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相似文献
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1.
普通PCR试验的原理是在反转录酶的作用下,以RNA为模板,以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在Taq DNA聚合酶的作用下,经过高温变性、低温退火、中温延伸的  相似文献   

2.
三江白猪是我国以长白猪和东北民猪为亲本,进行正反杂交,再用长白猪回交,经6个世代定向选育培育而成的瘦肉型新品种,胴体瘦肉率可达57.8%。试验的目的是克隆三江白猪的OB基因,并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,研究其表达情况。现报道如下。1材料与方法1.1主要试剂总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒,购自Pro-mega公司;pMD18-T、pET-28a、T4 DNA连接酶、LA Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、Ex TaqTM DNA聚合酶(5 U/μL)、各种限制性内切酶(EcoRⅠ、Xho I),均为TaKaRa公司产品;引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。1.2总RNA提取按R…  相似文献   

3.
驯鹿生长素Ghrelin cDNA的克隆   总被引:1,自引:1,他引:0  
从驯鹿皱胃组织中提取总RNA,根据已发表的驯鹿生长素Ghrelin基因序列设计并合成引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行cDNA扩增,获得了300 bp的片段,重组到pBlueselect T载体,经限制性内切酶谱分析和DNA序列测定分析,确认PCR产物为Ghrelin cDNA,为进一步研究Chrelin在驯鹿体内的分布及营养因素等对其基因表达的影响奠定基础。  相似文献   

4.
为了扩增梅花鹿Ghrelin基因的cDNA序列,根据已发表的驯鹿生长素Ghrelin基因的cDNA序列设计并合成1对特异性引物,以梅花鹿皱胃组织中提取的总RNA为模板,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行cDNA扩增,获得了300 bp片段,重组到pBlueselect T载体,经限制性内切酶谱分析和DNA序列分析,确认PCR产物为Ghrelin cDNA。  相似文献   

5.
构建猪肌生成抑制素(MSTN)成熟蛋白编码序列的克隆与表达载体,并对mRNA进行转录水平的检测,为获得较好的猪肌生成抑制素抗原、制备抗体打下良好的基础。猪MSTN基因的cDNA去除信号肽后,用PCR扩增的1.2kb目的片段与pMDl8-T载体连接,将克隆载体的质粒DNA与同样用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ限制性内切酶酶解的表达载体pET28a( )质粒定向连接,对筛选出的阳性克隆用酶切及测序法鉴定。对猪MSTN基因成熟蛋白编码序列进行反转录,对mRNA Northern杂交进行转录水平的检测。结果,所得到的序列与所设计的序列完全一致,表明成功地进行了猪MSTN基因编码序列的克隆及筛选;目的片段定向插入,阅读框架正确;RT-PCR成功地反转录得到约1.2kb的目的DNA片段,Northern杂交后对mRNA印迹放射自显影,见到清晰的1.2kb特异带。  相似文献   

6.
以口蹄疫病毒核酸为模板。在 AMV 反转录酶及底物的作用下合成cDNA,经聚合酶链反应(PCR)直接将生物素化脱氧核苷酸(Bio-11-duTP)掺入底物进行扩增,其产物即为寡聚核苷酸探针。将此探针应用于斑点杂交试验。检测口蹄疫病毒.  相似文献   

7.
8.
饲料中马、驴源性成分的分子生物学检测技术   总被引:1,自引:0,他引:1  
根据马、驴线粒体DNA中的保守区段设计了一对引物,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)可以专一地检测扩增出马、驴源性成分的DNA片段,再经限制性内切酶Sau 3A和Alu Ⅰ的酶切鉴定可以区分马源性成分和驴源性成分.PCR扩增产物的测序结果验证了酶切鉴定结果的正确性。引物灵敏度测试培果表明该方法的检测低限均达0.3%.该对引物可以成为检测马、驴源性成分高效准确的检测工具。  相似文献   

9.
豌豆ISSR-PCR反应体系的建立和优化   总被引:1,自引:0,他引:1  
以豌豆(Pisum sativum L.)DNA为材料,对影响其ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA量、引物浓度、dNTPs浓度、Taq酶量、退火温度)进行优化,最终确定了豌豆ISSR-PCR反应的最佳体系(20 μL)为:15 ng模板DNA, 0.15 mmol·L-1dNTP, 0.5 μmol·L-1ISSR引物, 1 U Taq DNA聚合酶,引物842号的最适退火温度为50℃。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行豌豆属种质资源的遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。  相似文献   

10.
为了优化黑琴鸡简单重复序列(SSR)-PCR反应体系,试验以黑琴鸡基因组DNA为模板,采用L25(54)正交试验设计,对SSR反应体系中的4种关键因素(Taq DNA聚合酶、dNTP、引物、DNA模板)进行优化。结果表明:各因素水平变化对PCR反应影响的显著性依次为引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA模板,试验建立的黑琴鸡SSR-PCR最佳反应体系(20μL)为1 U Taq DNA聚合酶0.5μL,1.6 mmol/L dNTP 2μL,1.8μmol/L引物2μL,DNA模板40 ng,10×Buffer 2μL,加双蒸水至总体积为20μL。  相似文献   

11.
野火球RAPD反应体系优化研究初报   总被引:1,自引:0,他引:1  
为建立一个稳定的野火球RAPD反应体系,对RAPD反应条件中模板DNA用量、Taq DNA聚合酶用量、随机引物浓度、Mg2 浓度和dNTP浓度等各项参数进行筛选比较,创建其最佳反应体系为;250μl反应体系中,模板DNA51ng,Taq DNA聚合酶0.5U.引物浓度0.32μmol/L,Mg2 浓度1.2mmol/L,dNTP浓度0.20mmol/L,10×PCR Buffer 1.0μl,ddH2O19μl.  相似文献   

12.
11β-羟类固醇脱氢酶1(11β-HSD1)可使无生物活性的皮质酮催化为有活性的皮质醇,本试验利用长白猪肝脏组织提取的RNA反转录出11β-HSD1基因的cDNA,通过反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)技术和DNA重组技术,将11β-HSD1基因构建到pcDNA3.1真核表达载体上,构建了11β-HSD1-pcDNA重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳和测序分析的方法对重组的质粒进行了鉴定,并将其转染了Hepa1-6细胞,通过RT-PCR检测了其过表达强度。试验结果表明,成功构建了猪11β-HSD1-pcDNA真核过表达载体,为转基因动物的研究奠定了基础。  相似文献   

13.
根据鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法对其基因组分10个片段进行扩增,并克隆至pMD19-T载体中进行测序。经BsaⅠ限制性内切酶酶切后,采用优化的连接策略将各DNA片段进行连接,获取H120株的基因组全长cDNA,其5′端具有完整的T7RNA聚合酶启动子的核心序列,3′端具有polyA尾巴结构。通过T7RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA,转染BHK-21细胞并进行病毒拯救。采用RT-PCR、测序及鸡胚传代对拯救出的病毒株进行鉴定。结果表明成功地从H120株的基因组全长cDNA拯救出病毒H120-R株,为进一步开展该病毒的分子致病机理研究、新型疫苗的研制等奠定了基础。  相似文献   

14.
用禽类成髓细胞病毒(AMV)反转录酶将蓝舌病病毒RNA反转录成cDNA,以dATP、dGTP、dCTP、dTTP和bio-11-dUTP作为TaqDNA聚合酶的底物,应用PCR技术合成了生物素化蓝舌病病毒核酸探针,经斑点杂交试验证明,合成的探针为蓝舌病病毒特异性核酸探针。  相似文献   

15.
通过反转录-聚合酶链反应(RT~PCR)扩增了猪轮状病毒国内地方分离株JL94的VP6基因cDNA片段。将其插入克隆载体质粒pMD18-T 的EcoRV酶切位点处,构建了重组质粒pMD18-T—VP6。对克隆的VP6基因进行序列测定,测序结果显示VP基因全长1356bp,并与猪A群轮状病毒OSU(亚组Ⅰ),Gottfried(亚组Ⅰ)的VP6进行同源性比较,结果显示,核苷酸序列同源性分别为86.85%、82.41%,氨基酸序列同源性分别为97.48%、93.20%,结果表明JL94分离株与OSU株在基因型上更为接近。  相似文献   

16.
为构建鸡胚成纤维细胞cDNA真核表达文库并对文库质量进行鉴定,从鸡胚成纤维细胞中直接提取mRNA,用紫外分光光度计测定含量.经电泳确定mRNA的质量,反转录合成第一、二链cDNA,经苯酚氯仿抽提后与EcoR Ⅰ接头连接,经Not Ⅰ酶切后用spin column除去小于500 bp的cDNA片段,与经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切的真核表达质粒连接,连接产物电转化感受态细胞,测定文库的容量大小并通过colony PCR鉴定插入cDNA片段的大小.构建成含8.8×105个重组子的鸡胚成纤维细胞cDNA文库,重组子中平均插入外源片段长度大于1.0 kb的约占85.7%.从结果看构建的文库合格,适合用于筛选目的cDNA克隆.  相似文献   

17.
鸡新城疫Ⅰ系疫苗诱导鸡胚IFN-y基因转录及cDNA克隆的研究   总被引:1,自引:1,他引:0  
应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从鸡新城疫系Ⅰ系疫苗接种的洛阳土种鸡胚脾提取的RNA中扩增到干扰素-γ(IFN-γ)基因cDNA。结果表明,以1:50或1:100稀释度接种后第48h提取的mRNA扩增效果最佳。序列测定显示,所克隆的洛阳土种鸡IFN-γ基因cDNA与所报道的鸡IFN-γ基因cDNA同源性为99.7%,相应的氨基酸序列同源性为100%,说明鸡IFN-γ基因编码区高度保守。  相似文献   

18.
22个虉草基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用单因素试验方法,对影响PCR扩增体系中dNTP、引物浓度、Taq酶和模板DNA用量4个因素及引物退火温度进行梯度试验,优化得到最佳的ISSR-PCR反应体系,即20μL反应体系中分别加入0.3μL Taq DNA聚合酶(5U/μL),2μL 10×PCR Buffer(mg2+plus),1.5μL dNTP(2.5mmol/L),1.5μL引物(10pmol/μL),50ng模板DNA,ddH2O补足体积。以此体系对24条引物进行筛选,最终获得了多态性高,重复性好的引物12条。引物UBC808、809、811、815、818、820、826的适宜退火温度为55℃,引物835,841和842的适宜退火温度为56℃,而引物810和834的适且退火温度分别为52℃和54℃。12条引物共扩增总条带数192条,其中,多态性条带数173条,多态位点百分率89.81%。  相似文献   

19.
根据已知H5N1亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)基因序列设计并合成引物。从H5N1亚型病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高保真DNA聚合酶扩增NA基因,构建转移载体pFastBacHTA-NA,并与大肠杆菌DH10Bac的Bacmid质粒重组,构建重组转座质粒rBacmid-NA。在脂质体介导下将rBacmid-NA转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。在sf9昆虫细胞中表达NA蛋白,通过SDS-PAGE、Western blot和激光共聚焦检测蛋白。结果表明:表达的NA蛋白分子量约为53 ku,该蛋白能与H5N1亚型AIV血清发生特异性反应,证明NA蛋白表达正确,具有良好的免疫反应性。  相似文献   

20.
用单因素设计法对影响杨桃SCoT-PCR反应体系的主要因素Mg2+, dNTPs,引物, Taq DNA 聚合酶及DNA 模板浓度进行优化。结果表明,适于杨桃研究的SCoT-PCR最佳反应体系为:总体积为20μL的反应体系中,含2.5mmol/L Mg2+,0.3mmol/L dNTPs,30mg/L模板DNA,1.00μmol/L引物和0.4U Taq DNA聚合酶。用不同引物及杨桃DNA对该体系进行验证,扩增条带清晰,结果稳定可靠,证明该反应体系适用于杨桃SCoT-PCR扩增。  相似文献   

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