检测禽流感病毒抗体的重组核蛋白间接ELISA方法的建立

以大肠杆菌系统表达的H9N2亚型禽流感病毒（AIV）核蛋白（NP）为抗原，建立了禽流感间接酶联免疫吸附试验抗体检测技术（NP—ELISA）。对263份待检血清（包括临床收集的243份血清和20份H9N2亚型AIV免疫鸡阳性血清）进行检测，NP—ELISA与琼脂免疫扩散试验（AGP）的总符合率为83．3％，与血凝抑制试验（HI）的总符合率为92％。特异性试验表明，NP—ELISA方法可以检测H5、H7和H9亚型AIV特异性抗体，检测为阳性的血清样品能够被阳性鸡胚尿囊液阻断。敏感性试验证实，NP—ELISA最早可以检测鸡感染后7d的血清样品，并于感染后10d确定100％血清阳性，而AGP检测直到首免后21～28d才出现部分血清阳性，HI检测直到10～14d才出现部分血清阳性，并且NP-ELISA要比HI敏感4～40倍。试验证明，NP—ELISA是检测AIV血清型特异性抗体的一种特异、敏感、快速、经济的血清学检测技术。     

应用C—ELISA检测禽流感病毒核蛋白抗体

应用杆状病毒表达的重组核蛋白及单抗建立了竞争ＥＬＩＳＡ（Ｃ－ＥＬＩＳＡ）,用于抗Ａ型禽流感病毒核蛋白抗体的检测。试验检测了７５６只鸡,１１２３只火鸡,７０７只鸸鹋和１２６１只鸵鸟的共３８４７个血清样品。与琼脂扩散试验（ＡＧＩＤ）对比,Ｃ－ＥＬＩＳＡ方法对上述四种血样的敏感性均为１００％;而与血凝抑制试验（ＨＩ）相比,则其敏感性在鸡、火鸡和鸸鹋为１００％。鸵鸟为９６．２％。经ＡＧＩＤ检测为阴性而Ｃ－     

应用C—ELISA检测禽流感病毒核蛋白抗体

应用杆状病毒表达的重组核蛋白及单抗建立了竞争ＥＬＩＳＡ（Ｃ—ＥＬＩＳＡ）,用于抗Ａ型禽流感病毒核蛋白抗体的检测。试验检测了７５６只鸡,１１２３只火鸡,７０７只鸸鹋和１２６１只鸵鸟的共３８４７个血清样品。与琼脂扩散试验（ＡＧＩＤ）对比,Ｃ—ＥＬＩＳＡ方法对上述四种血样的敏感性均为１００％;而与血凝抑制试验（ＨＩ）相比,则其敏感性在鸡、火鸡和鸸鹋为１００％。鸵鸟为９６．２％。经ＡＧＩＤ检测为阴性而Ｃ—ＥＬＩＳＡ阳性的样品中有９０％以上通过ＨＩ试验至少一种血清亚型呈阳性反应。试验发现Ｃ—ＥＬＩＳＡ和ＡＧＩＤ方法的特异符合率在８５．５％—９９．８％之间。这些结果表明,Ｃ—ＥＬＩＳＡ和ＨＩ一样都比ＡＧＩＤ更敏感、更特异。因此,Ｃ—ＩＬＩＳＡ有可能取代ＡＧＩＤ,用于禽类（包括平胸鸟）Ａ型流感病毒血清学监测。     

禽流感抗体斑点—ELISA诊断技术的研究

以混合纤维素酯微孔滤膜为固相载体,用自制的禽流感全病毒抗原和酶标抗体,建立了禽流感抗体斑点 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 检测法,其抗原最适包被量为 ０．０６μｇ／点;血清抗体最佳稀释度为 １１００;酶标抗体作 １２００ 稀释;出现明显清晰的斑点者判为禽流感抗体阳性。该方法对 Ｓ Ｐ Ｆ鸡血清及新城疫、传染性法氏囊病等其它 １１ 种鸡疫病阳性血清均为阴性,对不同亚型特异性的禽流感病毒（ Ａ Ｉ Ｖ）分型血清、琼扩（ Ａ Ｇ Ｐ）阳性血清及血凝抑制（ Ｈ Ｉ）阳性而 Ａ Ｇ Ｐ疑似的血清样品均呈阳性;对人工接种 Ａ Ｉ Ｖ 的 Ｓ Ｐ Ｆ鸡第 ３ 天即能检出抗体阳性,第 ５～１１７ 天可全部检出。与间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 法比较,不仅其特异性、敏感性、重复性相一致,而且结果可用肉眼判定,更适合现地禽流感抗体监测及流行病学调查。     

猪传染性胃肠炎病毒重组核蛋白的纯化与Dot—ELISA抗体检测方法的建立

将重组猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）N基因原核表达载体p^ProEXHTb转化的大肠埃希氏菌，用IPTG诱导表达核蛋白，经过Ni-NTA柱的纯化，获得纯化核蛋白。以该蛋白制备抗原，建立了以TGEV N蛋白重组抗原的Dot-ELISA诊断技术，其抗原最适包被量为1μg，抗原预点膜在4℃可保存5周以上。本法快速简便，适合基层进行抗体检测。     

禽流感病毒重组核蛋白在琼扩诊断中的应用

利用杆状病毒表达禽流感病毒型特异性抗原－核蛋白,并就重组核蛋白作为禽流感琼扩诊断抗原地特异性和敏感性及作为抗原的其它特性进行了研究,并与普通全病毒琼扩抗原进行了应用比较试验,对３５４份现地可疑血清样品进行了检测,结果表明：该抗原可以特异性地定性检测出所有１５个禽流感病毒亚型的抗血清,与普通全病毒琼扩抗原的检测结果一致,但沉淀线更细密、清晰,保存方便;与我国广泛流行的１５种禽类其它病原体的抗血清没有任何交叉反应,表明该重组核蛋白作为禽流感琼扩抗原特异、敏感、生物安全性更可靠和生产成本更低廉,有利于进一步扩大禽流感疫情调查范围和加大监测力度。     

禽流感病毒核蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地扩增了我国禽流感病毒分离株Ａ／Ｘｉｎｇｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）的核蛋白（ＮＰ）基因,其限制性内切酶图谱和核苷酸序列与鸭源的标准Ｈ１４Ｎ５毒株几乎完全一致,与其它毒株则有较大差异,说明该鸡源分离株与鸭源毒株有非常近的亲缘关系。将ＮＰ基因定向克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３中,再与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－ＢｌｕｅＤＮＡ）共转染于Ｓｆ９昆虫细胞中,经过三次蚀斑筛选,获得重组病毒ｒＢ２。用其细胞表达产物裂解后作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ,结果表明ＮＰ基因在杆状病毒系统中获得了表达。同时用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与现行标准禽流感琼扩抗原具有相同的生物学活性。     

禽流感病毒核蛋白研究进展

禽流感病毒 (Ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ,ＡＩＶ)属Ａ型流感病毒 ,主要引起禽类以呼吸系统疾病、产蛋下降乃至急性致死和高死亡率等为特征的烈性传染病 ,常给养禽业造成毁灭性打击。ＡＩＶ亚型众多 ,极易发生基因突变、重组和重排 ,使其变异发生很快 ,加上该病缺乏典型症状 ,易与其它禽病混淆 ,给禽流感的免疫和诊断带来极大的困难。近年来发展起来的分子诊断技术将禽流感诊断向前推进了一步 ,这也导致了对ＡＩＶ核蛋白 (ＮＰ)及其基因研究的高度重视[1] 。研究内容主要是针对ＮＰ结构的保守性进行了诊断和免疫方面的研究。本…     

禽流感病毒血凝素与核蛋白在重组禽痘病毒中的共表达

为克服禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)仅诱导机体产生亚型特异性免疫应答的不足,本研究拟将病毒核蛋白(NP)基因与HA基因在重组禽痘病毒中实现共表达。首先构建转移载体,从测序质粒pUCNP中切下目的基因克隆到载体pSY538早晚期启动子LP2EP2的下游,再将含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2的NP基因片段亚克隆到已有的AIVHA基因重组禽痘病毒转移载体中,即得到同时含有HA和NP两种基因的重组转移载体pSY(HA NP)。将转移载体脂质体转染已感染禽痘病毒亲本株S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞。根据报告基因β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的表达,蓝白斑法筛选重组病毒,经数轮蚀斑纯化,PCR鉴定及West-ern-blot分析,结果表明所获得的重组病毒能高效表达AIVHA及NP两种蛋白。此研究为进一步研制更为有效的禽流感基因工程活病毒载体疫苗奠定了基础。     

禽流感病毒分离株 A/Chicken/Wangcheng/4/2001(H9N2)核蛋白基因(NP)的克隆和序列分析

用无特定病原体 (ＳＰＦ)鸡胚增殖禽流感鸡体分离株Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｗａｎｇｃｈｅｎｇ／４／２００１(Ｈ９Ｎ２)(ＷＣ２００１),提取病毒总ＲＮＡ。根据已发表的Ａ型流感病毒株ＮＰ基因序列 ,设计一对引物 ,运用反转录 -聚合酶链反应(ＲＴ -ＰＣＲ)扩增该病毒分离株的ＮＰ基因 ,克隆后进行序列测定。序列分析表明 ,扩增的ＮＰ基因为相应的开放阅读框架。ＷＣ２００１株ＮＰ基因序列与数株Ａ型流感病毒ＮＰ序列进行比较 ,相互间同源性在８０%左右 ,其中与Ａ／Ｄｕｃｋ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｙ２８０／９７(Ｈ９Ｎ２)有很高的同源性 ,而与人流感病毒株和猪流感病毒株差异较大 ,显示禽流感病毒特征。     

Development of Indirect Enzyme-linked Immunosorbent Assay with Nucleoprotein as Antigen for Detection and Quantification of Antibodies against Avian Influenza Virus

Avian influenza (AI) is a serious infectious disease caused by avian influenza virus (AIV) belonging to type A Orthomyxovirus. In the present study, we developed an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) employing E. coli-expressed full-length nucleoprotein (NP) of H9N2 avian influenza virus for the detection and quantification of antibodies against AIV nucleoprotein. The NP-ELISA was compared with the AI agar gel propagation (AGP) test, haemagglutination inhibition (HI) test, and IDEXX-FlockChek ELISA using 263 sera. The NP-ELISA was significantly more sensitive than the AGP and HI tests, and showed 96.2% agreement ratio with IDEXX-FlockChek ELISA. With results obtained using the NP-ELISA, an ELISA titre (ET) prediction equation, with which the ELISA titres of a flock or individual chickens can be determined, was derived from a positive/negative (P/N) ratio standard curve. The NP-ELISA enables an alternative rapid serological diagnosis and is suitable for influenza A antibody screening, especially in species that harbour several influenza subtypes.     

利用类病毒脂质体抗原检测H5N1亚型禽流感病毒抗体ELISA方法的建立

利用昆虫杆状病毒表达系统制备了H5N1亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白、类病毒脂质体和病毒样颗粒,分别作为包被抗原,建立了相应的检测H5N1亚型禽流感病毒抗体的ELISA方法。特异性试验、敏感性试验、重复性试验和稳定性试验结果表明,利用3种抗原包被所建立的ELISA方法均具有良好的重复性和稳定性,批间和批内变异系数均小于10%,但单独表达的HA蛋白和类病毒脂质体特异性更好,而且类病毒脂质体有更高的免疫反应性,与灭活全病毒相比安全性更高,故在H5N1亚型AIV抗体水平检测方面更具有应用前景。     

鸡传染性支气管炎病毒DB株核蛋白基因的克隆及在杆状病毒系统中的表达

利用PT－PCR方法扩增鸡传染性支气管炎病毒（IBV）DB株的核蛋白基因，并对其序列进行了测定，DB株IBV的核蛋白基因长度为1230bp，编码蛋白由409个氨基酸残基组成。与已发表的参考毒株进行核苷酸同源性比较，发现DB株与澳大利亚群毒株的亲缘关系最为密切。同时构建了杆状病毒重组转移载体pBlue-DB-N，将其与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞，经过3轮蚀斑纯化和聚合酶链式反应（PCR）鉴定，获得重组杆状病毒rBac-DB－N。SDS－PAGE分析和Western blot检测的结果表明DB株IBV核蛋白基因基因在重组杆状病毒感染原Sf9昆虫细胞内获得表达，融合蛋白最大表达量占细胞蛋白总量的19．4％左右。     

H14亚型禽流感病毒核蛋白基因的扩增与克隆

本研究直接从浓缩的鸡胚尿囊液中提取Ｈ１４禽流感病毒的ＲＮＡ,并根据已发表的Ａ型流感病毒株的核苷酸序列,设计一对引物,采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术成功地扩增了ＡＩＶ的核蛋白（ＮＰ）基因,以ｐＵＣ１１９为载体,以大肠杆菌ＪＭ８３为受体菌,并通过限制性分析证实,成功地克隆了该ＮＰ基因     

几种圈养珍稀雉鸡H5N1禽流感疫苗免疫后抗体水平研究

家禽对禽流感疫苗免疫效果的研究多有报道,但现有的禽流感疫苗对野生禽类的有效性尚所知甚少。本文以白冠长尾雉、蓝鹇、红腹锦鸡、白腹锦鸡4组野生雉鸡类为研究对象,以家鸡为对照,进行禽流感H5N1亚型疫苗免疫。利用血凝（HA）及血凝抑制（HI）实验,分别在首免日、免后10 d、20 d、40 d、60 d、90 d及120 d监测禽类免疫后抗体水平变化。结果显示,4组野生雉鸡类均在疫苗接种后产生禽流感抗体,且达到具保护力的抗体水平。通过免疫后抗体水平的跟踪研究,证明商品化禽流感疫苗对野生雉鸡类动物有效。