蚯蚓MT基因植物表达载体的构建及烟草转化

为了提高植物对重金属的耐受力和富集能力,从而减少重金属对土壤的污染,本研究将克隆的赤子爱胜蚓(Eiseniafoetia)MT基因,装入植物表达载体pPZP111,构建了植物表达载体pPZP-efMT。然后用三亲法将其导入根瘤农杆菌EHA105中,通过叶盘法转化烟草。经PCR检测,efMT基因已整合到烟草基因组中,为进一步验证转基因烟草的抗重金属能力奠定了基础。     

GUS基因分泌型植物表达载体的构建及对烟草的转化

为了验证PR1B分泌肽对谜底蛋白的分泌和增强功能,以GUS基因为靶基因,成功构建了PR1B 和GUS融合基因的植物表达载体,通过三亲融合法转入LBA4404农杆菌,并对烟草进行了转化,在216株卡那抗 性植株中共获得2株GUS染色阳性植株。     

拟南芥WUSCHEL基因植物表达载体的构建及对烟草的转化

利用RT-PCR技术从拟南芥中扩增出WUSCHEL(WUS)基因,连接到诱导性表达质粒载体PINDEX3,构建出植物表达载体pIWUS,并通过农杆菌介导法导入烟草,PCR检测表明WUS基因已整合到烟草基因组中。     

MsChiⅠ基因植物表达载体的构建及烟草转化

为提高紫花苜蓿的抗根腐病性能,采用限制性内切酶(NcoⅠ和SpeⅠ)双酶切法,双酶切重组MsChi-pMD18-T质粒和表达载体PCAMBIA1302后,将MsChiⅠ基因与线性表达载体PCAMBIA1302进行定向连接,通过酶切和PCR验证MsChi-pCAMBIA1302载体构建正确性.采用快速冻融法,将表达栽体导入根癌农杆菌LBA4404中,转化烟草植株,对转化后的烟草植株进行PCR和RT-PCR检测.结果表明:成功构建Ⅰ类几丁质酶基因MsChiⅠ的植物表达载体MsChi-pCAMBIA1302,转化获得6株烟草转基因植株,目的基因已经成功整合到烟草的基因组中.     

生殖生长期烟草orf25基因的表达和ATP酶活性分析

为探讨烟草orf25基因与雄性不育性的关系,以处于生殖生长期的烟草雄性不育系MS革新3号及其保持系革新3号为研究材料,运用荧光定量技术测定orf25基因的表达量,同时测定ATP酶活性。结果表明,orf25基因在保持系不同器官中的表达量比不育系的相对较高,而在同一材料中,orf25基因在花器官中的表达量最高,叶片次之,根部表达量相对较低;ATP酶活性也是保持系的比不育系的相对较高,而在同一材料中,花器官中的ATP酶活性也最高,而叶与根之间则无显著差异。相关性分析表明,同一器官中orf25基因的表达量与ATP酶活性之间存在着极显著的正相关。     

小麦TaLRK基因高效表达载体的构建及遗传转化

从抗白粉病小麦(Triticum aestivumL)品系99/2439中分离到1个类受体蛋白激酶基因TaLRK。为了研究TaLRK基因对小麦白粉病菌[Blumeria graminis(DC)E O Speer fsptriticiEm Marchal]的抗性作用,以单子叶植物高效表达载体pAHC25为基础载体,将TaLRK基因插入到玉米泛素高效启动子Ubi1的下游,构建成pAH-TaLRK( )植物高效表达载体。利用花粉管通道技术,以高产小麦新品种周麦18为受体进行了遗传转化。T0代植株经PPT抗性鉴定、PCR扩增检测,获得了19个转基因植株,为研究小麦TaLRK基因的功能奠定了基础。     

苦豆子凝集素基因植物表达载体的构建及其对烟草的转化

[目的]了解苦豆子凝集素基因(SAL)的功能,将该基因构建到植物表达载体并转化烟草,获得转基因植株.[方法]利用RT-PCR技术,提取苦豆子总RNA进行反转录得到cDNA,通过PCR扩增得到苦豆子凝集素基因SAL,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301上,产生重组质粒pCAMBIA1301-SAL.采用农杆菌介导法将重组质粒转化烟草,并进行分析鉴定.[结果]构建了植物表达载体pCAMBIA1301-SAL,转化烟草后经筛选获得76株转基因植株,经抗性筛选及PCR和RT-PCR鉴定,其中27株显示为阳性植株.[结论]苦豆子凝集素基因已经在烟草中成功表达,为进一步研究验证转基因烟草的抗病效果奠定了基础.     

二氢黄酮还原酶基因植物表达载体构建及对烟草的遗传转化研究

以pBI121为基础载体,通过分步酶切连接分别构建组成型CaMV35S启动子、光合组织特异型PNZIP启动子驱动的DFR基因植物表达载体pBIDFR和pPNDFR;采用直接转化法将pBIDFR和pPNDFR导入根癌农杆菌菌株,采用pPNDFR/EHA105菌株对普通烟草进行了遗传转化研究.在Kanamycin选择压力下获得了烟草转化不定芽和完整植株,经过PCR鉴定,该DFR基因已成功导入烟草基因组中.     

矮牵牛PhDFR基因和抗除草剂Bar基因植物表达载体的构建及对烟草的遗传转化研究

[目的]构建矮牵牛PhDFR基因的植物表达载体,并对烟草进行遗传转化。[方法]从不同花色的矮牵牛中克隆了2个PhDFR基因,通过目的基因序列克隆、多步载体酶切、连接、转化等技术手段,将其连入通用植物表达载体pCAMBIA2300及pCAMBIA3301。利用冻融法将重组质粒导入农杆菌GV3101继而转化烟草。[结果]构建了含卡那霉素抗性筛选标记基因NPT11和除草剂抗性筛选标记基因Bar的GFP融合蛋白植物表达载体pCAMBIA2300-PhDFR-GFP和pCAMBIA3301-PhDFR-GFP。转基因植株的GUS染色结果进一步验证了所构建表达裁体的正确性和实用性。[结论]所构建的表达载体为进一步研究PhDFR基因在植物花色调控效应的功能及开展植物花色改良基因工程研究奠定了基础,为植物基因工程科研工作提供了优良的备选植物表达我体。     

GNA和α-PAP双抗表达载体的构建及对烟草的遗传转化

将带有启动子GaMV35S、终止子Nos-ter的雪花莲凝集素基因GNA插入到已构建好的植物表达载体pBI121/α-PAP上，构建成双抗表达载体pBI121/GNA α-PAP，并采用农杆菌介导法将其转化进入烟草红花大金元，获得了卡那霉素筛选的抗性植株，通过PCR扩增验证，烟草基因组中含有这两个抗性基因。     

小菊'类锌指蛋白'基因植物表达载体构建及对烟草的转化

为了建立耐盐碱小菊(Chrysanthemum morifolium)中克隆到的'类锌指蛋白基因'CmSTZF(DQ864730)的烟草遗传转化体系,并研究其抗逆特性。本研究借助Gateway技术构建了小菊'类锌指蛋白'基因CmSTZF的过量表达载体pH7WG2D-CmSTZF,并以烟草NC89(N.plumbaginifolia'NC89')的叶片为试材,通过农杆菌介导的转化,成功地建立了烟草遗传转化体系,经PCR-Southern鉴定获得CmSTZF的转基因烟草株系。     

新型HMW-GS基因1Dy12.1~(*t)植物双元表达载体的构建及其遗传转化

为了建立快速研究高分子量谷蛋白亚基(high molecular weight glutenin subunit,HMW-GS)基因功能活性的植物表达体系,以自主克隆的新型HMW-GS基因1Dy12.1~(*t)为目的基因,利用限制性内切酶Xho Ⅰ和Sal Ⅰ切割后5'端能形成相同粘性末端的特性,成功构建了1Dy12.1~(*t)的植物双元表达载体pBINHP-GluT.该载体选择使用胚乳特异性强启动子,利用已知HMW-GS基因内部均不含有的Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ内切酶位点引入1Dy12.1~(*t)编码区,并将1Dy12.1~(*t)的表达调控置于T-DNA区内,从而奠定了其在不同HMW-GS基因功能活性研究上的便利性.通过根癌农杆菌烟草叶盘转化研究目的基因1Dy12.1~(*t)在植物体的表达特性,SDS-PAGE和western blotting鉴定结果表明,1Dy12.1~(*t)在转基因烟草种子胚乳中得到高效表达,进一步证实了所克隆基因的正确性和所构建载体的有效性.     

BcMF3反义基因植物表达载体的构建及其对拟南芥的遗传转化

根据编码白菜(Brassica rapa L. ssp. chinensis,syn B. campestris ssp. chinensis)果胶甲酯酶的BcMF3 基因cDNA 序列内部第1 343～1 797个碱基之间序列设计引物,从白菜花蕾cDNA中PCR扩增出455 bp的片段,把该片段作为反义基因连接至双元载体pBI12l上,得到了植物表达栽体pBI-B3,并用"三亲杂交"法导入农杆菌LBA4404菌株中,PCR扩增和酶切结果表明所构建的植物表达载体pBI-B3含有BcMF3 反义基因片断,并已导入了根癌农杆菌(Agrobacterinm tumefuciens)中;采用花序浸润法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)后,播种筛选浸润植株的种子获得了5 株卡那霉素抗性植株,PCR 扩增证明BcMF3反义片段成功整合到拟南芥基因组中;转基因拟南芥子代(T2)的抗性分离符合孟德尔分离比例,表明外源基因是单一位点插入.     

白藜芦醇合酶基因表达载体构建及对马铃薯的遗传转化

利用从葡萄中克隆到的白藜芦醇合酶基因(Resveratrol Synthase,简称RS)构建了含有35S组成型启动子的植物表达载体P35s-2300-RS,应用农杆菌介导方法对马铃薯品种进行遗传转化.通过对抗性芽、生根、再生植株的筛选,得到5株再生小苗.经PCR、Southern检测证实,有3株为真正的转基因植株.     

棉花GhNCED2基因表达载体构建及转基因烟草表达分析

[目的]9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是高等植物脱落酸(ABA)生物合成途径中的关键限速酶.为了进一步研究GhNCED2基因的功能.[方法]构建该基因植物超表达载体PZP35S - GhNCED2,通过农杆菌介导法转入野生烟草,并利用卡那霉素筛选、PCR扩增验证和RT - PCR表达分析.对转基因烟草T1代分别进行2; NaCl、4℃、20; PEG逆境胁迫处理,利用实时荧光定量RT-PCR分析表明.[结果](1)GhNCED2基因已整合入烟草基因组中,并能在T1代中稳定表达.(2)随着时间的推移其表达量变化规律基本一致呈现先上升后下降的趋势,2; NaCl、20; PEG胁迫后GhNCED2基因相对表达量到达峰值的时间稍落后于4℃胁迫,20; PEG处理后基因的相对表达量要高于其他处理.[结论]干旱、盐碱及低温胁迫均都能诱导GhNCED2基因的大量表达,且该基因对干旱胁迫的响应更加积极,而对冷害更加迅速.     

黄瓜(Cucumis sativus L.)果瘤基因Tu表达载体构建及遗传转化

为了进一步优化黄瓜遗传转化体系,提高遗传转化效率,构建含有自身启动子的黄瓜果瘤基因(Tu)表达载体pCAMBIA2301-Tu,将表达载体通过电击法导入农杆菌菌株GV3101中,进行农杆菌介导的黄瓜遗传转化的研究。使用限制性内切酶KpnI和BamHI对质粒pCAMBIA2301和Tu基因PCR产物进行双酶切,回收目的片段,连接后成功构建Tu基因表达载体。通过优化遗传转化的生根条件以及抑制农杆菌生长条件,一定程度上提高了遗传转化的效率。580个外植体通过抗生素筛选获得的18株再生苗进行PCR检测和测序鉴定,最终获得8株阳性转化苗,转化效率为1.37%。