转基因抗虫白菜对菜青虫、小菜蛾抗性的研究

对导入马铃薯蛋白酶抑制剂基因（pinⅡ）的大白菜和菜心植株当代和自交后代进行了菜青虫（Pieris rapae L．）和小菜蛾（Plutella xylostella L．）的抗性筛选。室内生物测定表明：取食转基因植株的1,2龄幼虫死亡率显著高于对照;取食转基因T1大白菜的菜青虫生长发育受到明显抑制,转化株老叶对菜青虫幼虫的毒杀作用明显高于嫩叶;取食转基因T2大白菜和菜心不同转化株的小菜蛾生长发育受到不同程度的抑制,转基因大白菜比菜心对小菜蛾有更好的抗虫效果,取食转基因菜心2—24植株小菜蛾的幼虫死亡率最高达64％,取食转基因大白菜2-6小菜蛾幼虫死亡率最高达90％;取食转基因植株小菜蛾的化蛹率、蛹重和羽化率亦有不同程度的降低。     

多重PCR检测多价转基因甘蔗

甘蔗(Saccharum officinarum)是制造蔗糖、提炼乙醇的主要原料。随着甘蔗转基因育种的开展,建立一套快速精准转基因分子检测技术在甘蔗转基因研究中有重要的应用前景。本研究以二价抗虫转基因甘蔗为材料,利用多重PCR建立同时检测Bar基因、Bt基因和马铃薯蛋白酶抑制剂基因(PinⅡ基因)。研究表明,该多重PCR检测体系的最佳退火温度为53℃,有效扩增Bar基因(415 bp)、Bt基因(780 bp)和PinⅡ(1 000 bp)3个基因片段。多重PCR技术进行外源基因的检测,节省时间、降低成本、提高效率并可以对该转化植物进行特异性鉴定。     

播娘蒿蛋白酶抑制剂基因DsTI2转化油菜的研究

通过播娘蒿角果的cDNA文库克隆测序,得到1个蛋白酶抑制剂基因序列,命名为DsTI2.该基因编码一个含有100个氨基酸残基肽链,含有保守活性位点环"CAPRIFPSFC".利用农杆菌介导,将DsTI2导入甘蓝型油菜品系NJ5424中.PCR和RT-PCR检测证明外源基因已导入到油菜基因组中,且能正常表达.酶活性分析表明,转基因油菜叶片蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制活性明显高于对照.初步抗虫实验表明,喂食转基因油菜叶片的菜青虫幼虫生长缓慢、死亡率升高.     

转Bt+Sck基因双价抗虫棉的抗虫性及遗传分析

对通过花粉管通道注射获得的转Bt Sck双价基因抗虫棉纯系312-5T2和332-2T2进行了生物抗虫性测定,转基因纯系对棉铃虫的抗性显著高于非抗虫对照苏棉16和抗虫对照品种sGK321,与抗虫对照R19抗虫性相当.遗传分析表明,转Bt Sck双价基因抗虫棉的抗性基因符合一对显性基因的分离规律.对转Bt Sck双价基因抗虫棉与R19及sGK321的杂交F1进行了抗虫性测定,所有的F1植株都表现出与转Bt Sck基因纯系亲本一致的抗虫性.转Bt Sck双价基因抗虫棉纯系312-5T2和332-2T2等位性测验证明:312-5T2与R19、sGK321的抗虫基因整合位点不连锁,表现为15∶1的自由组合比例;而332-2T2与R19中抗虫基因的整合位点表现连锁,与sGK321的抗虫基因表现自由组合.这为培育新的双价抗虫棉品种(系)提供了优良的育种材料.     

外源基因在苹果转基因植株的稳定性研究

以继代培养13年的转豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因和新霉素磷酸转移酶(nptⅡ)基因苹果嘎拉、王林、乔纳金和富士组培苗及田间定植6～8年的转基因植株为试材,应用卡那霉素筛选和PCR扩增分析对外源基因的稳定性进行研究。结果表明,在57个苹果转基因株系组培苗中均可检测出CpTI特异基因片断;转化株系在添加50mg/L卡那霉素的培养基中生长正常。田间株系PCR检测结果表明,转入的外源CpTI基因在所测株系的叶片、花粉及大部分根系中稳定存在,有极少数株系的根系中未检测到特异表达条带。结果说明外源基因可以在转基因植株中稳定存在,但在不定根发生过程中有可能会丢失。     

转基因抗虫保铃棉(Bollgard(R))检测方法研究

运用常规PCR方法和实时荧光PCR方法对转基因抗虫保铃棉外源基因CaMV 35S启动子、NOS终止子、标记基因NPTⅡ和目的基因CryIA(c)进行了检测。建立了快速、准确的抗虫保铃棉籽转基因成分的PCR检测方法。     

豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)抗虫转基因新疆杨的获得

利用根癌农杆菌介导法将广谱抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入新疆杨(Populus a1-ba var．pyramidalis)，经筛选获得了大量转基因植株。对转基因植株经PCR鉴定、PCR-Southern和点杂交分子检测结果证实CpTI基因已整合进杨树基因组中。部分转基因植株的饲虫实验表明，饲喂转基因杨树叶片可明显抑制杨尺蠖幼虫生长发育。     

转sbk和sck抗虫基因水稻的获得

转入多个抗虫基因是解决水稻抗虫的一条有效途径.本研究采用根癌农杆菌介导法将2个抗虫基因(sbk和sck)同时转入3个水稻品种中,通过一系列的分子检测(PCR和RT-PCR)分析,这2个基因已经成功转入3个水稻品种中并得到了表达;同时还获得1株不含抗生素筛选标记基因(hpt)和抗虫sbk基因,却含抗虫sck基因的转基因植株,命名为YJ27-5sck.用该植株作为供体,通过杂交将sck抗虫基因转育到另外5个水稻品种中且同样得到了表达,获得了不含筛选标记基因的转sck基因阳性植株.     

河北毛白杨巯基蛋白酶抑制剂基因cDNA的克隆及序列分析

植物巯基蛋白酶抑制剂(cysteine proteinase inhibitor,CPI)在林木的抗虫基因工程中发挥着越来越重要的作用,分离和克隆植物CPI基因进而研究该基因的功能是CPI基因工程研究的热点.本文应用PCR技术从我国乡土抗天牛树种河北毛白杨形成层中分离和克隆到了一个710bp大小的cDNA片段,同时对序列进行测定和分析.测序和分析结果表明,该cDNA片段含有一个429 bp的完整开放阅读框,其编码143个氨基酸残基,具有LARFAVDEHN、QXVXG和YEAKVWVKPW三个典型的植物巯基蛋白酶抑制剂基因家族的高保守区段,同时在GenBank中进行了注册,核苷酸注册号为DQ020096,氨基酸注册号为AAY41807.氨基酸序列同源性分析表明,该基因与其他林木中的巯基蛋白酶抑制剂的同源性差异较大,同源性在48%～97%之间,其中与欧洲山杨的同源性最高,达到97%,与猕猴桃的同源性最低为48%.说明河北毛白杨形成层中存在CPI基因并能够有效表达,这为进一步研究该基因的抗虫功能奠定了良好的基础.     

大白菜-结球甘蓝易位系外源染色体区段基因标记的开发与应用

为了利用基因标记对大白菜-结球甘蓝易位系进行鉴定,针对大白菜和结球甘蓝共线性基因序列差异位点设计引物,以大白菜85-1和结球甘蓝11-1为试材,进行了多态性标记的筛选,并在大白菜-结球甘蓝易位系、易位系自交后代及大白菜和结球甘蓝不同商品种间进行了可利用性鉴定。结果表明,根据大白菜和结球甘蓝263个共线性基因共设计特异引物171对,66对引物在大白菜和结球甘蓝间表现出多态性扩增,所占比例为38.60%。66个基因标记中,基于大白菜基因序列获得的2个和基于结球甘蓝基因序列获得的48个,可作为结球甘蓝相对大白菜特异的基因标记,并成功用于大白菜-结球甘蓝易位系AT1-41和AT1-47及AT1-47自交后代的鉴定。进一步利用这66个基因标记在4个大白菜和4个结球甘蓝商品种中进行了PCR扩增,有52个标记能将供试的大白菜品种和结球甘蓝品种完全鉴定出来,有11个标记在部分品种中表现出多态性。结果为深入研究大白菜-结球甘蓝易位系外源基因的表达、调控、互作和标记辅助育种奠定了基础。     

转基因抗虫保铃棉(Bollgard~ひ)检测方法研究

运用常规 PCR方法和实时荧光 PCR方法对转基因抗虫保铃棉外源基因 Ca MV 35 S启动子、NOS终止子、标记基因NPT II和目的基因 Cry IA(c)进行了检测。建立了快速、准确的抗虫保铃棉籽转基因成分的 PCR检测方法。     

CryIA(a)-pta双价抗虫基因转化粳稻及二化螟抗性评估

向作物中转多价抗虫基因是增强作物抗虫性、拓宽抗虫谱、延长抗虫时限的有效措施。从粳稻品种吉粳81、吉粳88和通887的成熟胚诱导出愈伤组织,以愈伤组织作为转化的受体,利用农杆菌介导法,转化苏云金杆菌毒蛋白基因CryIA(a)和半夏凝集素(Pinelliaternataagglutinin,PTA)基因。表达双价抗虫基因的载体p3300-bt-pta的bt和pta分别由Ubiquitin启动子和CaMV35S启动子驱动,宿主菌株为EHA105。用除草剂草丁膦(PPT)筛选得到转基因植株25株。以bt基因和pta基因两端序列为引物在一个反应体系同时做2个基因的PCR检测,检测到bt、pta基因的2条带,Bar基因的PCR检测也显阳性。转化株对PPT除草剂抗性鉴定呈抗性,证明外源基因已整合到水稻基因组中。水稻二化螟接虫鉴定结果表明,23株转基因植株抗虫性比对照明显提高,2株表现感虫。     

转基因棉花抗虫基因的分子辅助选择

为提高棉花新品种选育过程中外源抗虫基因选择的准确性,以常规非转基因抗虫棉花品种、单价转基因抗虫棉品种、双价转基因抗虫棉品种为试验材料,选择能扩增Bt基因通用引物和棉花内源基因SAD1的引物,建立了抗虫基因的PCR检测方法。利用该方法对常规非转基因抗虫棉品系和转基因棉花品系进行了检测。结果表明,该方法可明确区分常规非转基因抗虫棉品系和转基因棉花品系;对高代育种品系进行检测表明40%转基因品系中存在单株不能扩增出预期的特异片段,而在非转基因系冈197中存在8.0%的单株扩增出预期的特异片段。该方法可应用于棉花新品种选育过程中对外源抗虫基因的检测,提高了选择的准确性和目的性。     

卡那霉素浸种筛选转基因棉花的初步研究

转基因技术已经被广泛应用于作物的抗虫、抗病及高品质等的改良育种 ,而且转基因植株的鉴定方法也有多种 ,其中带有NPTⅡ标记基因的转基因后代材料的大田筛选 ,主要是在苗期 ,利用卡那霉素溶液 (Kanamycin)点涂植株幼叶 ,以幼叶的变黄与否来确定。为防止漏点漏涂 ,出现假阳性植株 ,须在花铃期以前对材料点涂 2～ 3次 ,因此从大量的转基因材料中筛选转基因植株 ,工作量相当大。本研究的目的是试图筛选出适当的卡那霉素浓度 ,通过浸种以快速地鉴定出转基因植株。1　材料和方法1.1　供试材料转基因抗虫棉新棉 33B、非抗虫棉豫棉 11号和转基因…     

转betA基因的小黑杨花粉植株耐盐性分析

甘氨酸甜菜碱是植物细胞内一种重要的调渗物质,盐胁迫下,甘氨酸甜菜碱的积累可以保护细胞内蛋白质的结构和功能,降低细胞水势,从而增强植物自身的耐盐能力。从大肠杆菌中克隆的胆碱脱氢酶基因(betA)是甘氨酸甜菜碱合成的关键酶基因,该基因编码的胆碱脱氢酶(CDH)可将胆碱一步合成为甜菜碱。本实验室已将胆碱脱氢酶基因(betA)转入到小黑杨花粉植株基因组中,并最终获得了4个转基因株系。本研究以4个转betA基因株系(TB1、TB2、TB3、TB4)及非转基因对照为试材,在浓度为1.2%的NaCl盐胁迫下,测定其甜菜碱含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性和丙二醛(MDA)含量,并调查试材的盐害情况,计算盐害指数,目的是为了研究转基因株系的耐盐效果,从中筛选出耐盐能力较强的转基因株系。试验结果表明,4个转基因株系的甜菜碱含量均高于非转基因对照;在1.2%NaCl胁迫下TB1、TB2、TB4的超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性均高于非转基因对照,TB3低于对照;TB1、TB4的丙二醛含量低于对照,TB2、TB3与对照相近。进一步的盐害分析表明4个转基因株系中的TB1和TB4株系的盐害指数低于对照的42.1%和33.4%,TB2、TB3与对照无显著差异。综合各转基因株系的耐盐性及生理指标测定结果,4个转基因株系中,TB1、TB2的耐盐性明显优于对照,有希望用于盐碱地造林及推广。     

大白菜干烧心病抗性QTL定位研究

对大白菜干烧心病抗性不同的材料进行研究,明确其抗性遗传规律,并完成抗性基因的QTL定位分析,为分子标记辅助选择(MAS)育种与抗病机理的研究提供理论依据。采用大白菜干烧心病抗性显著不同的青麻叶类型高代自交系黑227(抗干烧心病)和包头型高代自交系B120(感干烧心病)作为材料,将得到的杂种F1进行小孢子培养得到DH群体,将亲本和F1及DH群体种植于日光温室,根据田间干烧心病发病程度进行分级,进而得出病情指数,并结合已构建的大白菜分子遗传图谱,利用Map QTL 5.0软件对大白菜干烧心病抗性基因进行定位。结果表明,试材所含有的大白菜干烧心病抗性基因符合数量性状遗传的特点,共检测到2个与大白菜干烧心病抗性基因连锁的InDel分子标记Br ID10343和Br ID10349,这2个标记均位于Chr.7,其间的遗传距离为1.031 c M,遗传贡献率均达到40%以上。InDel分子标记Br ID10343和Br ID10349与大白菜干烧心病抗性基因紧密连锁,结果为抗性基因主效QTL的精细定位及MAS抗病育种奠定了良好基础。     

豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因在转基因水稻中的表达特性研究

以豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)转基因水稻自交品系和其衍生的花培品系为实验材料，通过PCR扩增和CpTI表达蛋白活性的测定，研究了CpTI基因的遗传稳定性和表达特性。结果表明CpTI基因在转基因自交后代可以稳定遗传，而在部分花培品系中发生丢失。同时CpTI基因的表达表现出一定的时空特性，同一转基因品系中叶片CpTI蛋白的表达活性通常高于茎杆，而不同发育时期的CpTI蛋白的表达活性以分蘖期最高。除花培品系DH401外，转基因品系叶片和茎杆的蛋白酶抑制剂的活性随着水稻的生长发育呈下降的趋势。     

3种转非抗虫基因棉花田间节肢动物群落的多样性和食物网结构

以转基因耐盐碱棉花、转基因抗病棉花和转基因抗旱棉花3种转非抗虫基因棉花为材料,研究不同表达性状的转基因棉花种植对棉田节肢动物群落结构、多样性及食物网结构的影响。结果表明,3种转基因棉花在节肢动物群落Shannon-Wiener多样性指数、Pielou均匀度和优势集中性指数上与其对照受体棉花无显著差异(P0.05)。转基因棉花与其对应受体间的群落相似性指数均较高(73.18%~77.65%),食物网结构参数上也无显著性差异(P0.05)。表明3种转非抗虫基因棉花对棉田节肢动物多样性及食物网结构无显著影响。     

不同大白菜材料对根肿菌生理小种的抗性反应及抗病位点检测

为了明确主栽的大白菜以及大白菜育种材料与根肿菌生理小种之间的抗性关系,以现有4,7,10和11号生理小种为菌源,用注射法进行接种,对25份供试大白菜材料进行抗病性鉴定,同时利用分子标记检测供试材料中所含的根肿病抗性位点。结果表明:供试大白菜中,山地王2号等8份试材对4个生理小种都表现抗病,德高CR117等7份试材对4个生理小种都表现感病,C1等4份试材对2个生理小种感病,华抗301等6份试材只对4号生理小种感病;所有试材均含有Crr1抗病位点,德高CR117等11份试材含有Crr2抗病位点,仅在京春CR3中检测到Crr3抗病位点,除德高CR铁甲1号和大地CR118外,其他试材中均检测到了CRk抗病位点,有21,16份试材中分别检测到抗病位点CRa和CRb,而CRc抗病位点仅在星光和CR75中存在。总之,不同大白菜材料对同一生理小种抗性反应不同,同一个材料对不同生理小种的抗性反应不同;所有生理小种中4号生理小种最强,其次为7号生理小种;大白菜材料抗病位点多一定抗病性强;Crr1抗病位点对材料抗性影响不大。     

抗虫棉群体NPt-Ⅱ标记基因纯度与其抗虫性强度的相关分析

研究了转基因抗虫棉标记基因纯度与生物学抗虫性的相关特性,结果显示:综合平均抗性指数与棉苗群体抗虫标记基因纯度两者呈极显著的正相关,即品种群体抗虫标记基因的纯度愈高,其生物学抗虫性愈强。通过提高转基因抗虫棉Npt Ⅱ标记基因纯度,可显著提高该品种的群体生物学抗虫性;进而通过苗床去杂保纯技术,达到跟踪保持抗虫棉群体抗虫性的目的。