拟黑多刺蚁hsp90基因的RNA干扰及其对EcR和USP基因mRNA表达的影响

【目的】对拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina Roger)成虫热激蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)基因进行RNA干扰(RNAi),为分析hsp90基因的功能及将RNAi技术用于害虫防治提供参考。【方法】采用Trizol法提取拟黑多刺蚁总RNA,反转录合成cDNA第一链用于hsp90基因的克隆。利用T7RiboMAXTM Express RNAi System将hsp90合成双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),将其配制成120,60,30,15和7.5ng/μL的溶液饲喂拟黑多刺蚁雌蚁、雄蚁和工蚁成虫进行RNAi,共饲喂14d,记录成虫死亡率,确定dsRNA最适质量浓度,并以此剂量对各品级成虫进行干扰,通过荧光实时定量PCR,检测干扰效果及干扰hsp90基因对EcR、USP mRNA表达的影响。【结果】成功获得拟黑多刺蚁hsp90基因片段,其长度523bp,并合成了dsRNA。饲喂dsRNA后发现,dsRNA质量浓度越大,拟黑多刺蚁死亡率越高,在dsRNA质量浓度为120ng/μL时,饲喂5d后成虫全部死亡;30ng/μL是dsRNA干扰的最适质量浓度。以30ng/μL dsRNA干扰后,荧光实时定量PCR结果表明,拟黑多刺蚁每个品级成虫hsp90基因mRNA均被沉默。hsp90基因被干扰后,EcR的表达没有显著变化,USP的表达显著降低。【结论】采用饲喂法成功干扰了拟黑多刺蚁hsp90基因mRNA的表达;hsp90基因与USP基因表达有一定的相关性。     

细菌表达 dsRNA 介导桔小实蝇 flightin基因的 RNA 干扰

【目的】探索饲喂细菌表达目标基因dsRNA介导桔小实蝇flightin基因RNAi的可行性。【方法】将桔小实蝇flightin基因的相应干扰片段构建至L4440干扰载体,并转化大肠杆菌HT115(DE3)菌株,利用IPTG诱导表达flightin基因对应的dsRNA,命名为flightin-dsRNA。【结果】通过饲喂表达flightin-dsRNA的大肠杆菌10倍浓缩菌液,桔小实蝇flightin基因的表达普遍出现了不同程度的上调,其中,雌虫饲喂后5、10、20 d,雄虫饲喂后5 d与对照差异显著,雄虫饲喂后15 d诱发约43%的下调;该方法对桔小实蝇飞行能力及胸部肌肉发育未产生明显影响。【结论】通过饲喂表达flightin-dsRNA的大肠杆菌对桔小实蝇flightin基因进行RNA干扰不可行或干扰效果不明显。     

RNAi及其在哺乳动物中的应用*

 RNA干扰(RNAi)是由特定双链RNA(dsRNA)引发的转录后基因沉默,广泛存在于真菌、植物和动物中,它是近年来迅速发展起来的高效、特异、易操作的基因阻断技术,在功能基因组的研究中有着广阔的应用前景。研究表明,断裂dsRNA产生的小干扰RNA(siRNA)可抑制哺乳动物基因表达。从哺乳动物整体水平应用研究的角度,对RNAi的分子机制、生物学功能和特点,siRNA导入体内的方法以及应用等方面的研究作一综述。     

松材线虫RNA聚合酶基因的RNA干扰研究

克隆了松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)RNA聚合酶基因片段,构建大量表达松材线虫RNA聚合酶基因片段的特异双链RNA(dsRNA)表达载体,并用表达的双链RNA(dsRNA)对松材线虫进行了RNA干扰实验。结果表明,松材线虫浸泡在20℃的RNA聚合酶基因双链RNA(dsRNA)溶液中干扰24 h后再培养12 d,其繁殖倍数为73.2;对照处理的繁殖倍数为322.8,两者的繁殖倍数相差4.4倍;松材线虫浸泡在4℃的RNA聚合酶基因双链RNA(dsRNA)溶液中干扰24 h后再培养12 d,其繁殖倍数为120.8。RNA聚合酶基因的双链RNA(dsRNA)浸泡明显的抑制了松材线虫的繁殖;并且发现利用浸泡法对线虫进行干扰试验,双链RNA(dsRNA)20℃浸泡的干扰效果要好于前人报道4℃浸泡的干扰效果。     

双价RNA干扰载体的构建及dsRNA体外饲喂褐飞虱的研究

RNA干涉作为一种重要基因沉默技术,已广泛用于昆虫基因功能的研究。通过人工饲喂或显微注射dsRNA介导RNAi在许多昆虫中取得了成功。为利用RNAi技术进行褐飞虱防治研究,本试验通过重组PCR,获得了编码V-ATPase D亚基和编码V-ATPase H亚基基因片段的融合基因,在此基础上构建了该融合基因发夹结构的RNAi表达载体,通过体外合成dsRNA喂食褐飞虱若虫后导致褐飞虱体内目标基因的表达下降和死亡率的增加。因此双价RNAi载体的构建为利用RNA沉默技术进行植物抗飞虱研究奠定了基础。     

利用RNAi技术沉默麦长管蚜与桃蚜细胞色素P450

【目的】通过体外饲喂双链RNA（dsRNA）,利用RNAi技术沉默麦长管蚜和桃蚜体内细胞色素P450。【方法】采用PCR克隆获得麦长管蚜和桃蚜体内细胞色素P450片段;利用双链RNA合成试剂盒合成麦长管蚜和桃蚜细胞色素P450保守序列的dsRNA;在蚜虫人工饲料中,分别加入终浓度为0、3、5和7.5 ng•μL-1的dsRNA,每个试验组设置3个重复,分别于饲喂后2天、4天、6天、8天统计蚜虫的存活数;利用实时荧光定量PCR技术分析饲喂后目标基因的表达抑制情况。【结果】从麦长管蚜与桃蚜的cDNA中分别克隆细胞色素P450,所克隆片段同源性为90.1%,发现随着dsRNA浓度的增大,麦长管蚜和桃蚜的死亡率随着时间的推移不断升高,最高死亡率可分别达75.56%和64.44%。提取饲喂dsRNA浓度为7.5 ng•μL-1的不同时间段的蚜虫总RNA,实时荧光定量PCR结果表明,目的基因被沉默。【结论】利用麦长管蚜和桃蚜细胞色素P450保守序列的dsRNA,体外饲喂后,通过RNA干扰（RNAi）,能够显著降低蚜虫体内细胞色素P450的表达水平,直至导致目的基因沉默和蚜虫死亡。     

中华蜜蜂气味受体AcerOr2基因最佳干扰片段的筛选

为了筛选出中华蜜蜂气味受体基因AcerOr2最佳干扰效率的序列,以中华蜜蜂气味受体AcerOr2基因为靶标,分别选取3个片段AcerOr2-1(411 bp)、AcerOr2-2(205 bp)和AcerOr2-3(471 bp),并构建相应的dsRNA表达载体,获取dsRNA后进行RNAi试验,通过qPCR和Western从mRNA水平和蛋白水平检测干扰效率。mRNA结果显示,饲喂3个不同的片段AcerOr2-1(411 bp)、AcerOr2-2(205 bp)和AcerOr2-3(471 bp)对AcerOr2表达量均会产生抑制作用,抑制率分别为69.72%±0.49%、47.26%±0.25%、73.17%±0.97%,抑制率最佳的是471 bp的dsRNA AcerOr2-3。Western Blot结果显示,饲喂3个大小不同的干扰片段后AcerOr2蛋白的表达量均受到显著抑制。试验成功构建AcerOr2基因干扰载体,最终确定471 bp的dsRNA AcerOr2-3为最佳干扰片段,证实其能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达。研究结果可为进一步应用RNAi技术研究该基因的体内外功能奠定基础。     

RNAi在哺乳动物中的研究新进展

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一种高度保守的、基于RNA水平的特异性降解机制,它通过特异性地抑制基因的表达来快速、简便以及大规模地鉴定基因的功能。虽然dsRNA不能应用于哺乳动物,但是小分子干扰型RNA（siRNA）的技术却证明RNAi可以成功应用于哺乳动物。近年来,RNAi技术在哺乳动物中得到了飞速发展和广泛应用,包括设计更加合理、更加有效的siRNA,在更多的已经分裂或者尚未分裂的细胞系中诱导RNAi,通过瞬时RNAi或转基因RNAi在活体动物中抑制基因的表达,建立时空调控或组织特异性的RNAi以及利用RNAi对哺乳动物基因组功能进行大规模的筛选和鉴定。本文对近几年RNAi在哺乳动物中的研究新发展进行综述。     

RNA干扰研究现状

RNA干扰(RNAi)是指生物体内利用双链RNA(dsRNA)诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默的现象。其在抵抗病毒感染、抑制转座子活动、调控内源性基因表达等方面发挥重要作用。RNAi以其高特异性、高效性等显著优势将成为研究基因功能的全新手段。简要概括RNAi作用机制和siRNA技术的原理,同时也讨论了RNAi技术在其他领域,如在基因信号通路研究、高通量研究基因功能、基因治疗如肿瘤研究和疾病治疗等方面的应用。     

利用RNA干扰技术沉默稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因

稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)是一种主要的水稻害虫,几丁质合成酶是昆虫体内几丁质合成通路中的一个关键酶,在昆虫生长发育中具有重要作用,是控制害虫的理想靶标。本文采用RNA干扰(RNAi)技术,以稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因(CmCHSA)为靶标,设计两个靶位点CmCHSA-I和CmCHSA-II,在体外分别合成其双链RNA(dsRNA),用显微注射法导入3龄幼虫体内,然后通过表型观察和荧光定量PCR(RT-q PCR)检测干扰效应。结果表明,注射两种dsRNA后纵卷叶螟对水稻的取食明显下降,生长发育阻滞,虫体变小变黑和畸形,有的出现死亡。RT-q PCR表明,注射CmCHSA-I和CmCHSA-II两种dsRNA在96 h后,CmCHSA的表达量相比对照分别下降了59%和64%。注射CmCHSA-I和CmCHSA-II两种dsRNA 7 d后,稻纵卷叶螟的死亡率分别为80%和83.33%,与对照组相比,分别增加了66.67%和70%。本研究用注射法RNAi技术成功实现了对稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因的沉默,为利用该技术研究昆虫基因的功能,以及通过转基因RNAi技术防治稻纵卷叶螟奠定了基础。     

RNA干扰技术在农作物害虫防治中的应用

RNA干扰(RNAi)技术作为基因沉默的工具,已被广泛应用于农作物害虫防治研究。准确选择靶基因、将dsRNA或siRNA导入昆虫体内、siRNA在昆虫体内的扩增和扩散是RNAi技术应用于农作物害虫防治的基础。应用RNAi技术能有效地保护农作物抵抗害虫危害,在农作物遗传改良进行精准抗虫方面具有重大的应用前景。     

RNA干扰技术在防治农业害虫中的应用研究进展

RNA干扰(RNA interference,缩写为RNAi)是一种分子生物学上由双链RNA(dsRNA)诱发的基因沉默现象,该技术为农业害虫的防治开辟了一条新途径。从dsRNA导入方式、靶标基因选择、使用剂量及昆虫不同生长发育阶段4个方面阐述了其对RNAi技术的影响,介绍了国内外RNAi技术在农业生产中的应用情况,并探讨了昆虫RNAi的信号系统传递机制以及今后的研究方向。     

RNAi技术在植物遗传育种中的应用

RNAi技术（RNAinterference）即RNA干扰技术．是由一个双链RNA（dsRNA）来代替传统的反义核酸进行转录而产生的基因沉默现象。其特异性强、稳定性高、高效快捷,已在生物学研究领域得到广泛而有效地应用。本文主要介绍RNAi的作用机理以及RNAi技术在植物育种中的应用现状和前景。     

dsRNA引发的基因沉默

双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)导入细胞后引起细胞内特定的信使核糖核酸(messenger RNA，mRNAs)降解，从而导致基因沉默，并使生物体产生相应的功能缺陷型，这种由dsRNA介导的基因沉默称为RNA干涉(RNAi)，RNAi普遍存在于植物、动物、真菌中，它的发现改变了人们对细胞如何保护其基因组的理解，并发展了研究基因功能的新战略．对RNAi的发现历史、作用特点、作用机制以及应用前景进行了简述．     

RNAi及其在害虫防治中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种由非编码的小分子双链RNA引发的序列特异性转录后基因沉默现象,普遍存在于线虫、真菌、昆虫和动植物等多种生物中。近年来,RNAi技术在昆虫中的成功应用为一系列新颖的、环境友好的害虫防治策略提供了理论依据。文章综述了RNAi技术的作用机制、dsRNA吸收机制及在害虫防治等领域的研究成果,并展望了该技术的应用前景。     

RNAi生物农药在作物保护上的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是现代农作物病虫害防治中的一项具有前景的生物技术,其专一性、高效性、环境友好等特点使其成为能够替代传统依赖化石能源农药的可行性方案,也是现代农业绿色生产中重要的生物技术之一.根据双链RNA(dsRNA)的合成和递送方式的不同,可以将RNAi技术在农业上的应用形...     

RNA干扰技术及其应用研究进展

RNA干扰技术(RNAinterference,简称RNAi)是指将双链RNA(即dsRNA)导入生物或细胞内,引起与其同源的mRNA特异性降解,因而抑制其相应基因表达的过程。它具有高效、快捷、特异性强等特点。目前,它的作用机制已基本清楚,有广阔的应用前景。本文从RNAi的发现、分子机制、作用特点和RNAi技术的应用等方面进行了综述。     

siRNA和miRNA的研究进展

RNAi(RNA interference)即RNA干涉,是由外源或内源性的双链RNA(double starand RNA,dsRNA)导入细胞而引起的与dsRNA同源的mRNA降解,进而抑制相应基因表达,可以抑制诸多真核基因的表达s。iRNA(small interferance RNA,siRNA)即小干扰性RNA,是RNA干扰的引发物,不同的siRNA可以引导不同水平的RNAi。非编码RNA中的微小RNA(micro RNA,miRNA),能够识别特定的目标mRNA,通过与mRNAs3’非翻译区结合,影响蛋白翻译水平。miRNA和siRNA在生成机制、作用途径等方面关系密切,既区别又相互联系,小分子RNA的研究将是今后分子生物学的研究热点之一。     

RNAi在昆虫基因功能研究中的应用进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由小分子dsRNA引起目的基因mRNA序列特异性降解,导致靶标基因沉默或表达量下调的现象。RNAi在昆虫重要生理酶相关基因功能的研究中起着至关重要的作用。本文主要对RNAi不同方法的应用、各方法的优缺点及影响RNAi效率的因素进行了综述,总结了RNAi不同方法对昆虫功能基因沉默效果的差异,及在昆虫基因功能研究中的应用进展。     

RNA干扰机制及其主要蛋白因子研究进展

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是由双链RNA(double stranded RNA, dsRNA)分子介导的、在mRNA水平上关闭相应序列基因表达、使其沉默的过程。RNAi作为一种古老而保守的基因沉默机制,广泛存在于真核生物体内,在细胞的发育调控、抗病毒防御、修复遗传损伤、调节正常的基因等生命过程中起着重要的作用。RNAi机制可以分为3个阶段：启动阶段、效应阶段及扩增阶段。RNAi干扰相关的主要蛋白因子有Dicer酶、Argonaute(AGO) 蛋白家族和RNA依赖的RNA聚合酶(RNA\|dependent RNA polymerase, RdRP)。文章对RNAi机制及其相关主要蛋白因子进行简要综述。