免疫荧光可用于早期的粗检,而免疫酶可用于细胞内抗原定位。     

荧光定量PCR方法检测禽白血病病毒的研究

根据禽白血病病毒各亚群pol基因序列相对保守的特点,在其保守区内设计了1对引物,进行RT-PCR反应,扩增产物为214 bp,将该产物连接T载体作为Real-time PCR反应的标准品,利用SYBR Green I染料进行Real-time PCR反应,建立了标准曲线,并进行反应灵敏性、特异性和重复性试验。试验结果表明：标准曲线线性关系R值均为0.999以上,检测极限约为8.21E＋01拷贝数质粒DNA,比RT-PCR灵敏100倍以上;特异性分析表明只有禽白血病病毒能检测到特异性的熔解度峰值;批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%;用已建立的方法对人工感染SPF鸡的不同组织进行3次重复检测,病毒RNA的检出率为100%。以上结果表明：该方法稳定可靠,为禽白血病的早期诊断建立了特异、灵敏和快捷的方法。     

REV囊膜蛋白的原核表达、抗体制备及鉴定

[目的]禽网状内皮增生症病毒(reticuloendothelial virus,REV)囊膜蛋白与细胞表面受体结合启动病毒感染,并在REV的复制、致病过程中具有重要作用.为探索REV囊膜蛋白相关生物学特性,研究获得了高效表达的禽网状内皮增生症病毒囊膜蛋白,制备多克隆抗体.[方法]利用原核表达载体pET-28a和pGEX-6p-1表达REV囊膜蛋白gp90,并通过Ni2+亲和层析柱对融合蛋白REV-His-gp90进行纯化,纯化的蛋白免疫Balb/c小鼠,制备了多克隆抗体;纯化的REV-GST-gp90蛋白用于检测多克隆抗体效价.[结果]pET-28a-REV-gp90和pGEX-6p-1-REV-gp90表达质粒构建成功,通过SDS-PAGE验证蛋白能在大肠杆菌BL21菌株中表达;Western-blot检测结果显示制备的多克隆抗体具有良好的反应性和特异性;采用间接ELISA法检测抗血清效价为1:64000;IFA结果显示,制备的多克隆血清能与REV特异性反应.[结论]研究制备的多克隆抗体效价高、特异性良好,为进一步开展REV囊膜蛋白的生物学特性研究及其特异性抗体应用奠定基础.     

REV囊膜糖蛋白基因真核表达载体的构建

根据禽网状内皮组织增生症病毒属(REV group)鸭脾坏死病毒株(SNV)囊膜糖蛋白基因的序列，设计和合成1对引物，以SNV株前病毒cDNA全基因组克隆为模板，通过：PCR技术，扩增出该病毒囊膜糖蛋白(env)基因；将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进真核表达载体pcDNA3.1／Zeo( )中；将重组质粒转染到宿主细胞COS-7细胞中，通过间接免疫荧光试验(IFA)，证明该基因在宿主细胞中得到表达。     

鸡肿瘤病快速鉴别诊断技术的建立

根据病毒基因组特征,以聚合酶链反应（PCR）为基础,建立一种能快速鉴别马立克氏病（MD）、禽白血病（AL）和网状内皮增生症（RE）3种常见鸡肿瘤病的诊断技术。研究确定以MDV的132－bpr及ALV和REV的LTRs作为PCR扩增的特异性基因片段,改进样品DNA的提取程序,优化PCR及三重PCR的反应条件及参数,并对该诊断技术的特异性、敏感性进行研究,结果表明：建立的诊断技术具有特异、敏感、快速、经济的优点,为开发鸡肿瘤病快速鉴别诊断试剂盒奠定了基础。     

禽坦布苏病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus,ATmV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据ATmV非结构蛋白NS1的基因特征,设计特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、重复性进行检测。用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和之前建立的RT-PCR方法同时对临床15份疑似ATmV感染的病料进行检测,计算其符合率。【结果】成功建立了检测ATmV的实时荧光定量PCR检测方法,当NS1基因含量为(2.67×102)~(2.67×107)拷贝/μL时有良好的线性扩增,其扩增相关系数为0.998,扩增效率为99.9%。建立的ATmV实时荧光定量PCR检测方法敏感度高,最低检测限为2.67×102拷贝/μL;特异性强,对水禽常见病毒(如Ⅰ型鸭肝炎病毒、新型鸭呼肠孤病毒、禽流感病毒、禽Ⅰ型副粘病毒与番鸭细小病毒等)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.39%~1.17%和0.51%~1.82%。对临床送检的15份病料,TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的阳性率为73.33%(11/15),RTPCR方法的阳性率为60.0%(9/15),2种方法的符合率为100.0%。【结论】建立了基于TaqMan探针的ATmV实时荧光定量PCR检测方法,该方法可应用于ATmV感染的早期检测。     

微量双板荧光法——一种新的病毒克隆的简易方法

本文以网状内皮增生病毒(REV)为模式,建立了一种用间接荧光抗体技术(IFA)检测微量细胞培养中感染细胞内病毒抗原的方法。尤其适用于在细胞培养中生长,但不能产生细胞病变的病毒克隆。此法极大地简化了这类病毒克隆的程序,缩短了时间。在此基础上,用IFA方法在微量培养板上可对这类病毒进行样品检测、毒价测定、中和试验和分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株筛选。这是一种快速而实用的方法,优于常规方法。     

江西省主要养鸡地区4种鸡免疫抑制病的血清学调查

对江西省11个地市主要养鸡地区的24个鸡群的460份血清样品用ELISA方法进行了鸡传染性贫血(CIA)、禽网状内皮细胞增生症(RE)、禽呼肠孤病毒感染(ARV)血清抗体的检测,并对其中的368份血清样品用ELISA方法进行了J-亚型禽白血病(ALV-J)血清抗体的检测,结果CIAV、REV、ALV-J、ARV(ELISA)抗体总阳性率分别为80.65%、21.30%、6.52%、96.30%。结果表明目前江西省各地饲养的鸡群中这4种免疫抑制病的感染相当普遍,而且多为混合感染,感染一种及以上免疫抑制病的个体为99.13%,同时感染两种及以上免疫抑制病的个体为56.96%,同时感染3种及以上免疫抑制病的个体为20.43%,同时感染4种免疫抑制病的个体为2.17%。     

禽网状内皮增生病毒囊膜基因gp90的克隆表达及ELISA方法的初步建立

根据禽网状内皮组织增生症病毒( reticuloendotheliosis virus,REV) SNV株前基因组cDNA序列,经生物信息学分析,设计并合成引物,以四川分离株REV-SC1为模板,扩增囊膜基因gp90抗原性、亲水性较高的121～1 023 bp基因片段;将目的基因克隆至pMD-19T载体,进行测序和比对;将基因片段按正确的阅读框架定向克隆至pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21( DE3),以IPTG诱导表达,包涵体洗涤纯化,探讨以重组gp90蛋白为包被抗原初步建立检测REV的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法.结果表明:1)REV-SC1株gp90核苷酸序列与在GenBank上已发表序列的同源性最高为99%,于231位、870位发生了2个碱基突变;2)SDS-PAGE分析表明表达蛋白分子质量约为45 ku,与预期分子质量大小相符;免疫印迹(Western-blot)结果表明重组蛋白具有生物学活性;3)间接ELISA检测方法的最佳抗原包被质量浓度为1.5 mg.mL-1,一抗稀释度为1:320,临界值为0.126;特异性、敏感性试验结果良好.综上,本试验成功表达了REV gp90蛋白,并对其在ELISA检测方面的应用作了初步探讨.     

鹅星状病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。试验结果显示,除GAstV外,禽白血病病毒(ALV)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡传染性贫血病病毒(CIAV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的荧光定量RT-PCR检出的最低模板含量为1μl 3.75×10~1拷贝,敏感性较高;组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。利用该方法对来自安徽地区的32份临床样品进行检测,阳性检出率为43.75%,常规PCR方法阳性检出率为18.75%,阳性检出符合率100%,表明该方法可用于临床样品检测。该方法的建立为临床样品中GAstV的快速高效检测提供了技术支持。     

实时荧光定量PCR检测感染小鼠肠道内容物的LT肠毒素基因

构建LT-PMD19质粒标准品,进行SYBR Green荧光定量PCR检测产肠毒素大肠杆菌(ETEC)LT基因,以确定该方法的特异性和灵敏度,绘制标准曲线;通过腹腔注射0.2mL ETEC菌液建立小鼠腹泻模型,分别于感染后4h、15h、2d、7d和14d各处死2只,通过建立的荧光定量PCR方法对小肠液中的ETEC的LT基因进行定量检测。研究结果显示,用建立的荧光定量PCR检测LT基因无非特异性扩增,标准曲线呈良好的线性关系(R2=0.999),标准品的熔解曲线均呈单峰,灵敏度为8.18×103拷贝数/μL;小鼠感染4h后LT毒素含量最高,剖检可见小肠肿大,充满黄绿色的内容物,感染后7d、14d均未检测出LT毒素,肠道未见明显病变,表明LT肠毒素在肠道内的生成规律与肠道病变损伤呈正相关。     

雏鸡感染网状内皮组织增殖病病毒后免疫病理的研究

 研究了 1日龄 SPF雏鸡感染网状内皮组织增殖病病毒 ( REV)后 ,胸腺和脾脏 T细胞增殖反应及 T细胞数量、法氏囊和脾脏 B细胞增殖反应和抗体生成细胞数量、胸腺和脾脏 IL- 2及 IFN诱生活性的动态变化。结果发现 ,雏鸡感染 REV后 ,胸腺和脾脏 T细胞增殖反应及数量、法氏囊和脾脏 B细胞增殖反应和 Ig G+、Ig M+、Ig A+抗体生成细胞数量均明显低于未感染对照雏鸡 ;胸腺和脾脏 IL- 2及脾脏 IFN诱生活性显著下降 ,表明感染 REV后雏鸡中枢和外周免疫器官细胞免疫和体液免疫降低及细胞因子 IL- 2及 IFN免疫调节减弱。