北京鸭Myogenin基因部分序列的克隆及表达时间分析

利用4对引物分别对42、14日龄北京鸭胸肌组织RNA及出生后0日龄北京鸭腿肌组织和孵化22、15日龄胚胎腿肌RNA进行Myogenin基因的PCR反转录扩增，均没扩增出目的基因。资料分析表明在胚胎发育期内Myogenin基因可能只在成肌细胞分化的特定时间内表达，Myogenin基因也可在动物失去神经后或在体外培养的肌卫星细胞内表达。利用DNA扩增出了北京鸭Myogenin基因外显子1260bp部分序列，共编码86个氨基酸，编码氨基酸序列含有bHLH结构域，该结构与鸡、火鸡的同源性非常高。研究结果将为北京鸭Myogenin的表达、全序列的克隆及其分子标记的研究提供理论基础。     

羊驼催乳素受体基因(PRLR)exon10的克隆与序列分析

通过氰仿／异戊醇法从羊驼血液和组织中提取羊驼基因组DNA，首次扩增出羊驼PRLR基因（Prolactin Receptor，PRLR）exon10序列（GenBank登录号为DQ206831），并与其它动物相应区域作了同源性比较，结果表明：羊驼PRLR基因exon10的开放阅读框为1133bp，包括1046bp的编码区和87bp的拖尾区；同源性比较显示，羊驼PRLR基因exon10的核苷酸序列与哺乳动物（牛、绵羊、猪、狗、兔、大鼠等）的同源性较高，达80％，氨基酸序列的同源性则≥66％，而与鱼类的同源性则较低，仅为40％～45％。     

水貂PRLR基因的克隆及生物信息学分析

本研究旨在从水貂卵巢组织中克隆催乳素受体(prolactin receptor,PRLR)基因编码区全长序列,并进行生物学信息分析,为研究其结构和功能奠定基础。根据GenBank中登录的犬PRLR基因的mRNA预测序列(登录号:XM_025436332.1)设计1对引物,采集性成熟的健康水貂卵巢组织样本,提取RNA并反转录合成cDNA,以cDNA为模板PCR扩增PRLR基因,将其插入pEASY-Blunt Simple Vector中,筛选阳性克隆测序后进行生物信息学分析。结果显示,水貂PRLR基因编码区序列全长为1 878bp,编码了625个氨基酸,水貂PRLR基因核苷酸序列与海獭同源性最高,为97.7%。系统进化树分析也显示其和海獭亲缘关系最近。对水貂卵巢PRLR基因编码蛋白进行生物信息学分析表明,PRLR蛋白含有1个信号肽,1个细胞外区域,1个跨膜区和1个膜内区;水貂PRLR蛋白为单次跨膜蛋白,其N端的D1部分含有2对保守的二硫键(Cys36—Cys46和Cys75—Cys86),D2部分含有保守的WS-基序(WS-E-WS)。水貂PRLR蛋白具有和其他PRLR蛋白相似的膜外和膜内结构。本试验结果为进一步研究和揭示水貂PRLR蛋白的结构及功能奠定了基础。     

北京鸭Ⅰ型干扰素基因分子克隆与序列分析

为了进行北京鸭重组干扰素（IFN）类生物制剂的研究,根据现有鸭Ⅰ型IFN基因设计了引物对,用PCR克隆了我国标准品种北京鸭INF基因,定名为BDIFN－α开放框架（ORF）由576个核苷酸构成,编码191个氨基酸。BDIFN－α与鸭Ⅰ型IFN基因核苷酸同同源性为99．8％,在390位存在点变异,但在氨基酸水平完全一致。BDIFN－α氨基酸与鸡Ⅰ型IFN同源性在50．5％－51％,与狗、猪等哺乳类Ⅰ型和Ⅱ型IFN比较同源性低于39％,结果揭示了BDIFN－α为鸭类干扰素基因进化的一分枝。     

北京鸭Ⅱ型干扰素基因分子克隆与序列分析

应用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）技术，从伴刀豆球蛋白A（ConA)刺激培养的北京鸭脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增得到北京鸭Ⅱ型干扰素（IFN－γ）基因（DuIFN-γ2）。序列分析表明，DuIFN-γ2基因长度与报道的鸭IFN－γ基因（AF087134）长度一致，为497个核苷酸，共编码145个氨基酸的成熟蛋白，推测其分子量约17ku。两者核苷酸水平的同源性为99．6％，有2个位置发生非同义变异，其氨基酸序列的同源性为98．6％；与其他禽类同源性为67．0％－68．0％，与人的同源性为34．4％。     

山羊催乳素受体基因部分片段的克隆与序列分析

采用PCR技术扩增出济宁青山羊催乳素受体基因长892 bp的片段，该片段含有97 bp的部分外显子8序列（外显子8全长为100 bp）、683 bp的内含子8、70 bp的外显子9及42 bp的部分内含子9。将该片段克隆到pGEM-T Easy质粒中，重组质粒用PCR进行阳性克隆鉴定，然后测定核苷酸序列，并推导其氨基酸序列。该序列与绵羊、母牛、人、大鼠、小鼠的催乳素受体基因mRNA的对应序列的核苷酸同源性分别为99.4 %、97.01%、89.22%、89.22%、88.02%，氨基酸同源性分别为100%、94.55%、81.88%、81.82%、83.64%。     

水牛PRL和PRLR部分外显子基因的多态性

采用DNA样本池结合PCR-SSCP的方法,对摩拉水牛、摩拉-本地杂交水牛、尼里-拉菲水牛、尼里-本地杂交水牛、三元(摩-尼-本)杂交水牛扣广西水牛群体中PRL基因exon3/exon4和PRLR基因exon3的单核苷酸多态性(SNP)进行了研究.结果显示,在PRL-exon3/exon4基因片段中所有水牛群体全部为G核苷等位基因,没有发现A核苷等位基因(Rsa Ⅰ酶切位点),在广西水牛群体内发现1个有义突变苏氨酸突变为丝氨酸(T→S).在PRLR exon3基因片段中所有水牛群体均为S18N(丝氨酸→天冬酰胺)突变中与低产奶量相关的N等位基因,与其他水牛群体比较广西水牛群体中存在1个碱基转换(C→T).结果表明,水牛群体中PRL-exon3/4的GG核苷基因型可能与其高乳脂率相关,PRLR-exon3基因片段的N等位基因可能与水奶牛群体整体的低产奶量相关,广西水牛群体中存在的新突变可能是导致其产奶量进一步降低的原因之一.     

绦虫催乳素基因cDNA克隆及序列分析

根据文献报道的脊椎动物催乳素基因 c DNA序列的保守区 ,设计 1对引物。提取绦虫总 RNA,采用 RT- PCR扩增绦虫催乳素基因 ,琼脂糖凝胶电泳分析 PCR产物 ,将回收产物连接到 p MD- 18T克隆载体 ,对待选克隆进行 PCR和酶切鉴定。阳性克隆进行序列测定 ,获得全长 893bp的 c DNA序列 ,共编码 2 2 2个氨基酸 ,其中前 2 2个氨基酸为信号肽 ,成熟蛋白共编码 2 0 0个氨基酸。将测序结果与 Gen Bank中已知序列比较 ,推导氨基酸序列并进行活性位点分析 ,所得序列与脊椎动物催乳素同源性最高 ,含有催乳素的 2个活性区域 ,证明所得到的序列就是催乳素序列。     

鸭BLVRA基因部分cDNA的克隆与序列分析

为研究胆绿素还原酶A(Biliverdin reductase A,BLVRA)基因的遗传分化,探索其结构和功能,根据鸡、人、小鼠、牛等动物BLVRA基因编码区的保守序列设计一对引物,以缙云麻鸭输卵管子宫部的总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增出鸭BLVRA基因的一段cDNA编码序列,并对其进行测序及序列分析。结果表明:该cDNA序列由634个核苷酸组成,编码211个氨基酸,分子量为24.1ku。与鸡、小鼠、牛、蟾蜍和人的核苷酸相似性分别为92.6%、64.9%、62.8%、69.0%、63.6%;氨基酸的相似性分别为96.2%、59.7%、60.7%、68.4%、59.7%,说明BLVRA基因在进化过程中较为保守。进一步的系统进化分析表明,鸭BLVRA基因与鸡的进化关系最近,蟾蜍次之,小鼠、牛和人较远,与传统的分类地位基本吻合。该基因部分cDNA序列的克隆,为获得BLVRA基因全长及其在各组织中的表达研究奠定了基础。     

北京鸭干扰素-α基因的分子克隆与表达

采用 PCR法从北京鸭 (Anas platyrhynchosdoestica L innaeus)基因组中克隆了其干扰素 - α基因 (BJ- Du IFN- α)。克隆片段长 4 86 bp,编码 1 6 1个 Du IFN-α成熟肽。与已报道的北京鸭干扰素 -α基因相比 ,BJ- Du IFN-α在 2 85位发生了同义变异。将 BJ-Du IFN-α插入原核表达载体 p QE3 0 ,在 E.Coli JM1 0 9工程菌中表达了重组蛋白。经 SDS- PAGE、Western Blot和抗病毒活性测定 ,表达产物占菌体总蛋白的 2 3 %,为重组鸭干扰素 -α(r Du IFN-α)。 r Du IFN-α抗滤泡性口炎病毒 (VSV)活性高达 7.9× 1 0 5U /mg。     

绵羊催乳素受体基因PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术分析了催乳素受体基因(PRLR)在小尾寒羊、萨福克羊、多赛特羊、多赛特公羊×小尾寒羊母羊F1代杂种羊4个绵羊群体中的多态性。结果表明:PRLR基因在3对引物扩增片段中均存在PCR-SS-CP多态性。对于引物1,4个绵羊群体均检测到AA基因型,AB基因型只出现在小尾寒羊、多赛特羊和萨福克羊中,仅在多赛特羊中检测到BB基因型。对于引物2,4个绵羊群体均检测到AA和AB基因型,只有萨福克羊没有BB型。对于引物3,4个绵羊群体均检测到AA、AB和BB基因型。在4个绵羊群体中,A等位基因频率均明显高于B等位基因频率。     

北京鸭与樱桃谷鸭的分子遗传关系分析

为了分析北京鸭和樱桃谷鸭的遗传关系,采集包括北京鸭、在英国培育而成的肉鸭品种樱桃谷鸭及其它5个中国地方鸭品种共248个个体,利用11个微卫星标记对这7个鸭品种进行遗传关系分析.FST分析结果表明北京鸭与樱桃谷鸭的遗传分化程度最低,只有0.0795;遗传距离(Ds)分析发现北京鸭与樱桃谷鸭的遗传距离最近,为0.1079;群体分化时间分析表明二者的分化时间为98年,北京鸭与其它地方鸭品种的分化时间在282至694年之间;聚类结果显示北京鸭、樱桃谷鸭和建昌鸭聚为一类;巢湖鸭、高邮鸭、绍兴鸭和金定鸭聚为另一类.这些结果表明了北京鸭与引进品种樱桃谷鸭有非常密切的遗传关系,为樱桃谷鸭培育自北京鸭这一说法提供了分子遗传学的证据,同时本研究还发现北京鸭与樱桃谷鸭在遗传背景上已经发生了一定程度的分化.     

新型鸭呼肠孤病毒QY株S3基因克隆与序列分析

参考GenBank新型鸭呼肠孤病毒（New-type duck reovirus,NDRV）S3基因序列设计合成一对引物,对新型鸭呼肠孤病毒QY株S3基因进行RT-PCR扩增,并对PCR产物进行了克隆和测序.结果显示扩增产物为1 104 bp,与预期的目的片段大小一致.相似性分析QY株S3基因核苷酸序列与ARV代表株、MDRV代表株和DRV代表株,相似性分别59.4％ ～ 60.0％、61.1％～ 61.3％和96.7％～ 98.6％;氨基酸的相似性分别为67.6％～ 68.7％、68.1％～68.9％和95.4％～ 98.4％.表明QY株的S3基因具有不同于ARV和MDRV的特征,分离病毒QY株是不同于禽呼肠孤病毒和番鸭呼肠孤病毒的独立基因群.     

番鸭细小病毒安徽分离株结构蛋白基因的克隆及序列分析

为研究番鸭细小病毒(MDPV)安徽分离株的遗传变异特征,通过PCR扩增获得了MDPV结构蛋白(VP)基因全长序列AH-MDPV-VP,并将该序列与GenBank中登录的12条MDPV和鹅细小病毒(GPV)VP基因序列进行比对。结果显示,AH-MDPV-VP基因全长2 199bp,包括完整的VP1、VP2和VP3蛋白编码区。MDPV与GPV的VP基因部分序列一致,但具有明显的差异。进化分析显示,MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH为同一分支,亲缘关系较近。同源性分析显示二者核苷酸序列同源性最高,为99.9%,且AH-MDPV-VP与GPV毒株SHFX1201的序列同源性也有89.5%。此外安徽分离株与其他MDPV的VP1、VP2和VP3基因同源性有逐步下降的趋势,而与GPV则相反呈上升趋势。进一步显示MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH相似,可能为MDPV和GPV基因重组型水禽细小病毒。     

鸭MyoG基因编码区的克隆及其在鸭心肌组织发育中的表达研究

肌细胞生成素(myogenin,MyoG)在胚胎发育中发挥作用,并能与在心脏发育过程中起重要作用的MEF2基因家族协同促进肌肉的分化,而其在心肌发育中的作用却鲜有报道。为研究其在胚胎心肌组织发育过程中的作用,本研究扩增了鸭MyoG基因CDS序列,并采用实时荧光定量PCR法检测了MyoG在鸭E10、E14、E18、E22、E27 d及出生后1周雏鸭(P7 d)心肌组织中共6个阶段的表达变化。基因扩增得到鸭MyoG基因CDS序列共684bp,编码227个氨基酸,预测其含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域。结果表明:MyoG在鸭E10 d中的表达量最高,显著高于E14、E18、E22和E27 d(P0.05);E14 d与E18 d,E22 d和E27 d之间的表达差异不显著(P0.05);MyoG在鸭出壳前心肌组织中的表达量整体呈现下降趋势,出生后1周,表达量又明显上升,与E22 d和E27 d差异显著(P0.05)。MyoG在鸭心肌组织的发育中起作用,其机理可能是通过MyoG的bHLH结构域直接或以MEF2基因家族介导间接实现对心脏发育的调控。     

鸭Toll样受体3基因克隆及序列分析

为研究鸭Toll样受体3(TLR3)的结构及功能,根据GenBank中已公布的番鸭TLR3(JQ910167.1)基因设计引物,采用RT-PCR从北京鸭外周血单个核细胞中克隆出北京鸭TLR3,命名为duTLR3。利用生物信息学技术预测其结构及功能,研究表明,duTLR3基因开放阅读框为2 688bp,编码895个氨基酸,富含17.0%亮氨酸;该分子属于Ⅰ型跨膜受体,由胞外区(1-695aa)、跨膜区(696-718aa)和胞内区(719-895aa)3部分组成,N端含有一个信号肽序列,胞外富含18个亮氨酸重复序列(LRR),胞内含有Toll/IL-1R同源区结构域。核苷酸序列同源性分析显示,duTLR3与金定鸭TLR3亲缘关系最接近达到99.6%;与番鸭、鹅、原鸡、斑胸草雀的亲缘关系次之,并同属于禽类分支上;与番鸭、鹅、原鸡、斑胸草雀、人、猕猴、狒狒、小鼠、大鼠、猪、牛、羊、猫亲缘关系渐远;与草鱼和鲤鱼亲缘关系最远。北京鸭体内组织分布结果显示,duTLR3为组成性表达。本研究成功克隆了北京鸭TLR3基因,预测分析并证实了duTLR3具有典型的TLR家族结构特征,为后期探究TLR3如何识别病毒的RNA及引起下游信号级联反应奠定了基础。