鸡新城疫病毒LaSota株在BHK-21细胞上增殖条件的优化

本研究旨在对鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株在BHK-21细胞上的增殖条件进行优化,为实现应用细胞系生产NDV提供参考。在确定BHK-21细胞TPCK-胰酶耐受浓度的基础上,在培养基中添加不同浓度的TPCK-胰酶、新生牛血清及调节不同pH,通过对细胞培养液细胞半数感染量(TCID₅₀)的测定,确定最适胰酶浓度、血清浓度及pH;通过固定接毒量而添加不同数量细胞或固定细胞数量而接种不同量的病毒,确定最适细胞量及接毒量;将BHK-21细胞接种NDV LaSota株后,通过测定不同时间细胞上清液TCID₅₀绘制增殖曲线,确定最佳收毒时间;应用转瓶对该病毒进行扩大培养,并进行TCID₅₀、鸡胚半数感染量(EID₅₀)与血清凝集价(HA)的测定。结果显示,NDV LaSota株在BHK-21细胞上增殖的最适TPCK-胰酶浓度为3μg/mL,最适接毒量为10^6.375 EID₅₀,细胞数量为1×10~6个,培养基pH为7.2,且可用无血清培养基进行培养,BHK-21细胞接种NDV LaSota株后最佳收毒时间为34～36 h。应用BHK-21细胞采用转瓶培养的方式对NDV LaSota株进行增殖,结果显示,细胞培养液TCID₅₀值为10^7.0/0.1 mL,EID₅₀为10^7.5/0.1 mL,HA效价为1∶256。因此,应用以上条件增殖培养NDV LaSota株,完全适用于该病毒的规模化生产,且符合现行的兽医生物制品与检验制造规程。     

山羊毛囊干细胞的分离及体外培养

试验采用2．4U／mL Dispase酶消化和机械切割法分离毛囊隆突部,经胰酶（0．5mg／mL胰酶＋0．2mg／mL EDTA）消化从山羊耳部皮肤分离得到的毛囊干细胞,然后进行形态学观察、细胞生长曲线测定、克隆形成率及免疫组化染色检测,并对毛囊干细胞的基础培养基进行了筛选。结果表明：DMEM／F12是一种适合毛囊干细胞体外增殖培养的培养基;在以DMEM／F12为基础培养液的培养体系中细胞可传代至19代。     

BHK-21细胞无血清悬浮培养生产新城疫病毒

为建立基于无血清悬浮培养细胞生产新城疫病毒(NDV)的工艺,本研究首先筛选了适于NDV增殖的乳仓鼠肾细胞(BHK-21)单克隆细胞株,并将鸡胚适应的NDV在筛选获得的细胞株(BHK-v002)中传代,获得细胞适应的NDV。进一步采用单因素实验法检测病毒感染复数(MOI)、TPCK-胰酶浓度、细胞培养液的稀释比例等工艺参数对病毒效价的影响。结果显示,NDV在无血清培养的BHK-v002细胞中增殖的最适条件为:当细胞生长至约9.0×10^6个/mL时,以培养液.新鲜培养基为2:1的比例补加新鲜培养基,使细胞密度达6.0×10^6个/m L,按MOI为0.005接种NDV LaSota株,TPCK-胰酶终浓度为5μg/mL。接种病毒后96 h收获病毒液的HA效价为8.5 log2HAU/25μL,单细胞产毒量(Svy)达到1 685.9病毒颗粒/细胞,半数组织细胞感染剂量(TCID50)为7.9 log10TCID50/100μL。本研究确定了NDV LaSota株在BHK-21细胞悬浮培养中的增殖条件,建立了基于BHK-21细胞无血清悬浮培养体系中NDV的生产工艺,该工艺操作简便,易于放大,为当前ND疫苗的鸡胚生产工艺提供了候选替代方案。     

仔猪心肌细胞分离及培养方法研究

为探讨仔猪心肌细胞的分离及培养方法,采用胶原酶Ⅳ型和胰酶同时消化心肌组织,用10%胎牛血清终止消化,并用100目细胞筛过滤后,1200 r/min离心沉淀细胞,再加入培养液重悬细胞。采用差速贴壁法纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育。结果显示,未贴壁时心肌细胞呈圆形,培养12~24 h心肌细胞开始贴壁生长,细胞伸出伪足呈梭形、多角形,3~4 d后形成细胞簇,5~7 d后细胞汇合成片。因此,同时使用胶原酶Ⅳ型和胰酶消化仔猪心肌可简便、快速地获得高活力的心肌细胞。     

使用不同胰酶消化PK15细胞对比试验

为了寻找消化细胞温和且对细胞生长影响小的消化液,为生产疫苗提供更好细胞状态的PK15细胞,本试验使用0.25%胰酶A与0.25%胰酶B消化PK15细胞。两种胰酶均在常温中消化细胞且各分两组,一组消化完弃去消化液终止消化,另一组消化完不弃去消化液直接加入营养液终止,分种后进行培养观察。主要观察两种胰酶的消化终止时间、细胞分散效果、24 h细胞状态及两种胰酶消化时消化液弃去与不弃去的细胞状态。结果表明0.25%胰酶A消化PK15细胞,无论消化液弃去与不弃去,消化时间均为5~6 min,分散效果均较好且细胞状态都好。而0.25%胰酶B消化PK15细胞,消化时间均为1~2 min,消化液弃去,消化效果较好且细胞状态好;消化液不弃去,分散效果不好且细胞状态较差,生长较缓慢。消化PK15细胞时0.25%胰酶A较0.25%胰酶B更温和,0.25%胰酶A对细胞损伤较小。     

猪流行性腹泻病毒变异株CH/GX/750A/2015在Vero细胞上转瓶培养条件的优化试验

本研究旨在确定猪流行性腹泻病毒（PEDV）变异株CH/GX/750A/2015株在Vero细胞上转瓶培养的最佳条件，为大规模生产高效PEDV变异株疫苗提供技术支撑。试验以10 L转瓶培养病毒，对接毒时细胞维持液中胰酶浓度（0、2、4、6、8和10 μg/mL）、细胞密度（40%、60%、80%、100%、200%）、接毒剂量（MOI分别为1、0.1、0.01和0.001）、吸附时间（0、30、60、90、120、240 min）、收毒时间（接毒后12、24、36、48、60、72 h）、维持培养温度（35、36、37和38 ℃）和转瓶转速（6、8、10、12、14、16 r/h）7个条件进行优化。结果显示，PEDV CH/GX/750A/2015株在10 L转瓶中的最佳培养条件为：细胞刚铺满单层时接毒，接毒量为MOI=0.01，维持液（无血清DMEM培养液）中胰酶质量浓度为6 μg/mL，不需吸附，维持培养温度为37 ℃，12 r/h 旋转培养48 h后收获病毒液可获得较高效价的病毒液，效价可稳定达到10^6.50 TCID₅₀/0.1 mL。本试验为 PEDV 变异株大量培养提供了参考，为变异株疫苗研发奠定了基础。     

仔猪胰腺细胞体外培养体系的建立

为了研究体外培养仔猪胰腺细胞的适宜条件,试验选取1日龄的仔猪胰腺组织置于冰上清洗、修剪,对消化酶、离心方式、培养皿铺被方式、培养液及添加不同促生长因子等多种因素进行筛选和优化.结果表明:0.25%胰酶消化所获得的细胞强于0.1%胶原酶消化获得的细胞,细胞清亮,易于生长;采用500r/min离心5 min、多次离心所获得...     

鸡新城疫病毒LaSota株在BHK-21细胞上增殖条件的优化

本研究旨在对鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株在BHK-21细胞上的增殖条件进行优化,为实现应用细胞系生产NDV提供参考。在确定BHK-21细胞TPCK-胰酶耐受浓度的基础上,在培养基中添加不同浓度的TPCK-胰酶、新生牛血清及调节不同pH,通过对细胞培养液细胞半数感染量(TCID_(50))的测定,确定最适胰酶浓度、血清浓度及pH;通过固定接毒量而添加不同数量细胞或固定细胞数量而接种不同量的病毒,确定最适细胞量及接毒量;将BHK-21细胞接种NDV LaSota株后,通过测定不同时间细胞上清液TCID_(50)绘制增殖曲线,确定最佳收毒时间;应用转瓶对该病毒进行扩大培养,并进行TCID_(50)、鸡胚半数感染量(EID_(50))与血清凝集价(HA)的测定。结果显示,NDV LaSota株在BHK-21细胞上增殖的最适TPCK-胰酶浓度为3μg/mL,最适接毒量为10~(6.375) EID_(50),细胞数量为1×10~6个,培养基pH为7.2,且可用无血清培养基进行培养,BHK-21细胞接种NDV LaSota株后最佳收毒时间为34～36 h。应用BHK-21细胞采用转瓶培养的方式对NDV LaSota株进行增殖,结果显示,细胞培养液TCID_(50)值为10~(7.0)/0.1 mL,EID_(50)为10~(7.5)/0.1 mL,HA效价为1∶256。因此,应用以上条件增殖培养NDV LaSota株,完全适用于该病毒的规模化生产,且符合现行的兽医生物制品与检验制造规程。     

应用生物反应器和微载体培养Vero细胞生产猪流行性腹泻病毒的研究

对应用生物反应器系统和微载体培养Vero细胞生产PEDV进行了实验研究,通过分析和比较批培养及换液培养过程中细胞生长、代谢和病毒增殖的相互关系,发现PEDV随着细胞的生长而不断在胞内增殖和积累,72h后Vero细胞需经过一个短暂的停止生长阶段,再继续呈指数生长。反应器换液培养的单位培养基细胞产量比批培养提高了28%,比方瓶培养提高了138%,疫苗生产效率显著提高。当接种密度为1 23×105cells/ml时,换液培养至96h时获得了1 74×106cells/ml的高细胞密度,细胞扩增了14 3倍,且单位细胞的病毒产量并不低于静态培养。     

小鼠输卵管上皮细胞的原代培养及纯化方法研究

建立小鼠输卵管上皮细胞原代培养及纯化方法.小鼠输卵管上皮细胞原代培养采用组织块培养法和酶消化法.酶消化法于37℃分为4个处理组进行.处理1以2.5 g/L胰酶+0.4 g/L EDTA消化5、10、20 min;处理2以0.5 g/L胰酶+0.08 g/L EDTA消化35、50、75 min;处理3以0.3 g/L的Ⅰ型胶原酶消化60、90、240 min;处理4以2.5 g/L胰酶+0.4 g/L EDTA和0.3 g/L Ⅰ型胶原酶(1∶2)消化60 min,150 min.原代细胞纯化采用差速贴壁和反复差速贴壁法.传代采用胰酶两步消化法进一步纯化输卵管上皮细胞.组织块法原代培养成纤维细胞生长优势明显,传代纯化细胞效果不佳.用酶消化法原代培养时,处理1效果不理想;处理2采用3个消化时间时均取得比较理想的结果;处理3消化240 min时结果较好;处理4消化150 min效果较好.原代细胞纯化,反复差速贴壁得到的上皮细胞较纯,进一步传代纯化细胞取得了理想的结果.小鼠输卵管上皮细胞原代培养采用酶消化法结合反复差速贴壁分离纯化细胞,传代采用两步消化法,可以成功地进行小鼠输卵管上皮细胞的分离纯化培养.     

仔猪胰腺细胞体外培养体系的建立

为了研究体外培养仔猪胰腺细胞的适宜条件,试验选取1日龄的仔猪胰腺组织置于冰上清洗、修剪,对消化酶、离心方式、培养皿铺被方式、培养液及添加不同促生长因子等多种因素进行筛选和优化。结果表明:0.25%胰酶消化所获得的细胞强于0.1%胶原酶消化获得的细胞,细胞清亮,易于生长;采用500 r/min离心5 min、多次离心所获得的细胞较Percoll不连续密度梯度离心和5%BSA等密度梯度离心所获得的细胞贴壁率高,生长能力强,易于培养传代;采用0.1%明胶或20μg/mL的层黏连蛋白铺被培养皿均比无铺被的培养皿获得更多的贴壁细胞;以RPMI 1640、M199、F12、L-DMEM多种培养液培养仔猪胰腺细胞,表现出多种细胞形态和生长趋势;在基础培养液中添加上皮生长因子、角质化生长因子、β-巯基乙醇和白血病细胞抑制因子、转铁蛋白与亚硒酸盐混合试剂等促干细胞增殖因子可促进不同形态细胞的增殖。说明按此方式培养可获得大量、多种细胞形态的仔猪胰腺祖/干细胞。     

不同pH值消化液对ST细胞分散作用的影响

本试验采用不同pH值胰蛋白酶消化液分别消化转瓶ST细胞，并观察记录ST细胞消化时间、分散效果、瓶壁残留情况、细胞计数、细胞粒径以及细胞再次贴壁生长状态，获得转瓶培养ST细胞的胰蛋白酶消化液最佳pH值，为ST细胞在转瓶传代培养过程中出现的细胞不脱壁、团块大的问题提供数据支持。     

番鸭胚成纤维细胞的原代分离与培养研究

为建立番鸭胚成纤维细胞(MDEF)的体外培养、传代和冻存技术,选用11胚龄番鸭胚,2.5g/L胰蛋白酶消化,原代MDEF于含100 mL/L血清的DMED培养液中培养;研究热、冷两种消化方法对MDEF消化密度及活率的影响,探讨不同血清浓度对MDEF生长、冻存活性的影响,以及离心对MDEF传代和复苏时细胞活率的影响。结果显示,胰酶消化法获得了MDEF,细胞贴壁紧密,生长良好;冷消化得到的原代MDEF密度和活率均高于热消化;血清浓度在20mL/L~100mL/L范围内,浓度越高MDEF生长速度越快;血清浓度显著影响MDEF复苏的活率;MDEF冻存液中DMSO∶血清∶培养液比例为1∶2∶7冻存效果良好;在MDEF传代和复苏过程中去除离心操作,不仅可简化操作,细胞活率也有一定提高。本研究建立了MDEF的原代分离和培养方法,为适用于番鸭相关研究的体外细胞培养体系奠定基础。     

从小鼠类ES细胞分化群中分离培养一类衍生细胞及其培养特性

将小鼠囊胚在饲养层、无类LIF因子的培养基中培养出类ES细胞团,将该类ES细胞团传至第三代,暂停传代,继续培养,则4～5 d后该细胞团会向周围分化出一种圆而发亮的衍生细胞,该衍生细胞会不断地向周围生长,约20 d后该衍生细胞铺满培养皿底.将该衍生细胞传至铺有饲养层的培养瓶中继续传代至第七代,再将其传代至无饲养层的培养瓶中,约12 d后,其在无饲养层的培养瓶中长满瓶底.以后随着传代数的增加,该细胞长满瓶底所需时间越来越短,最后稳定在2～3 d.对传代至第30代的细胞进行生长曲线测定,并以不同的基础培养基、不同的血清浓度、不同的胰岛素浓度等条件培养该细胞,结果发现：该衍生细胞分别在DMEM高糖、DMEM低糖、DMEM-F12、PRMI1640等为基础的培养基中都能生长,但以DMEM-F12为最优.在血清浓度分别为10%、14%、18%的DMEM高糖培养基中培养显示：该细胞在高浓度血清的培养基中具有生长更好的趋势.在胰岛素浓度分别为0、0.25、0.5、1 μg/ml的DMEM高糖培养基中培养显示：该细胞在无胰岛素的培养基中无法正常生长,在0.5 μg/ml胰岛素浓度的培养基中生长最佳.     

鸵鸟胚原代组织细胞的培养及鉴定

为研究鸵鸟胚成纤维、肝、肾、脑组织原代细胞的体外分离培养方法,试验选择28胚龄的鸵鸟胚组织,通过胰蛋白酶消化法与组织块贴壁培养法分离培养原代细胞。通过细胞HE染色形态观察、细胞活性与生长曲线测定、RT-qPCR测定细胞基因标志物对细胞类型进行鉴定。结果显示：组织块贴壁法培养的细胞12 h后开始生长,胰酶消化法分离培养的细胞,4 h后开始贴壁生长,且采用胰酶消化法获得的细胞传代后状态良好,生长变快;HE染色显示成纤维细胞、肝细胞与肾细胞为多角形或长梭形,脑细胞多呈星状与三角形;RT-qPCR结果显示,与原代细胞相比次代细胞的标志物基因ALB、CD105、CD90、CD73、WT-1、Emx-2、Wnt-4、CD133 mRNA表达水平均明显升高。研究表明,利用胰酶消化法与组织块贴壁培养法均可分离出鸵鸟胚原代细胞,但胰酶消化法分离的细胞更适合后期深入研究细胞功能,为进一步研究奠定基础。     

奶牛耳成纤维细胞的分离培养及培养条件的研究

本试验研究了奶牛耳成纤维细胞的体外培养,培养液、消化液、胰岛素和血清饥饿对细胞的影响。采用组织块贴壁法培养。了奶牛耳成纤维细胞,采用0．25％胰酶差别消化获得了纯化的奶牛耳成纤维细胞。用三种不同的培养液即DMEM（低糖）、DMEM（高糖）、DMEM／F12,对细胞进行培养,结果细胞群体倍增时间均在2．3-2．5d,DMEM（高糖）的培养效果稍好。用三种不同的消化液（0．25％胰蛋白酶,0.02％EDTA,0．25％胰蛋白酶＋0．02％EDTA）对传代钿跑进行消化．结果表明0．25％胰蛋白酶＋0D2％EDTA所用时间短,消化后培养细胞贴壁率高。在培养液中添加姨岛素能促进细胞的生长。对指数生长期的细胞进行血清饥饿后,细胞仍保持着较高的活力。     

IBRS—2传代细胞制备的几点体会

IBRS- 2传代细胞较常用的 BHK- 2 1传代细胞在工业化转瓶培养大生产中难培养。经过一段时间的传代实验 ,选择对其适应的营养液和对消化时间的掌握 ,使该细胞传代稳定 ,细胞形态清晰 ,2～ 3d形成致密单层 ,在大生产中可广泛采用。1　材　料1 .1　 IBRS- 2细胞种　由中国兽药监察所提供。1 .2　 MEM干粉　由美国 Hyclone公司提供。1 .3　血清　来源杭州、郑州 ,均为经滤过除菌的犊牛血清。1 .4　胰酶 - EDTA　由中国科学院新疆化学研究所生化试剂厂提供 ,并经钴 60辐射处理 ,本厂配制。1 .5　 Na HCO3 溶液、抗生素、L -谷胺酰氨　…     

不同消化酶对羊驼皮肤黑素细胞分离的影响

本研究旨在探讨羊驼皮肤黑素细胞的分离、培养及鉴定方法,为进一步研究色素沉积提供合适的细胞模型。取1~3岁的青年羊驼皮肤,用胰酶、胰酶∶EDTA、DispaseⅡ酶3种不同的消化酶消化羊驼皮肤,再用胰酶∶EDTA消化,分离得到羊驼黑素细胞,接种于多种促进黑素细胞生长的营养成分DMEM/F12培养基中,通过观察黑素细胞的生长、细胞接种数和细胞贴壁数检验黑素细胞的纯度。结果表明,DispaseⅡ组处理的羊驼皮肤,分离得到的黑素细胞明显多于其它2个组(P＜0.01)。综上所述,选用DispaseⅡ酶作为分离羊驼皮肤的消化酶,可获得较纯的黑素细胞。     

柞蚕蛹卵巢原代细胞培养方法及培养基的选择试验

采用机械分散法和胰酶消化法,分别选取MGM-448、Grace、TC-100等3种培养基进行柞蚕蛹卵巢组织细胞的体外培养。在2个月的原代细胞培养期间,机械分散法获得的培养物在MGM-448培养基中贴壁效果好,细胞健康且生长旺盛;而在Grace和TC-100培养基中,细胞虽能贴壁,但生长较缓慢。胰酶消化法分散细胞的效果好,但在3种培养基中的细胞会出现轻微损伤而影响活力。综上认为,柞蚕蛹卵巢原代细胞的最佳培养方法为机械分散法,最佳培养基为MGM-448。     

猪孤雌胚胎干细胞建系的研究

以猪孤雌激活囊胚为材料,囊胚透明带消化后采用全胚培养,培养液中添加不同培养成分或因子（如FGF2,LIF,2i等）,以及选择不同的初始培养液体积来筛选猪胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES细胞）建系的优化培养体系。囊胚内细胞团形成的细胞集落采用胰酶消化传代。结果显示：透明带消化后,囊胚贴壁率显著升高（19．4％VS．8．8％）（P〈0．05）;初始培养液体积比平常培养液体积（0．30mL／孔,24孔培养板）减半条件下,能显著提高其贴壁率（91．7％VS 20．0％）（P〈0．01）,而且获得了可传至7代的类ES细胞系2株,碱性磷酸酶染色成阳性;当用2i因子（CHIR99021和PD03025901）去替代培养液中的FGF2,囊胚贴壁率（29．400VS53．3％）和原代集落形成率（20．0％VS 87．5％）反而显著下降（P〈0．01）。这表明培养液添加了FGF2和LIF（不舍2i因子）,用24孔板培养,最初培养体积为0．15mL,透明带消化的培养体系比较适合猪孤雌激活胚的ES细胞建系。