禽白血病J亚群病毒特性的研究

禽白血病引起以造血细胞恶性增生为主的肿瘤,引起养禽业较大的经济损失,其致病病毒—禽白血病病毒(ALV)的J亚群是目前危害鸡群的最主要亚群。gp85决定了ALV-J的亚群特异性,其基因具有极高变异,目前尚未有应用于临床的疫苗和防制药物。本文介绍了ALV的基因组结构、ALV-J亚群的致病特点和流行特点,以及ALV-J gp85的基因变异、单克隆抗体和疫苗的研究进展,为进一步深入研究ALV-J gp85的致病机理、研究开发诊断试剂盒和有效的预防疫苗提供了参考。     

J亚群禽白血病病毒GDHX01株分离与基因序列分析

为了解胡须鸡中是否存在禽白血病病毒(ALV)感染,从广东某胡须鸡养殖场中无菌采集胡须鸡血样,采用DF-1细胞培养、ELISA抗原检测、PCR扩增等方法,成功分离鉴定出一株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为GDHX01株。测序结果显示GDHX01株病毒基因组DNA序列全长为7616 bp,gp85基因全长919 bp。通过与其他禽白血病病毒参考毒株的基因组DNA序列进行比对分析,发现GDHX01与国内外J亚群禽白血病参考毒株同源性85.3%～95.7%之间。进一步比对发现,GDHX01毒株的gp85基因序列与国内外ALV-J参考株CAUGX01的同源性最高为95.8%。结果表明,在胡须鸡群中存在J亚群禽白血病病毒的感染。     

肉种鸡群中J亚群禽白血病的危害和净化

1.病原及临床症状 J亚群禽白血病(subgroup J Avian Leukosis)是由J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup J,ALV-J)引起的一类禽类传染性肿瘤疾病,病原属于反转录病毒,与过去已经发现的ALV亚群A、B、C、D、E中的任何一种都不相同,ALV-J核衣壳的蛋白质由gag基因编码,包括主要的群特异性抗原;包膜由env基因编码;逆转录酶由pol基因编     

五华鸡J亚群白血病病毒env部分基因的和序列分析

本试验通过PCR技术获得了安徽省地方品种五华鸡禽白血病病毒J亚群(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)env部分基因序列AL V-J-env1,并将该序列与GenBank数据库中登录的8条env基因相应序列进行了比对分析.结果表明,五华鸡已经感染了J亚群禽白血病,且部分鸡个体已经发病.通过分析可见,AL V-J-env1与所比较的基因序列同源性介于94.2％～96.6％之间,说明不同毒株之间的env基因有一定变异.但与ALV J-env1同源性最高的是来自于中国ALV-J毒株的HQ425636和HM235665基因序列,且在进化树中聚集为一组,暗示它们之间亲缘关系较近,由共同的毒株进化而来.与ALV-J-env1同源性最低的是来源于马来西亚毒株的AY312965基因序列,遗传进化分析也进一步证实,两者之间亲缘关系较远.     

鸡白血病检测技术研究

1 鸡J亚群白血病病毒env基因的克隆和表达 鸡白血病病毒(ALV)env基因编码的囊膜蛋白,位于病毒表面,其与宿主细胞受体相互作用,是亚群表型的决定因素.为研究ALV-J env基因及其表达产物特点,为ALV-J的检测奠定基础,本实验室对ALV-J env基因进行了克隆和真核表达.值得注意的是,在设计env基因引物时,需将env基因前的信号引导序列包涵其内.     

J亚群禽白血病病毒四川株SCMS1的分离及其囊膜基因序列分析

为研究四川首例分离株SCMS1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J)囊膜(env)基因是否产生新的变异,本实验通过将病毒接种鸡胚成纤维细胞、RT-PCR及PCR检测技术,对包括env基因和部分3'UTR在内的片段进行PCR扩增、克隆和序列测定.结果发现该病毒gp85基因出现6个碱基的缺失,与HPRS-103原型株6995位～7242位对应的核酸序列也发生248个碱基的缺失,包括整个rTM区域.这些碱基的缺失在病毒致病性变化中可能具有潜在的意义.     

华东地区蛋鸡群中禽白血病的分子流行病学调查

为了解华东地区蛋鸡群中禽白血病的流行情况,2011年3月至2012年10月,从江苏、山东、安徽、上海等省市的蛋鸡养殖场中采集疑似禽白血病病例样品105份,经DF-1细胞分离培养、间接免疫荧光试验鉴定,从中分离禽白血病病毒(ALV)15株,继而对分离毒株gp85基因进行了序列测定和遗传进化分析。结果表明,在所获得的ALV分离株中,有A亚群ALV(ALV-A)3株,B亚群ALV(ALV-B)4株,剩余8株则均为J亚群ALV(ALV-J)。ALV-A、ALVB分离株遗传进化较为稳定,与其原型株(RAV-1、RAV-2)gp85基因核苷酸序列同源性均在98%以上,与我国近年来的地方分离株亲缘关系较远。ALV-J分离株与其原型株(HPRS-103)gp85基因核苷酸序列的同源性在92.8%~94.5%之间。8株ALV-J分离株中,只有1株与蛋鸡ALV-J分离株有较高的亲缘关系,其余均较远,反而与早期的肉鸡分离株有较高的亲缘关系,表明目前于华东地区蛋鸡群中流行的ALV-J可能来源于早期肉鸡分离株的感染。4株ALV-J分离株与我国地方品系HR土鸡的ALV-J分离株HR332J具有很高的亲缘关系,表明ALV-J的感染范围进一步扩大,对地方品系鸡也造成了很大的危害。     

东北地区J亚群禽白血病病毒的分子生物学特性分析

为了解近两年在中国东北地区出现的J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的分子生物学特性,作者从东北地区不同养禽场先后分离鉴定12株ALV-J,并对其env基因、3′UTR和3′LTR区序列进行测定和比较分析。结果显示,12株ALV-J分别位于env基因遗传进化的3个不同分支(group),其中group2和group3中毒株在env基因分别出现大片段氨基酸缺失和与其他亚群毒株重组现象;12株ALV-J在3′UTR区仍存在较大差异,具有完整E组件的ALV-J占主导地位;12株ALV-J在3′LTR区的变异主要集中于U3区,但是位于U3区的C/EBP、CArGbox、Y box、PRE box和TATA box等转录调控元件却高度保守。以上结果表明,目前中国ALV-J的基因变异仍主要集中在env基因和3′UTR区,且env基因已出现缺失或重组等新的变异趋势,并可能是ALV-J流行范围扩大、组织嗜性和致肿瘤作用明显改变的重要遗传基础。     

env基因对J亚群禽白血病病毒体外感染和复制能力的影响

为探讨env基因对J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)体外感染和复制能力的影响,本研究利用反向遗传方法构建重组病毒,将血管瘤病变型ALV-J HN06株中env元件替换至髓细胞瘤病变型ALV-J NX0101株的相应位置,成功构建了重组质粒pNX-HNenv。重组毒株能在DF-1细胞上稳定增殖,并能被JE9特异性单抗识别,证明获得了具有感染性的重组病毒NX-HNenv株。结果显示,同一亚群内env基因的替换对病毒的体外感染和复制能力无明显影响。     

禽白血病病毒贵州流行株env基因克隆与序列分析

为了解禽白血病病毒(ALV)贵州流行株的遗传变异情况及分子特征,本试验基于ALV env基因设计合成引物对禽白血病贵州临床病例进行目的基因扩增、克隆和序列分析。结果显示,从临床病例中筛选获得3份阳性样本,PCR扩增均获得大小约921 bp的目的基因片段,将其命名为:GZ-ALV-1株、GZ-ALV-2株和GZ-ALV-3株。序列分析结果显示,3株ALV贵州流行株之间核苷酸同源性在97.2%～97.6%之间,与国内外ALV-J的同源性相对较高,为93.1%～99.3%;而与A、B、C、D、E、K亚群ALV同源性仅为51.4%～53.2%。系统进化分析显示,3株ALV贵州流行株与ALV-J亚群参考株处于同一分支,表明本试验所检测的ALV毒株均为ALV-J亚群;与A、B、C、D、E、K亚群处于不同进化分支。基因变异分析显示,3株流行株37处相同核苷酸变异导致17处氨基酸发生位点变异,其中9个可变点在高变区hr1和hr2,1个可变点在低变区vr3。结果表明,3株ALV贵州流行株均为ALV-J亚群,env基因存在位点发生了变异,且可变位点位于序列高变区。本研究结果为明确贵州禽白血病流行概况及ALV的防控与净化提供基础数据。     

J亚群禽白血病Hrb-1分离株env基因克隆及gp85杆状病毒表达载体的构建

自哈尔滨某送检患病鸡群中分离出一株病毒,经RT-PCR检测、SPF鸡胚成纤维细胞增殖后,获取其前病毒DNA,采用依据原型毒株HPRS-103cDNA序列设计并合成的一对引物,PCR扩增病毒的囊膜基因,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌JM109,培养后提取质粒分别用HindⅢ,BamHI进行单酶切和双酶切鉴定,得到了阳性重组质粒pMD18-T-Hrb-1/env,对其进行Pst Ⅰ酶切,回收包含J亚群禽白血病病毒株Hrb-1 gp85基因的997bp片段,应用Bac to Bac杆状病毒表达系统,将外源片段与线性化的杆状病毒载体pFast Bac HTA进行连接,获得重组载体pFAST BacHTA/gp85,将该重组载体转化DH10Bac感受态细菌,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得了杆状病毒重组载体Bacmid/gp85,为表达gp85并建立适于国内应用的ELISA诊断方法奠定了基础.     

J 亚群禽白血病病毒gp85单抗1E3株抗原识别表位的初步分析

J 亚型禽白血病是由 J 亚群禽白血病病毒引起的一种以成髓细胞增生、免疫抑制、生长发育受阻为特点的传染性肿瘤疾病,于1988年首次发现,其病毒囊膜表面蛋白gp85决定了病毒亚群特异性.本试验将原核表达质粒pET-28a-J gp85中的gp85基因分段亚克隆至重组表达质粒pGEX-6p-1上并在大肠杆菌中成功地表达,用ALV-J Sl gp85单克隆抗体1E3株对分段表达的gp85蛋白进行初步的免疫印迹分析.结果表明:ALV-J Sl gp85单抗1E3株所识别的抗原表位位于蛋白N端的第69至112个氨基酸之间.这将为ALV-J gp85抗原决定簇所在位点及其免疫学功能的研究奠定基础.     

蛋鸡J亚群禽白血病病毒SD1009分离株的分离鉴定及全基因组序列分析

为分析我国J亚群禽白血病病毒(ALV-J)蛋鸡分离株的进化关系,本研究将山东省某鸡场采集的蛋鸡病料样品接种DF-1细胞系,利用ELISA群特异性抗原检测以及亚群特异性间接免疫荧光方法,分离鉴定得到一株ALV-J,命名为SD1009,并对其进行全基因组测序,将该序列与其他ALV-J代表性病毒株序列进行比较。结果表明:SD1009分离株的gag和pol基因相对保守,与各参考病毒株的同源性为95%～99%,env基因的同源性为91%～95%;在其5'UTR中出现了连续19 bp的插入突变,与TW-3577、SDAU09C3、JS09GY6、JS09GY3蛋鸡分离株的5'UTR基本一致,提示19 bp的插入现象可能是近年来蛋鸡ALV-J的进化趋势;此外,其3'UTR的rTM和DR区出现部分缺失现象,该缺失部分也可能与ALV-J进化相关。     

黄羽肉鸡J亚群禽白血病病毒分离鉴定与全基因组序列分析

为了解J亚群禽白血病在黄羽肉鸡中的流行状况,采用病料研磨液接种DF-1细胞、ELISA p27抗原检测、PCR扩增等方法,从广东某鸡场送检疑似禽白血病的黄羽肉鸡病料中分离鉴定出1株J亚群禽白血病病毒,命名为GDLZ0715。为进一步了解该病毒分子学特性,对其进行全基因组测序,并与其他ALV-J毒株进行比较。结果表明,GDLZ0715分离株整个基因组中gag、pol、env基因和LTR相对保守,与各参考ALV-J毒株序列同源性分别达93.5%~95.9%、96.8%~97.3%、89.6%~94.6%和90.8%~95.1%;3′UTR变异较大,与各ALV-J参考毒株序列同源性仅为80.5%~93.4%,其中rTM和E元件大量碱基缺失;进一步分析表明3′UTR中rTM区和E元件大量碱基缺失正成为我国肉鸡ALV-J毒株的变异趋势。     

五华鸡J亚群白血病病毒env部分基因的克隆和序列分析

本试验通过PCR技术获得了安徽省地方品种五华鸡禽白血病病毒J亚群(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)env部分基因序列ALV-J-env1,并将该序列与GenBank数据库中登录的8条env基因相应序列进行了比对分析。结果表明,五华鸡已经感染了J亚群禽白血病,且部分鸡个体已经发病。通过分析可见,ALV-J-env1与所比较的基因序列同源性介于94.2%~96.6%之间,说明不同毒株之间的env基因有一定变异。但与ALV-J-env1同源性最高的是来自于中国ALV-J毒株的HQ425636和HM235665基因序列,且在进化树中聚集为一组,暗示它们之间亲缘关系较近,由共同的毒株进化而来。与ALV-J-env1同源性最低的是来源于马来西亚毒株的AY312965基因序列,遗传进化分析也进一步证实,两者之间亲缘关系较远。     

Epitope mapping of a monoclonal antibody against the Gp85 of avian leukosis virus subgroup J

Avian leukosis virus subgroup J poses a great threat to the poultry industry in China. To reduce the economic losses, a quick method for detection of ALV-J antigen is required for diagnosis and identification of the congenitally transmitting hens. In this study, we report the production and evaluation of one monoclonal antibody (MAb) suitable for achieving these goals. The gp85 gene of avian leukosis virus subgroup J CAUHM01 China isolates was subcloned into the expression vectors pGEX-6p-1 and pET28a and successfully expressed in E. coli. After immunizing BALB/c mice with recombinant His-Jgp85 protein, splenic cells from immunized mice were fused with SP2/0 myeloma cells to produce hybridomas. We isolated and characterized one ALV-J gp85-specific MAb by determining its titer, affinity and IgG subclass. In addition, we performed epitope mapping and determined the epitope for the MAb 1E3 to be 81-92 aa of ALV-J gp85 protein (LPWDPQELDILG). Bioinformatics analysis and IFA studies revealed that this epitope is conserved among all ALV-J isolates and that this antibody could serve as a useful reagent for ALV-J detection and diagnosis.     

Avian leukosis virus subgroup J: a rapidly evolving group of oncogenic retroviruses.

A strain of avian leukosis virus (ALV) belonging to a new envelope subgroup J was isolated in the UK in 1988 from meat-type chickens. The disease caused by the members of this subgroup has since spread very rapidly worldwide and has become one of the major problems facing the broiler meat industry. Molecular characterisation of HPRS -103, the prototype of subgroup J, has shown that it has a structure of a typical ALV with gag, pol and env genes. However the env gene was distinct from that of other ALV s and was closely related to that of novel endogenous retroviral elements designated EAV - HP. As other regions of the genome were closely related to ALV s, it is believed that ALV-J has evolved by recombination with the env sequences of EAV - HP. ALV-J has a tropism for myeloid cells, a feature that may be associated with its ability to induce myeloid leukosis. Recent data show that ALV -J isolates evolve rapidly resulting in sequence changes within the variable regions of the env gene leading to antigenic variation. Eradication programmes established for other subgroups are proving to be effective in eradicating ALV-J from infected flocks.     

血管瘤禽白血病病毒FJ0610株的分离与鉴定

为了解禽白血病病毒在商品蛋鸡中的流行情况,试验采用病理剖检、聚合酶链式反应(PCR)以及间接免疫荧光试验(IFA)等方法对送检的疑似禽白血病病毒感染的商品蛋鸡进行了病毒分离与鉴定,并对分离株的致瘤相关基因gp85基因进行测序,与国内外各亚群禽白血病病毒进行对比。结果表明:分离、鉴定到1株J亚群血管瘤禽白血病病毒,命名为FJ0610;分离株gp85基因核苷酸序列同源性在11.5%～94.5%之间,其中与血管瘤禽白血病毒株ZH-08株同源性最高,而与E亚群毒株同源性最低;基于gp85核苷酸序列的系统进化分析表明FJ0610株的gp85序列与ZH-08株的亲缘关系最近。     

蛋鸡J亚群禽白血病病毒HLJ09MDJ-1株的分离鉴定

为了解蛋鸡中禽白血病当前流行毒株类型及其gp85基因分子特征,在临床症状和病理组织学观察的基础上,采用ELISA抗原检测、特异性PCR以及亚群特异性免疫荧光试验(IFA),证实从黑龙江省某鸡场送检蛋鸡中分离到1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为HLJ09 MDJ-1;克隆了其gp85基因,并进行了序列分析比较。结果表明,该分离株的gp85基因与国内外其他ALV-J毒株的核苷酸同源性为88.2%～98.2%。其中,HLJ09 MDJ-1与英国原型株HPRS-103的同源性最高(98.2%),与美国株ADOL-7501的同源性最低(88.2%),表明HLJ09 MDJ-1的gp85基因与HPRS-103有较近的亲缘关系。本研究从蛋鸡中分离到ALV-J毒株,为研究ALV-J宿主嗜性改变和ALV-J对蛋鸡致病机制提供了素材。     

某海兰褐鸡场祖代、父母代及商品代鸡血管瘤型ALV-J的分离与鉴定

从山东省某海兰褐鸡场祖代、父母代种鸡和商品代蛋鸡中获得疑似血管瘤型禽白血病(Avian leukosis,AL)病料.采用病理剖检、IFA、分子生物学检测,确定为J亚群禽白血病.从祖代、父母代病料中各分离到1株J亚群禽白血病病毒(J subgroup of avian leukosis virus,ALV-J),从商品代蛋鸡中分离到4株ALV-J.根据原型毒株HPRS103设计1对gp85基因引物,获得gp85基因序列.获得的gp85基因序列与各亚群参考毒株序列核苷酸同源性比对,结果显示:分离自商品代蛋鸡的Commercial03株、Commercial04株、Commercial06株和父母代分离株Parent02株位于同一分支,同源性在97.2％～97.9％,与HPRS103株同源性94.7％～95.2％;Commercial05株与祖代分离株Grandparent01株在同一分支,与HPRS103株同源性为98.3％,4株分离自商品代的ALV-J同源性为95.0％～99.9％.表明商品代蛋鸡中的ALV-J可能来自父母代或祖代种鸡的垂直传播,也可能来自于其他来源的水平传播.从同一鸡场祖代、父母代及商品代鸡中分离得到ALV-J,这在我国还是首次.对后续研究其基因突变、致瘤机制等奠定了良好的基础.