热激条件下家蚕血液30K蛋白磷酸化研究

本试验旨在研究热激条件下家蚕血液磷酸化蛋白的表达变化,为深入研究其功能提供参考。试验设对照组和热激组,每组选取五龄第3天家蚕幼虫各30头(雌雄各占1/2),在40℃条件下分别热激处理0、10 min,然后利用双向电泳、Pro-Q Diamond染色、质谱技术对表达差异的磷酸化蛋白进行研究。结果表明:1)银染图谱30 ku区积累了大量蛋白,经Pro-Q Diamond染色后发现它们属于磷酸化蛋白。2)经过多次取样和质谱鉴定,最终获得了3个30K蛋白,分别是PBMHPC-6、PBMHPC-19和PBMHPC-12。3)热激处理10 min后,3个30K蛋白的表达量与热激处理0 min相比显著上调(P0.05)。由此得出,五龄家蚕血液富含30K蛋白,它们不仅在脂质运输方面承担着重要的角色,而且很可能参与热激应答。     

家蚕钙网蛋白的基因结构与初步表达谱研究

钙网蛋白(calreticulin,CRT)是内质网/肌浆网主要的Ca2+结合蛋白,在细胞功能的调节方面发挥重要作用。利用双向电泳技术及质谱技术研究家蚕脂肪体蛋白组的变化,通过分析检索蛋白质组数据,获得了钙结合蛋白的氨基酸序列。通过电子克隆、cDNA3′末端快速扩增(3′rapid amplification of cDNA ends,3′RACE)方法克隆了家蚕钙网蛋白基因cDNA全长序列,命名为BmCRT(GenBank登录号:FJ360528)。BmCRT基因cDNA全长1 705 bp,开放阅读框序列(ORF)长1 197 bp,编码398个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BmCRT与其它物种的CRT都具有保守的N-结构域、脯氨酸富集结构域和C-端结构域。BmCRT基因组结构分析表明:该基因由7个外显子和6个内含子组成。分析BmCRTmRNA在不同发育时期的表达变化显示,该基因在家蚕幼虫眠期的mRNA表达量比食桑期高,而在4龄和5龄食桑期mRNA表达量没有随着生长变化而变化。     

家蚕普通气味结合蛋白基因的表达及分子进化研究

昆虫的普通气味结合蛋白(general odorant binding protein,GOBP)是气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)家族中的重要成员,与昆虫感受低特异性气味分子刺激相关,在觅食、求偶等生理行为过程中发挥重要的作用。基于家蚕5龄第3天幼虫的基因芯片和蛹期、成虫期的RT-PCR表达谱分析发现,家蚕的GOBP1蛋白基因(gobp1)主要在幼虫的头部及蛹和成虫的触角中表达,在幼虫的睾丸以及成虫的胸足、体壁、脂肪体等非感受器官中也有表达,而GOBP2蛋白基因(gobp2)的表达谱和gobp1相比明显较窄。该结果表明家蚕gobp1以感受气味分子刺激的功能为主,同时还可能具有其他尚未被发现的生理功能;而家蚕gobp2可能具有对气味感受更高、更专一的功能特点。对家蚕及其他12种鳞翅目昆虫的GOBP蛋白序列比对发现,各物种间的GOBP蛋白序列相似性很高,蛋白二级结构元件也高度相似,具有的昆虫OBP典型结构中的半胱氨酸(C)位点非常保守。基于非同义突变与同义突变比值(Ka/Ks)的分子进化分析显示,13种鳞翅目昆虫的GOBP蛋白基因仅有棉铃虫gobp1在分化中受到正向选择作用,揭示不同昆虫的GOBP蛋白基因可能具有相似的生理功能。     

家蚕Osiris基因家族成员的系统进化与组织表达芯片分析

昆虫特有基因对于维持昆虫特有的形态、行为及生活习性起关键作用,同时也是防治有害昆虫的靶标基因。基于家蚕基因组数据,对昆虫特有基因Osiris(Osi)家族进行了分析。通过同源比对,发现家蚕的Osi家族含有22个成员,其中21个基因串联分布在26号染色体,1个基因位于4号染色体。共线性分析发现,家蚕与黑腹果蝇有18个Osi基因表现为共线性关系。系统进化分析表明Osi基因家族是在昆虫物种分化前已形成的多基因家族,家蚕与果蝇的Osi家族亲缘关系相对较近。家蚕的4个Osi基因(BmOsi9-1、BmOsi9-3、BmOsi9-4和BmOsi9-5)聚成一个进化枝,且在基因组上呈串联分布,暗示其是在物种分化后通过基因复制产生的,属特有基因。结构域分析发现,家蚕Osi蛋白均含有一个功能未知的结构域DUF1676,是Osi基因家族的典型特征。组织芯片分析表明,BmOsi20和BmOsi17分别在家蚕5龄幼虫的中肠和精巢中特异性高量表达,BmO-si18和BmOsi9-1分别在马氏管和丝腺中特异表达。     

家蚕糖转运蛋白基因BmST3的克隆及序列分析与表达研究

糖转运蛋白在家蚕体内糖类化合物的转运与代谢过程中发挥重要作用。在电子克隆的基础上,通过RT-PCR方法克隆了家蚕糖转运蛋白基因BmST3(GenBank登录号:GQ871756)。生物信息学分析结果显示,该基因位于家蚕27号染色体,开放阅读框(ORF)长1434bp,编码477个氨基酸,预测蛋白有典型的Sugar_tr结构域和12个疏水的跨膜结构域,与埃及伊蚊、致倦库蚊、冈比亚按蚊、赤拟谷盗登录号分别为EAT47626、EDS35465、EAA11457、EFA05337的同源蛋白相似性均在60%以上。RT-PCR检测和基因芯片信号值分析结果显示,BmST3基因的表达具有组织特异性,在家蚕5龄第3天幼虫的9种组织中,主要在马氏管中大量表达,推测其可能在马氏管细胞膜内外物质的跨膜转运中发挥作用。     

野桑蚕NPV与家蚕NPV的外形差异及多角体蛋白基因的研究

通过电子显微镜观察 ,发现从野桑蚕体内分离的核型多角体病毒 (BmmNPV)经空斑筛选 ,其分离株的多角体外形和家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)的多角体外形呈现差异。对PCR扩增出的BmmNPV的多角体蛋白基因polh进行克隆、测序 ,并与BmNPV的polh序列比较 ,结果发现BmmNPV的polh在 +2 2、+70 3和 +711的 3个位点的碱基不同 ,使 +7位、+2 99位的Pro变成了Ser,+711位G变成为A ,而没有引起该位点 +2 31位Ala的改变。由Ser和Pro在形成蛋白二级结构的构象常数可以推测 ,BmmNPV的多角体较BmNPV更稳定 ,查明了多角体在外形存在差异的原因是ORF内碱基的差异引起的。