琯溪蜜柚BAC文库的构建和汁胞粒化相关基因的筛选

【目的】构建琯溪蜜柚BAC文库,利用该文库筛选与汁胞粒化相关的基因。【方法】用温和的物理方法获得高分子量DNA,部分酶切后进行回收、连接、转化,超低温保存阳性克隆。构建DNA样品混合样,PCR法筛选文库,生物信息学分析DNA序列。【结果】改进了适合琯溪蜜柚BAC文库构建的方法;构建的琯溪蜜柚BAC文库含有26112个单克隆,空载率小于1%,叶绿体DNA的污染率不超过1%,插入片段平均大小大约120kb,覆盖8倍的琯溪蜜柚基因组。利用与琯溪蜜柚汁胞粒化相关的EST序列设计PCR引物筛选文库,得到一段大小为1088 bp的DNA序列,该序列含有两段大小分别为122bp和172bp的内含子,经同源比对发现,该序列中部分序列与蓖麻(Ricinus communis)、杨树(Populus trichocarpa)多铜氧化酶(multicopper oxidase)cDNA序列分别有85%和71%的同源性;与毛叶番荔枝(Annona cherimola)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)果胶酯酶(pectinesterase)cDNA序列分别有76%和73%的同源性。【结论】本研究构建的BAC文库适用于琯溪蜜柚功能基因组的研究,从BAC文库筛选获得的DNA序列与汁胞粒化相关的基因有高度同源性。     

Bacterial artificial chromosome library construction of root-knot nematode resistant pepper genotype HDA149 and identification of clones linked to Me3 resistant locus

Pepper(Capsicum annuum.L.) is a widely cultivated vegetable crop worldwide and has the second largest planting area and the first largest vegetable output and value in China.Pepper root-knot nematode(Meloidogyne spp.) is one of the most serious pests of pepper,which caused huge losses every year.Previous studies showed that the Me3 gene is resistant to a wide range of Meloidogyne species,including M.arenaria,M.javanica,and M.incognita.HDA149,a double haploid pepper genotype,harboring the root-knot nematode resistance gene Me3,was used to construct bacterial artificial chromosome library(BAC) via the vector of CopyControl~(TM) pCC1 in this study.The library consists of 210200 BAC clones and is equivalent to 5.3 pepper genomes.The average insert size is 95 kb,and most of them are 90-120 kb;but the empty clones are less than 3%.In order to screen the BAC library easily,550 super pools with 384 BAC clones of each pool were further developed in this study.Specific primers from Me3 gene locus were used for BAC library screening,and more than 20 positive BAC clones were obtained.Then the selected positive BAC clones were analyzed by restriction enzyme digestion,BAC-end sequencing,marker development,and new positive BAC clones exploration,respectively.Finally,the contig with total length of about 300 kb linked to the Me3 locus was constructed based on chromosome walking strategy,which made a solid foundation for the cloning of the important root-knot nematode resistance gene Me3.     

中国美利奴绵羊MHC ClassⅡb区349I12 BAC克隆插入片段基因组成与结构分析

利用已测序的中国美利奴绵羊细菌人工染色体(BAC)文库MHC区段阳性克隆插入片段制备探针,筛选中国美利奴绵羊(新疆军垦型)混合组织cDNA文库,以期获得该MHC片段的基因组成与结构信息。用中国美利奴绵羊MHC ClassⅡb区域内的349I12 BAC克隆,BsaJⅠ酶切后制备α-32P放射性探针,以噬菌斑原位杂交筛选正常中国美利奴绵羊cDNA文库,并将分离所得的cDNA阳性克隆测序后进行基因结构分析。以349I12 BAC克隆制备探针经过两轮的噬菌斑原位杂交筛选,获得19个cDNA阳性克隆,经测序、比对等进一步分析确定获得17条不同序列,其中7条序列与免疫相关。绵羊20号染色体上的MHC区段包含表达序列,且多为断裂基因,对其基因结构的分析将有助于相应基因功能及调控方面的研究。     

芥菜型油菜A9染色体黄籽基因区域BAC重叠群的构建

A9染色体是芸薹属植物A基因组最长的染色体(序列约37 Mb),具有控制种子大小、种皮颜色、硫苷合成、油脂合成等重要性状的基因。利用芥菜型油菜A9染色体黄籽性状共分离标记A9-88和A9-32对已经构建的ZBjH BAC文库进行PCR步移筛选,共筛选出BAC 752个,测序395个,得到BAC末端序列674条,利用BAC末端序列设计引物533对,此外利用白菜已经公布的序列设计SSR引物38对、STS引物15对,构建了芥菜型油菜黄籽基因区域估算长约2.2 Mb的BAC重叠群。     

大白菜抗霜霉病同源基因的筛选与亚克隆文库的构建

根据植物抗霜霉病基因保守区设计简并引物,利用三维PCR方法对大白菜(Brassica campestris ssp.pekiensis)‘85-1'BAC文库进行筛选,从19 200个BAC克隆中筛选到含有目的基因的10个阳性克隆.利用HindⅡ对其中的94一G-17克隆进行酶切,回收1～5 kb的DNA片段并连接到载...     

大麦BAC文库三维混合池的构建与HvGW2筛选

【目的】从大麦BAC文库中快速筛选包含目的基因HvGW2的阳性BAC克隆。【方法】构建BAC文库三维混合池,设计2对HvGW2特异性引物,进行BAC文库筛选,对含有目的基因HvGW2的阳性BAC克隆进行测序,获得编码大麦GW2蛋白的基因组DNA序列,并与禾本科中的GW2进行同源进化分析。【结果】构建了大麦BAC文库的三维混合池160个,文库空载率为0.18%;筛选到含HvGW2的阳性BAC克隆3个,其中,BAC克隆196M02包含完整编码该基因的序列;HvGW2包含8个外显子和7个内含子,具有与其它植物GW2相似的结构特征和保守的功能结构域;同源进化分析结果显示,大麦与小麦的GW2蛋白同源性最高;序列分析发现,HvGW2第6内含子上包含2个不同类型的反转录转座子插入,从而使大麦比其它作物的GW2长度增加11.5 kb以上。【结论】通过构建三维混合池快速筛选包含目的基因的单个阳性BAC克隆,建立了大麦目标基因克隆的辅助平台;HvGW2基因组中位于内含子区的反转录转座子插入导致基因长度增加,可能是影响该基因转录水平的关键变异。     

核桃BES-SSR的开发及在遗传多样性分析中的应用

从NCBI 数据库全部已知核桃MboI 基因组BAC 文库克隆中下载22 740 条末端序列(BAC end sequences, BES)。应用MISA 软件搜索获得SSR 位点4 732 个,平均每2.8 kb 出现1 个SSR。在含有单个SSR 的BES 中,1 ~3 个核苷酸重复的类型占SSR 总数的96.86%,A/ T、AT/ AT、ATT/ AAT 分别为最丰富的单核苷酸、2 核苷酸和3 核苷 酸重复。选择不同类型和重复次数的SSR 设计合成50 对引物,从中筛选出多态性引物33 对,其中19 对引物扩增 出1 或2 个等位基因,无非特异扩增产物。应用这19 对引物对20 份核桃属不同种的基因型进行SSR 分析,结果表 明,每对引物检测到2 ~9 个多态性位点,平均多态性位点5.4 个;其中17 个位点的多态信息含量高于0.5,总平均 值为0.662,多态性较高。聚类分析显示,不同基因型按照种属分类及地理起源分组。因此,BES-SSR 是一类多态 性高,可用于核桃属植物遗传分析的新SSR 引物。      

毛白杨多态SSR引物库和种质资源指纹图谱库构建

目的针对毛白杨优树种质资源形态学差异小、不易区分等问题,利用多态SSR引物构建优树种质资源指纹图谱,为毛白杨种质资源管理、新品种选育、知识产权保护等提供参考。方法本研究以山东冠县毛白杨种质资源库469个优树无性系为对象,从毛白杨SSR多态引物筛选入手,通过荧光SSR引物PCR扩增和毛细管电泳仪检测筛选SSR引物,并构建指纹图谱。结果在2 317对SSR引物中,共计得到清晰、特异、多态、稳定扩增的SSR引物406对,这些SSR引物在19条染色体上的分布数量介于3 ~ 39对之间,利用BLAST比对分析可将其中389对SSR引物定位到毛果杨基因组,构建了毛白杨优树种质资源多态SSR引物库。应用多态性较高的SSR核心引物,以及特异的SSR辅助引物相结合的技术策略,筛选出25对多态性较高的SSR核心引物,以及13对特异的SSR辅助引物,构建了毛白杨种质资源库内469个优良无性系指纹图谱库,并完成了指纹图谱的QR编码。结论本研究成功构建了毛白杨种质资源多态SSR引物库和优树无性系指纹图谱库,对与毛白杨类似的林木种质资源遗传变异研究以及品种鉴定、系谱分析等具有重要意义。      

蓝狐褪黑激素受体1A基因的克隆及序列分析

根据已知的蓝狐MTNR1A基因部分序列和狗的MTNR1A基因序列,借助Primer5.0引物设计软件,结合PCR引物设计优化条件,设计、合成引物。用基于PCR的96孔板筛选方法从蓝狐脾脏cDNA文库中分离获得阳性克隆,其序列与已知的蓝狐MTNR1A基因部分序列有100%的同源性,与已报道的狗、马、猕猴等动物的MTNR1A的cDNA分别有98%、88%、85%以上的同源性,推测该cDNA为MTNR1A的cDNA。蓝狐MTNR1AcDNA的获得,为进一步研究Mel配体-受体间的相互作用和生物功能提供了条件。     

控制桃粘/离核PG基因的BAC克隆筛选与序列分析

【目的】控制桃果实粘/离核性状的多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase,PG）基因存在串联重复和大片段的缺失。本研究对粘核桃所处的F-M基因座序列特征进行分析,为开发相关分子标记提供依据。【方法】本研究利用构建的粘核桃单株‘87-7-1’基因组的细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）文库,通过PCR筛选出含F-M基因座的阳性克隆,利用单分子纳米孔技术进行全长测序,并对BAC克隆中的插入片段进行基因注释、序列比对和生物信息学分析。【结果】利用已有桃品种的基因组重测序数据设计PCR引物,以BAC文库为模板,扩增F-M基因座上/下游稳定共有的序列,获得了扩增产物上/下游条带均为阳性的目标单克隆46-B-10。全长测序结果表明,BAC克隆的插入片段全长为111 612 bp,GC含量为37.03%。利用基因同源共线性方法对Prunus_persica_v2.0桃参考基因组和BAC克隆之间的同源信息进行比对分析,确定了同源区域。而与已知的桃参考基因组（测序品种为‘Lovell’,离核）序列进行比对,发现只有5个基因（Prupe.4G261700、Prupe.4G261800、Prupe.4G261900、Prupe.4G262000、Prupe.4G262500）序列能比对到该单克隆全长的区域,而‘87-7-1’在相应位置缺失了4个基因共34 kb,其中包括控制桃粘/离核的EndoPGF（Prupe.4G262200）。【结论】与桃参考基因组测序品种‘Lovell’相比,粘核桃单株‘87-7-1’的F-M基因座缺失了EndoPGF,只有EndoPGM,本研究明确了粘核桃F-M基因座的结构变异情况,为粘/离核性状分子标记的开发奠定了基础。     

羊毛硫抗生素雷可肽同源基因簇的异源表达

高杰氏链霉菌中含有新型羊毛硫抗生素雷可肽(lexapeptide)的同源基因簇lxm2,为探索该基因簇相应的产物,将包含lxm2的细菌人工染色体转到变铅青链霉菌中进行异源表达,证实其可以产生雷可肽;同时还获得另一个新次级代谢产物,基因敲除实验表明此化合物的合成也与lxm2相关。通过色谱技术对新化合物进行分离纯化,结合核磁共振谱、高分辨质谱和二级质谱确定其结构为具有多重修饰的线性六肽,与雷可肽的N-端六氨基酸序列相同,命名为Lxm-N-六肽,该化合物没有检测到抗菌活性。     

抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库构建

实验以抗稻瘟病链霉菌JK-1的基因组DNA为材料构建了其BAC（bacterial artificial chromosome）文库。该文库共有3456个克隆,插入片段在40-100kb,平均插入片段55kb,空载率低于5%,覆盖了链霉菌基因组约17.3倍。抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库的构建,为进一步研究基因组结构及其功能基因的利用等奠定了基础。     

高产优质抗病棉花品种中棉所12号细菌人工染色体(BAC)文库构建

中棉所12号是我国自育的高产、优质、抗枯萎病、耐黄萎病棉花品种，其重要创新是使抗性和产量、品质得到结合改良和提高。本研究以plndigoBAC-5为载体，对中棉所12号进行了细菌人工染色体(BAC)文库构建。初步建立的文库含有38800个克隆，覆盖2倍基因组。对文库中132个重组克隆的分析表明：插入片段为50～150kb，平均大小为120kb；大于100kb的克隆占87．7％，大于110kb的克隆占56％；空载率小于1％。该文库的构建为深入开展棉花基因组有关研究奠定了基础。     

基于SSR标记的杨树新品种鉴定及核心引物筛选

目的利用经过长期筛选的11对SSR引物对50份杨树新品种（系）进行扩增,探究11对引物的品种鉴定能力和核心引物的筛选依据,为杨树新品种的鉴定、育种工作和核心引物的筛选工作奠定基础。方法使用毛细管电泳技术对扩增结果进行检测,计算等位重复序列数、Shannon信息指数和引物多态性信息指数等。按0/1矩阵记录扩增条带的有无,并通过非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析。计算单个引物和11对引物组合的遗传相似系数,分析遗传相似系数之间的相关性,剔除相关性较低的引物,再对剩余的引物组合进行聚类分析。结果11对引物共扩增出122个DNA片段,平均每对引物扩增的等位重复序列数为11.091个;不同引物PIC值的变化范围是0.530 ~ 0.908,平均值为0.803。11对引物的聚类结果显示,当支距为0.40时,参试样品可以分为2个大类;当支距为0.37时,可分为4个亚类,聚类结果与品种（系）的谱系来源基本吻合。在11对现有引物的基础上,通过分析单个引物和11对引物的遗传相似系数之间的相关性,优化得到9对核心引物。相关性分析和聚类分析表明,优化后的9对引物具有高效鉴定能力和亲缘关系聚类效果。结论本研究证实SSR分子标记可以有效鉴定杨树新品种,并较好反映品种之间的亲缘关系;同时,利用遗传相似系数的相关性可优化现有的引物,为杨树的育种及核心引物的筛选工作提供了参考。      

肠道微生物宏基因组文库构建及酯解酶基因筛选

利用宏基因组学方法,以人肠道微生物样品为原材料,构建了1个约30 000个克隆的fosmid文库.以三丁酸甘油酯为底物,通过功能筛选,获得1个酯解酶阳性克隆.对该阳性克隆构建亚克隆,挑选具有酯解酶活性的阳性亚克隆进行测序分析,最终获得1个肠道微生物来源的酯解酶基因(GenBank登录号:JQ972699).结果表明,文库克隆的平均插入片段约为40 kb,没有重复插入片段克隆.获得的酯解酶基因推演蛋白与Pyramidobacter piscolens W5455的patatin样磷脂酶同源性最高,氨基酸一致性为95％.生物信息学分析结果表明该基因可能通过Vd型分泌方式进行分泌并发挥功能.本研究是通过构建人肠道微生物宏基因组大片段文库并结合重组子功能筛选获得酯解酶的首次报道,可为食品工业提供新的酯解酶来源和筛选方法.     

瘤胃微生物基因组文库中BAC末端序列分析

基于前期从瘤胃微生物基因组文库中筛选的功能酶克隆菌,利用T7和pIBRP引物,测定功能酶克隆菌的BAC末端序列,并利用NCBI Blast系统对BAC末端序列进行分析.结果表明:共得到26条BAC末端序列,经Blast比对分析,与已知编码基因的匹配度低,而大部分BAC末端序列与阪崎肠杆菌和环境中的微生物匹配度高,说明瘤胃中的微生物与其它环境中的微生物具有一定的相似性,进一步丰富了对瘤胃微生物的认识.     

不结球白菜抗芜菁花叶病毒基因的遗传分析及SSR标记

为了找到与不结球白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)基因连锁的分子标记,采用群体分离分析法(BSA法)和SSR标记进行了与抗病基因连锁标记的筛选。通过对亲本、F1、BC1和F2群体进行病毒接种,研究了试验材料对TuMV的抗性遗传模型,结果表明:不结球白菜对TuMV的抗性由显性单基因控制。通过SSR引物筛选,得到在双亲间稳定表现多态性的引物54对。用这些引物筛选抗感池,得到1个与芜菁花叶病毒抗病基因连锁的SSR标记Ra3E05,连锁距离为8.7 cM。将该标记测序,得到1条184 bp的序列,根据该序列重新设计引物,将SSR标记转化为序列特异扩展区城(SCAR)标记SCRa2,用F2群体对其验证,带型与原SSR标记表现一致,可用于分子标记辅助育种。     

Identification of <Emphasis Type="Italic">Lr24</Emphasis> with targeted region amplified polymorphism (TRAP) analysis in wheat

This research is aimed at developing TRAP markers, as a probe for library screening, closely linked to or co-segregated with Lr24. Ninety TRAP primer pairs were used to test the resistant and susceptible parents, as well as the resistant bulk and the susceptible bulk in our study. The polymorphic TRAP primers of TcLr24 were employed to genotype the F₂ population from TcLr24×Thatcher subsequently. Ten of 90 TRAP primer pairs displayed polymorphism between TcLr24 and Thatcher, accounting for 11.11%. A further study found that primer ARBI1/RGA-2F generated a 161 bp fragment presented only in the resistance plants of F₂ population. Forty-five other wheat leaf rust resistant NILs and 30 diploid materials of wheat were also tested to detect the specificity of the primer. This specific band was amplified in TcLr19, TcLr29, TcLr38, TcLr42 and TcLr44, but absented in all the 30 diploid materials. It was concluded that this marker ARBI1/RGA-2F was closely linked to Lr24, which could be used to detect Lr24 in the F₂ population of TcLr24×Thatcher, and be further used as a probe for cDNA and BAC library screening of TcLr24.     

3类苹果资源遗传多样性的SSR对比分析

以18个新疆野苹果优系、23个鲜食苹果品种和7个苹果砧木品种为材料,对3类苹果资源的遗传多样性及亲缘关系进行分析,并对不同SSR引物的效率值进行对比分析,同时应用定位到17条染色体的80对SSR引物对3类苹果进行分析。总计扩增出254个位点,多态性位点百分率为99.61%,平均每对引物扩增位点8.47个。3类苹果多态位点百分比高低关系为新疆野苹果砧木苹果鲜食苹果;Neis基因多样性、Shannons指数和有效等位基因的高低关系为砧木苹果新疆野苹果鲜食苹果。聚类结果显示,48个品种分为鲜食苹果、新疆野苹果和苹果砧木3类,在0.68处,鲜食苹果和新疆野苹果聚到一起,说明二者有相对较近的遗传关系。新疆野苹果遗传多样性较高,鲜食苹果最低;鲜食苹果起源于新疆野苹果;不同引物的遗传参数差异较大,选择的引物效率值不同,说明引物选择的重要性。     

小豆SSR分子标记遗传连锁图谱构建

【目的】以小豆SSR为锚定标记,将公开发表的豇豆SSR、普通菜豆SSR和EST-SSR标记定位整合到小豆遗传连锁群中,构建中国小豆遗传图谱,为小豆基因定位、图位克隆和分子标记辅助选择育种提供更多可用的分子标记。【方法】用1 473对SSR和EST-SSR引物进行PCR扩增,包括906对豇豆SSR、123对普通菜豆和196对小豆SSR引物及248对普通菜豆EST-SSR引物,筛选亲本间多态性标记,验证栽培小豆HB801×AG109及GM892×AG110的F2分离群体。【结果】整合和构建了含有145个SSR和EST-SSR标记小豆遗传连锁图谱,包括59个小豆SSR标记,新增63个豇豆SSR、9个普通菜豆SSR、14个普通菜豆EST-SSR标记和1个茎色标记。紫茎色性状被定位在第9连锁群,离CEDG022和cbess058标记的遗传距离分别为0.9 cM和0.1 cM。图谱全长823 cM,覆盖11个连锁群,每个标记间平均距离为5.64 cM。每个连锁群长度为49.1—125.6 cM,平均长度74.82 cM;每条染色体上的标记数7—26个,平均13.27个。【结论】率先把小豆近缘物种分子标记引入小豆,加密了小豆SSR分子标记遗传连锁图谱。