植物基因克隆的策略和方法

植物基因克隆是当前植物学研究的前沿和热点。经过近20年的发展，已经形成了一些克隆植物基因的方法，主要有功能克隆，PCR扩增，转座子或T－DNA标签，定位克隆，判别杂交和减法杂交，mRNA差异显示和人工合成克隆。本文对这些技术的工作原理，各自的优缺点及它们在植物基因克隆方面的应用现状和前景作一综述。     

植物病原微生物的分子检测与抗病基因克隆的研究

近年来，随着分子生物学技术的发展和分子标记技术在植物病原微生物分子检测和抗基因克隆方面广泛应用，PCR、RAPD、RFLP等技术已成功地对许多病原微生物进行分子检测和无毒基因及抗病基因的克隆。     

植物基因克隆方法在作物上的应用

本文在参考大量文献的基础上，综述了包括功能克隆、定位克隆、表型克隆、PCR扩增以及DNA芯片技术等植物基因克隆的方法及其在作物上的应用，并对各种方法的应用进行了比较，展望了它们的应用发展前景。     

棕榈科植物基因克隆方法的优化

【目的】优化棕榈科植物基因克隆方法,为其基因组学研究和分子育种奠定基础。【方法】通过优化DNA提取和目的片段回收步骤,检测其对提取DNA质量和纯度、目的片段回收率与阳性克隆等的影响。【结果】DNA提取方法优化后,提取获得的DNA完整性好,无杂质、无弥散现象,质量较好,其OD260/OD280在1.88-1.93;优化前不同样品提取的DNA仅为40.0-60.0 ng/μL,优化后样品DNA在104.5-214.8 ng/μL,为优化前的2-3倍;目的片段回收方法经优化后,可以从扩增的PCR产物中回收获得条带较清晰的目的片段,其胶回收率较高;对回收的目的片段进行亚克隆,以gyspy74引物鉴定阳性克隆,每个样品的菌落均在700 bp左右扩增获得清晰的目的条带,且其中3个菌落的目的条带测序结果与预期核酸序列一致。【结论】优化后的方法适用于棕榈科植物基因克隆。     

植物转座子在基因克隆中的应用

本文系统介绍了目前中转座子的种类,结构特征和在基因转化,基因克隆等方面的应用新进展,同时也详细介绍了类copia逆转座子在水稻上的应用研究。     

针茅属植物基因组DNA提取方法的研究

植物体内所含的蛋白质，酚类，单宁，色素及多糖等物质影响Tag酶的聚合效率。是使PCR扩增反应失败的主要因素。本研究以针茅属植物为材料，对CTAB法，SDS法，简易提取法和高盐沉淀法提取的针茅DNA进行了比较研究。结果表明：CTAB法适合于针茅属植物基因组DNA的提取，采用这种方法提取的DNA能很好的用于PCR扩增。     

高等植物基因克隆的策略

基因克隆是进行植物基因功能研究的先决条件。随着拟南芥、水稻、杨树等植物全基因组序列的公布,标志着基因组进入后基因组研究时代是分子生物学发展的必然趋势,同时为进一步克隆植物中控制重要性状的主效基因提供强大的基因组数据支撑。目前有较多的基因克隆传统及衍生技术,文章综述了图位克隆、同源克隆、转座子标记法、表达序列标签法、差异表达基因克隆等5种应用比较广泛的基因克隆技术,并就其发展方向和策略作了展望。     

植物新基因克隆策略和技术进展

对基于表达序列标签(EST)的基因克隆、基于同源序列的候选基因法、基因图位克隆、基因转座子标签技术和差异表达基因分离技术等植物新基因克隆策略和技术进行了总结,并对其优缺点进行了简要介绍。     

葡萄扇叶病毒外蛋白基因克隆和植物表达载体的构建

用RT－PCR法从葡萄扇叶病毒杭州分离物（GFLV－H）基因组RNA中扩增了该病毒分离物的外壳蛋白基因cDNA片段，并克隆到质粒pGEM-T-easy Vector。序列分析结果表明，该基因含有1515个核苷酸，编码504个氨基酸，其核苷酸和推导的氨基酸与GFLV法国分离物F13的同源性分别为88％和95％。目前该基因已成功地克隆到植物表达载体pBI121，经三亲交配导入到根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404中。     

结构域Tt APuX21基因的分离与克隆研究

以热产硫化氢高温厌氧杆茵茵液为模板,根据Gene Bank中登记的编码结构域Tt APuX21基因序列设计1对特异引物,利用多聚酶链反应技术,扩增出目的基因Tt apux21,并克隆到表达栽体pET21a( )中.经茵液PCR筛选和DNA测序鉴定.表达栽体pET21a( )中插入有序列正确的Tt apux21基因,重组质粒命名为pEX21.     

三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因克隆及植物表达载体的构建

通过RT PCR技术从盐生植物三角叶滨藜总RNA中,扩增并克隆了BADH68基因。该基因全序列显示,核苷酸序列长1520bp,12～1515bp为1个开放阅读框架,推测的氨基酸序列全长为500个氨基酸残基,其核苷酸序列与菠菜和山菠菜同源性分别为89%和95%。利用BamHI和SacI酶切位点将BADH68基因连接到pCAMBI A2301的多克隆位点,并把35S启动子和nos终止子分别连接到BADH基因的上游和下游的多克隆位点上,获重组植物表达质粒pCAMATBADH682,并转入根癌农杆菌LBA4404中,获LBA4404(pCBAMATBADH682)菌种。     

木薯MeGWD3基因克隆及植物表达载体构建

[目的]克隆木薯葡聚糖水合双激酶(MeGWD3)基因并构建其植物表达载体,为开展木薯MeGWD3基因调控及功能研究提供参考.[方法]采用RT-PCR从木薯华南124(SC124)中克隆MeGWD3基因,对其进行序列分析,并将其连接至改造的pCAMBIA2300载体,构建植物表达载体pCAMBIA2300-MeGWD3.[结果]MeGWD3基因全长3522 bp,编码1173个氨基酸.经序列比对,发现MeGWD3基因序列与木薯Phytozome数据库中公布的GWD基因(cassava4.1_000497m)只存在2个碱基差异,同源性高达99.94%;与NCBI数据库中收录的木薯GWD基因(JN618460)同源性高达99.00%,与蓖麻GWD基因(XM 002518566)同源性达86.00%;成功构建植物表达载体pCAMBIA2300-MeGWD3.[结论]成功构建的植物表达载体pCAMBIA2300可用于MeGWD3基因功能及木薯淀粉代谢研究.     

菊花CmAP1基因克隆及其植物表达载体构建

[目的]克隆菊花CmAPETALA1基因(CmAP1)并构建植物表达载体,为该基因功能的遗传改良打下研究基础.[方法]采用同源克隆及RT-PCR从菊花叶片中克隆CmAP1基因,运用在线生物信息学分析工具对其核苷酸及氨基酸序列进行分析,利用实时荧光定量PCR对该基因的组织表达差异进行分析,并用双酶切法将目的基因与pCAMBIA1300载体连接,构建植物表达载体.[结果]克隆获得的CmAP1基因(GenBank登录号KU872999)编码区开放阅读框(ORF)长741 bp,编码246个氨基酸;CmAP1蛋白属亲水性蛋白,分子质量约28.3 kD、理论等电点(pI)为8.76,预测该蛋白内含10个磷酸化位点和2个潜在的N-糖基化位点;蛋白氨基酸序列比对和系统发育进化分析结果表明,CmAP1蛋白与CDM111蛋白的同源性达98%,属MADS-box基因家族A类基因的euAP1分支;实时荧光定量PCR分析结果表明,CmAP1基因在花蕾中表达量极高,在舌状花和筒状花中表达量较低,而在营养器官中仅痕量表达.将CmAP1基因连接到pCAMBIA1300载体上,可成功构建植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1.[结论]CmAP1基因在花的发育及形成过程中发挥重要作用,成功构建获得的植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1可为后期利用基因工程手段改变菊花花形态结构、调控花期及遗传改良打下基础.     

中国葡萄属植物野生种抗白粉病基因克隆研究国际领先

由西北农林科技大学博士生导师王跃进教授主持完成的国家转基因植物研究与产业化开发专项“中国葡萄属植物野生种抗白粉病基因克隆”研究项目，经过6年的探索研究，2006年12月30日在陕西杨凌通过教育部组织的科技成果鉴定。     

拟南芥CBF3基因克隆和植物表达载体的构建

[目的]克隆拟南芥CBF3基因并构建植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3。[方法]从模式植物拟南芥中克隆分离出转录因子CBF3与逆境诱导型启动子Rd29A的DNA序列,构建植物表达载体。[结果]克隆得到的CBF3与GenBank数据库所公布序列比对发现,同源性达到100%,全长为750bp;克隆克隆得到的Rd29A与GenBank数据库公布序列比对发现,同源性达到100%,全长为1425bp。[结论]以双元载体pCAMBIA1301为基础,植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3被成功构建,对提高植物耐盐、耐旱和耐寒性有很大帮助。     

基因克隆技术

综述了基因克隆常用技术包括图位克隆法、转座子或T－DNA标签法、同源序列法、表达序列标签（EST）法和差异表达基因分离方法的原理、应用、应用的潜力和限制因素。     

基因克隆研究方法综述

基因克隆诞生至今将近40a里,获得了快速发展,各种克隆方法应运而生,并且每一种方法都在不断发展和完善,满足了不同研究的需要。该文就基因克隆研究方法作一简要概述。