大肠杆菌Nissle 1917隐秘质粒消除方法的建立

质粒消除旨在获得无质粒菌株,是对益生菌进行遗传改造所需的一项重要技术。本试验建立在质粒不相容性的基础上,引入自杀性载体pRE112作为辅助工具,使用分子生物学方法构建重组自杀质粒pMUT1-pRE112和pMUT2-pRE112,将其分别导入携带2个大隐秘质粒pMUT1和pMUT2的益生菌大肠杆菌Nissle 1917(Escherichia coli Nissle 1917,EcN),利用重组自杀质粒去除EcN内原有隐秘质粒并在含有10%蔗糖的LB培养基上实施自杀质粒自身消除。结果试验成功获得EcN无质粒克隆菌株(Escherichia coli Nissle 1917cured of its two cryptic plasmids pMUT1and pMUT2,EcNc),为优质益生菌EcN更好的潜在应用研究奠定基础。     

大肠杆菌Nissle 1917株鞭毛展示6His标签的构建及相关生物学特性分析

为探索大肠杆菌Nissle 1917株(EcN)鞭毛展示的应用,本研究以重组质粒p UC18-fli C为模板,反向PCR产物经DpnⅠ、Exnase~(TM)Ⅱ重组环化,将6His标签基因分别插入无质粒大肠杆菌Nissle 1917(EcNcured of its two cryptic plasmids p MUT1和p MUT2;EcNc)fli C高变区774 bp~775 bp和792 bp~811 bp之间,构建嵌合鞭毛基因片段fliC01和fliC02。分别将其克隆于自杀性载体pRE112中,构建重组质粒pRE112-fliC01和pRE112-fliC02,并分别转化至EcNc中。通过一次重组和二次重组将嵌合鞭毛基因整合于EcNc基因组中,构建无抗性筛选的重组菌株EcNc fliC01和EcNc fliC02。对重组菌株进行生长状况、鞭毛形成以及体外细胞黏附试验和小鼠体内定植试验检测,结果表明EcNc fliC01和EcNc fliC02的生长未受影响,表达的嵌合鞭毛能够被H1多抗或His-Tag单克隆抗体识别并组装形成鞭毛丝;重组菌对IPEC-J2细胞的黏附能力及小鼠肠道定植能力与亲本株EcNc相比无显著性差异。本实验结果为进一步研究EcNc鞭毛展示技术应用于活疫苗研制奠定了基础。     

FliC蛋白R91S突变对肠炎沙门菌鞭毛形态和小鼠体内定植的影响

沙门菌血清D群3个血清型FliC蛋白氨基酸序列比对分析表明肠炎沙门菌与鸡伤寒沙门菌完全相同，二者与鸡白痢沙门菌存在第91位氨基酸位点差异。本研究旨在探究肠炎沙门菌FliC蛋白第91位精氨酸突变对鞭毛形态、细菌运动性和小鼠体内定植能力的影响。运用λ-Red同源重组技术删除肠炎沙门菌CICC10467 fliC基因，构建系列反式回补突变株，通过体外生长特性试验和Western blot试验分析各菌株生长和FliC蛋白表达情况，运动性试验分析各菌株在半固体琼脂中的泳动能力，电子显微镜观察各菌株鞭毛形态，细胞感染试验分析各菌株的细胞黏附和入侵能力，动物感染试验分析各菌株的组织侵染能力。结果表明，fliC基因缺失株及点突变回补株与野生株的体外生长能力无显著差异（P ≥ 0.05）。fliC基因缺失后肠炎沙门菌不表达鞭毛蛋白，各点突变回补株与野生株鞭毛蛋白表达量无明显差异。FliC蛋白R91S突变导致肠炎沙门菌鞭毛形态由超螺旋形态转变为钝直、柔韧度减弱，运动性显著降低（P<0.000 1），对RAW264.7和HCT116细胞的黏附入侵能力显著下降（P<0.001），对BALB/c小鼠的器官侵染能力显著减弱（P<0.001）。综上表明，FliC蛋白第91位精氨酸对维持细菌运动性至关重要，第91位精氨酸突变能够显著改变肠炎沙门菌鞭毛形态，减弱肠炎沙门菌在小鼠体内定植能力。     

禽致病性大肠杆菌clpV2基因缺失株的构建及生物学特性分析

旨在研究六型分泌系统2（type VI secretion system 2，T6SS2）clpV2基因对禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli，APEC） TW-XM菌株生物学特性的影响。本研究利用Red同源重组构建clpV2基因缺失株，将clpV2基因克隆到表达载体pBR322中，成功构建回补株。对突变株的部分生物学特性进行分析。结果显示：各突变株均能稳定遗传，且clpV2基因的缺失不影响TW-XM菌株的生长速度以及对多种抗生素的敏感性，但会导致其运动能力和生物被膜形成能力显著下降。综上表明，clpV2基因的缺失会影响TW-XM菌株的部分生物学特性，为进一步研究clpV2基因的功能和APEC的致病机制奠定基础。     

非编码小RNA InvR对肠炎沙门氏菌致病性调控的研究

为研究肠炎沙门氏菌非编码小RNA InvR对肠炎沙门氏菌致病性的作用,本研究克隆了肠炎沙门氏菌50336菌株invR基因,通过λ-Red同源重组系统构建了invR缺失突变株,并利用表达载体pBR322构建了回补株.采用比浊法测定了50336野生株,invR缺失株和回补株的生长曲线,结果显示invR的缺失不影响细菌的生长...     

Ⅵ型分泌系统分泌蛋白ClpV对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响

为研究clpV对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响,本研究通过Red同源重组构建了APEC DE17株的clpV缺失株DE17ΔclpV及其回补株DE17CΔclpV,比较分析了野生株、缺失株和回补株的生长曲线,运动性和生物被膜(BF)形成能力;对DF-1细胞的黏附、侵入能力以及通过荧光定量PCR检测clpV...     

狐肺炎大肠杆菌yihe基因缺失株的构建及致病性

为研究YihE蛋白在狐肺炎大肠杆菌致病过程中的作用,利用λ-Red同源重组方法构建狐源大肠杆菌yihe基因缺失株,并从生长特性、生化特性、抗吞噬能力、菌株毒力等几方面对突变菌株进行评价。结果表明:与狐肺炎大肠杆菌野生型菌株相比,yihe基因缺失株生长特性和生化特性无明显差异,但其抗吞噬细胞吞噬能力以及胞内存活能力有明显下降,细菌半数致死量有显著提高。本试验成功构建狐肺炎大肠杆菌yihe基因缺失株,为研究YihE蛋白的作用机制奠定基础。     

WzxE蛋白影响鸡白痢沙门氏菌致病性的研究

wzx/wzy是调控革兰氏阴性菌O抗原合成的主要途径,对细菌的生存、代谢乃至致病性均具有重要作用。为研究该基因簇中wzxE基因对鸡白痢沙门氏菌致病性的影响,本研究通过同源重组方法构建了鸡白痢沙门氏菌参考菌株ATCC19945的wzxE基因缺失菌株(ATCC19945 ΔwzxE),通过生长特性试验、应激试验、细菌蛋清存活能力测定、1日龄雏鸡感染试验对比基因缺失突变株与野生菌株、回补株的生物学特性及分析WzxE蛋白功能。结果显示,wzxE基因缺失并未影响白痢沙门菌的生长特性。应激试验显示,wzxE基因缺失会导致鸡白痢沙门菌在酸性和H_2O_2处理条件下生存能力的显著下降,回补之后得到明显回复。细菌蛋清存活能力检测结果显示,wzxE基因缺失株较野毒株在蛋清内的存活能力下降明显,回补之后存活能力显著增强。1日龄雏鸡感染试验结果显示,鸡白痢沙门菌ATCC19945野生菌株、wzxE基因缺失株和回补株对雏鸡的半数致死量分别为1. 65×10~8cfu、4. 67×10~8cfu和3. 43×10~8cfu,毒力下降不明显。提取鸡白痢沙门菌参考株和缺失株LPS,经SDS-PAGE后银染检测显示,wzxE缺失不影响鸡白痢沙门菌LPS总体成分构成,但影响特定LPS特定寡糖单位的含量。本研究为进一步阐释鸡白痢沙门氏菌细菌毒力的影响因素、疫苗开发奠定基础。     

沙门菌鞭毛蛋白免疫佐剂效应关键位点的研究

为了研究沙门菌鞭毛蛋白发挥免疫佐剂效应的关键位点,获得新型高效的蛋白免疫佐剂,从实验室保藏的质粒中通过双酶切方法获得了分别编码野生沙门菌鞭毛蛋白、D1保守区N端第88~96位氨基酸突变鞭毛蛋白、D1保守区C端第411位丙氨酸突变鞭毛蛋白、高变区第183~279位缺失鞭毛蛋白SJW61的目的基因,连接入原核表达质粒pET30a+,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达;SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白;分别以4种鞭毛蛋白混合卵清白蛋白(OVA)免疫C57BL/6小鼠,二免后收集血清ELISA检测OVA蛋白特异性抗体效价;取脾脏细胞ELISPOT法检测特异性IFN-γ及IL-4分泌细胞。结果显示:4种原核表达的鞭毛蛋白均以胞内可溶形式表达;Western blot分析显示,4种蛋白均具有良好的免疫原性;动物结果表明,4种原核表达的鞭毛蛋白及其突变体均能显著增强OVA蛋白的特异性免疫应答(P0.05),且免疫应答趋向于Th2型(P0.05),其中D1保守区N端第88~96位氨基酸突变鞭毛蛋白佐剂效应显著弱于其余3种鞭毛蛋白(P0.05),高变区缺失鞭毛蛋白SJW61佐剂效应略有降低(P0.05)。     

gltS基因缺失对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响

为研究谷氨酸转运蛋白GltS编码基因对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响，本研究利用λ-Red同源重组方法构建APEC CE129(WT)株gltS基因缺失株CE129ΔgltS(KO)和基因回补株CE129ΔgltS/gltS (RS)，并均经PCR及测序鉴定，结果显示，gltS基因缺失株及回补株均正确构建。通过连续10 h测定各菌株OD600nm值绘制WT、KO、RS菌株的生长曲线，利用梅里埃自动生化鉴定系统测定3株菌的生化特性；利用K-B纸片法检测3株菌对8类16种药物的敏感性；利用半固体培养基检测3株菌的运动能力。结果显示，3株菌的生长特性、生化特性、药敏特性和运动能力均无明显差异。利用细菌平板计数法计算检测WT与KO菌株的体外竞争指数(CI)，分析KO菌株是否致弱。利用结晶紫染色法测定3株菌的生物被膜(BF)的形成能力，并利用刚果红琼脂板及含荧光增白剂的琼脂板分别检测菌株BF中curli菌毛及纤维素的形成情况。结果显示，WT与KO菌株的体外CI为0.32，表明KO菌株轻度致弱。BF形成能力检测结果显示，相对于WT、RS菌株，KO菌株BF的形成能力极显著降低(P<...     

维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA的克隆及原核表达

本试验旨在利用大肠杆菌BL21（DE3）表达维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性。根据GenBank公布的序列设计1对引物,经PCR扩增获得flaA基因的完整开放阅读框序列,克隆至原核表达载体pET-30a,转入大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导、表达和纯化。SDS-PAGE结果显示重组目的蛋白在大肠杆菌成功表达,约在38 ku处可见清晰的表达产物,诱导产物大小与理论值相符。经Western blotting检测,结果显示表达的重组蛋白可与特异性血清抗体和His-tag抗体发生免疫反应。因此,本试验成功表达了维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA,为进一步研究其生物学功能及免疫佐剂作用奠定了基础。     

驴乳房炎大肠杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

为了查明导致新疆某规模化奶驴场乳房炎的主要病原菌及其生物学特性,试验采用常规微生物学方法对病原菌进行分离,采用生化鉴定管和16S rRNA的PCR扩增方法对病原菌进行鉴定,采用K-B药敏纸片法测定其耐药性,D_{600 nm}值绘制细菌生长曲线,最后分析同源性并构建系统进化树。结果显示,分离株为革兰氏阴性短杆菌,能在麦康凯培养基上长出粉红色菌落,在伊红－美兰培养基上长出有金属光泽的菌落;生化鉴定分离株的葡磷胨水、赖氨酸、鸟氨酸、棉子糖、山梨醇、侧金盏花醇、木胶糖试验均呈阳性,而苯丙氨酸和硫化氢试验均为阴性;PCR扩增后测序得到205 bp的1号菌株和203 bp的2号菌株,其特性符合大肠杆菌的特性;药敏结果表明,分离株对链霉素和氯霉素高度敏感,对青霉素、阿莫西林和庆大霉素耐药;生长曲线表明,分离株在2~16 h时为高度繁殖期,16~32 h处于稳定期,32 h以后开始进入衰退期;1号菌株与2号菌株同源性高达99%,1号菌株与大肠杆菌11J和RCB800的同源性最高（100%）;2号菌株与大肠杆菌675SK2和DTU-1的同源性最高（100%）;由系统进化树分析可知,1号菌株与大肠杆菌11J和RCB800处于同一个小分支,2号菌株与大肠杆菌675SK2和DTU-1处于同一个小分支。因此,导致本次驴乳房炎的病原菌为大肠杆菌,本研究结果为进一步系统研究导致驴乳房炎大肠杆菌的致病机制提供参考。     

肉鸡大肠杆菌多价灭活蜂胶苗的研制

从分离鉴定的49株大肠杆菌中筛选出5株致病力强、免疫原性好、具有优势血清型的大肠杆菌作为制苗菌株，经培养灭活后，以蜂胶为佐剂，研制出的肉鸡大肠杆菌多价灭活蜂胶疫苗，使用安全，免疫效果好。用该苗免疫后150d的保护率为100％，无不良反应。该苗4C下保存1年不失效。田间试验结果表明，该苗性能好，免疫后对肉仔鸡、肉种鸡的生产性能无不良影响，鸡群大肠杆菌病的死亡率明显下降。     

Heteroduplex mobility assay for genotyping infectious bursal disease virus

A heteroduplex mobility assay (HMA) was developed to genotype infectious bursal disease virus (IBDV). This method analyzed 390-base pair (bp) polymerase chain reaction (PCR) products, encompassing the hypervariable region of the VP2 gene. IBDV strains from the United States and other countries were analyzed. The HMA was able to differentiate standard, antigenic variants and very virulent strains of IBDV. Minor differences between different strains from the same subtype were also detected. Close relationships between field IBDV with vaccines prepared with Delaware E strain were determined by HMA. The results obtained by HMA were confirmed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) and phylogenetic analysis of nucleotide sequences. The HMA proved to be a useful technique to rapidly genotype different field strains of IBDV and should prove to be a useful tool in epidemiologic studies.     

Spontaneous antibiotic resistance mutation associated pleiotropic changes in Escherichia coli O157:H7

Besides the well-known O157:H7 clone causing enterohaemorrhagic colitis and haemolytic uraemic syndrome in Europe, Japan and North America, the number of Escherichia coli isolates with non-motile (NM) phenotype has considerably increased. We supposed that spontaneous antibiotic resistance mutation could cause this phenotypic change. To model our hypothesis we isolated rifampicin--(Rif) and ampicillin--(Amp) resistant mutants from E. coli O157:H7 prototype strains 7785 and EDL933. Among Rifr mutants we could isolate strains with no or reduced motility, while the Ampr mutants became hypermotile. The biochemical profile of the mutants had not changed but phage sensitivity and generation time of the mutants were altered. Among the representative strains we did not find polymorphism with Southern blot analysis and no polymorphism was found in the fliC gene of the mutants. The described characteristics have proven to be stable. In a mice virulence assay by intravenous infections the virulence of the derivatives was also found to be changed. In summary, we found that the antibiotic-resistant phenotype in E. coli O157:H7 was coexpressed with several other phenotypic changes including motility and virulence. It can be assumed that expression of the involved phenotypes may be under the influence of a common regulatory cascade. Further work is needed to identify the components and mechanism of this regulatory system.     

中药与抗菌药物联用对猪源大肠杆菌耐药性的抑制作用

为了探讨中药与抗菌药物联用对大肠杆菌耐药性的作用效果，本研究对河南部分地区采集的样品（50份）进行分离鉴定、生化试验及致病性试验，对分离鉴定后的致病性猪大肠杆菌选用12种中药采用K-B法进行耐药性检测，将筛选出来的中药与抗生素进行中西联用对致病性大肠杆菌做体外抑菌试验，并分析中西药联用对大肠杆菌的抑制作用。结果显示，采集的50份样品有23株菌符合大肠杆菌的分离培养特性和生化特性，且23株菌均为致病性大肠杆菌；通过耐药性检测，23株试验菌株对测试的中药均有不同程度的耐药性，其中试验菌株对甘草耐药率最高（82.6%），其次为生地（78.2%），而对黄柏（17.3%）和白头翁（21.7%）耐药性较低，具有一定的敏感性；体外抑菌试验结果发现，中药与抗生素联用均有不同程度的抑菌效果，其中黄柏、白头翁与抗菌药物联用的抑菌效果最明显。以上结果说明中药与抗菌药物联用不仅可以抑制大肠杆菌的耐药性，还可以延缓大肠杆菌耐药性的产生。     

豫北地区肉鸡大肠杆菌分离鉴定及其蜂胶灭活苗的研究

从豫北地区部分肉鸡场送检的病料中分离出了24株大肠杆菌，确定2l株菌分属8个血清型，其中02，074，01，078为主要血清型，分别占分离株的28．57％，23．8l％，19．04％，9．52％。药敏试验结果表明，所分离的24株大肠杆菌对丁胺卡那霉素、头孢曲松、头孢噻呋、氟苯尼考最敏感，可作为防治肉鸡大肠杆菌病的首选药物。从中筛选出3株致病力强、免疫原性好、具有优势血清型的大肠杆菌和标准菌株作为制苗菌株。以蜂胶为佐剂，研制出的肉鸡大肠杆菌多价灭活蜂胶疫苗，使用安全，免疫效果好。用该苗免疫后150d的保护率为100％，无不良反应。该苗4℃下保存1年不失效。田间试验结果表明，该苗性能好。免疫后对肉仔鸡、肉种鸡的生产性能无不良影响，鸡群大肠杆菌病的死亡率明显下降。     

犊牛腹泻大肠杆菌的分离鉴定和耐药性检测

为了分析南京地区奶牛场犊牛腹泻的原因,对犊牛腹泻病料进行细菌分离培养,获得了27株细菌。本试验对这些细菌进行了培养特性、染色特性、生化特性、血清型鉴定、药敏试验和TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9型超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）基因的检测。结果显示27株细菌均为大肠杆菌,只有1株细菌对头孢噻吩、头孢唑啉和头孢呋辛耐药,且此菌株检测出CTX-M-1型超广谱β-内酰胺酶基因。试验结果表明犊牛腹泻是由大肠杆菌引起的,犊牛腹泻大肠杆菌能产生CTX-M-1型超广谱β-内酰胺酶,导致对头孢类抗生素耐药性的发生。     

牛病毒性腹泻病毒E0基因的原核表达与活性检测

参考牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列设计1对引物,扩增出650 bp的E0基因片段。将目的片段克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。将E0基因定向亚克隆到pET32a表达载体中,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白经亲和层析法纯化后,免疫印迹检测证明纯化的重组蛋白具有良好的活性。     

Determination of flagellar types by PCR-RFLP analysis of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and Shiga toxin-producing E. coli (STEC) strains isolated from animals in São Paulo, Brazil

This study evaluated the polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) analysis of fliC for typing flagella antigen (H) of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and enteropathogenic E. coli (EPEC) strains isolated from different animals. The molecular typing of the H type was efficient in the determination of 93 (85%) strains. Two nonmotile (H-) E. coli strains showed a PCR-RFLP electrophoretic profile that did not match known H type patterns. The fliC nucleotide sequence of strains B2N and 4a revealed a nucleotide substitution at the restriction site and a nucleotide insertion that generated a stop codon, respectively. The results of this study showed that PCR-RFLP analysis of fliC is faster, less laborious and as efficient for the determination of H type E. coli isolated from animals, compared to serotyping and that it is useful in determining H type in nonmotile strains and strains expressing non-reactive H antigens. Moreover, the fliC sequence of strain B2N suggests that we could have found a new flagellin antigen type.