猕猴外周血液中多潜能调控因子Oct4、Nanog和Sox2基因的表达

采用半定量RT-PCR对采自幼体(2岁以内)、亚成体(2～5岁)和成体(5岁以上)猕猴共28份外周血样品进行分析.结果显示,幼体和亚成体猕猴所有外周血样品均转录表达Oct4、Nanog和Sox2基因,大部分成体猕猴外周血样品(8/12)表达Oct4、Nanog和Sox2基因,少数样品仅表达Oct4和Sox2(2/12)或Oct4和Nanog(1/12),1份样品不表达3个基因;同一年龄组内,Sox2表达水平均显著高于Oct4和Nanog(P≤0.05),幼体组Oct4和Nanog的表达水平没有显著性差异(P＞0.05),亚成体组和成体组Oct4的表达水平均显著高于Nanog(P≤0.05);在不同年龄组间,Oct4和Nanog表达水平没有显著性差异(P＞0.05),幼体组Sox2表达水平显著高于成体组(P≤0.05).结果表明,在生理条件下Oct4、Nanog和Sox2基因在不同年龄段猕猴外周血中均转录表达,不同基因表达水平存在一定差异,随年龄增加这些基因表达量有降低的趋势.     

Sox2基因真核表达载体的构建及转Sox2基因绵羊骨髓间充质干细胞系的建立

Sox2是多能干细胞的主要标记之一,有研究发现高表达Sox2基因的神经干细胞作为供体细胞进行核移植时具有较高的重编程能力。本研究旨在通过对绵羊骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymal stem cells,BMSC) Sox2基因进行外源性增强表达,以期提高其重编程能力,从而改善动物体细胞克隆效率。试验提取绵羊胎儿生殖腺组织RNA,以其为模板克隆Sox2基因cDNA序列,装入真核表达载体pEGFP-N1,构建出pEGFP-N1-Sox2表达载体。经脂质体转染将重组质粒转染入绵羊BMSC,经G418与荧光标记双筛选后挑选单克隆并扩增培养。测序鉴定表明,克隆得到绵羊Sox2基因CDS区全长,重组质粒构建成功;荧光检测表明,成功建立表达Sox2基因的绵羊BMSC系。本研究得到了高表达Sox2基因的绵羊BMSC系,为提高体细胞克隆过程中的重编程效率提供了新思路。     

免疫荧光检测绵羊体外受精胚胎Oct4、Cdx2表达研究

Oct4基因和Cdx2基因是附植前胚胎发育的重要调控基因,并最终调控了胎儿和胎盘的发育,也在胚胎妊娠识别和附植时调控了干扰素(interferon tau,IFNT)的表达.本研究通过体外成熟、体外受精和体外培养获得了不同发育时期的绵羊胚胎,应用免疫荧光染色探讨了Oct4在早期胚胎的表达规律,结果表明:受精卵和早期卵裂...     

Oct4在不同时期牛睾丸组织中的表达

为探明不同时期牛睾丸组织中干细胞的表达特点,以2.5月龄、4月龄牛胎儿和出生后1年牛、2年牛睾丸为试验材料,通过HE染色和免疫组化法染色,探讨了不同时期牛睾丸的组织学特征及Oct4在睾丸组织中的表达。结果显示,早期胎儿阶段的牛睾丸组织细胞呈现团状,睾丸组织中细胞随着年龄增长逐步分化形成管状,在2.5月龄和4月龄胎牛睾丸组织中,Oct4阳性细胞广泛分布于睾丸组织生精小管细胞团和睾丸间质中;在出生后1年牛睾丸组织中,阳性细胞主要分布于牛睾丸组织生精小管基底膜,在睾丸间质中数量较少或没有;在出生后2年牛睾丸组织中,仅在睾丸组织生精小管基底膜的少量细胞呈现Oct4阳性。试验证实了随着牛年龄的增长,牛睾丸组织中Oct4阳性细胞逐渐减少或消失。     

Oct4在山羊睾丸组织中的表达与定位

探讨不同时期山羊睾丸组织中干细胞的分布和特点,以45 d和75 d山羊胎儿及出生后4月龄山羊睾丸为试验材料,进行了HE染色和Oct4抗体的免疫组化染色。结果显示,在45 d山羊胎儿睾丸组织中睾丸实质细胞聚集呈团状,形成岛屿状组织结构;发育到75 d山羊胎儿睾丸组织中睾丸的间质与实质组织结构差异明显,睾丸生精小管已经形成,生精小管管腔闭锁;出生后4月龄山羊睾丸组织结构明显,生精小管形态特征清晰,但管腔仍处于闭锁状态;Oct4免疫组织化学显示在45 d山羊胎儿睾丸组织中Oct4阳性细胞呈岛屿状分布,多见于生精小管前期的组成细胞;对于75 d山羊胎儿睾丸组织Oct4阳性细胞呈环状分布于生精小管中,睾丸间质组成细胞中则较少;在出生后4月龄山羊睾丸中阳性细胞主要分布于睾丸组织生精小管基底膜,沿基底膜环状分布。试验证实了在早期山羊睾丸组织中Oct4主要表达在生精前体细胞。     

山羊Sox2基因克隆、原核表达和GST融合蛋白纯化

本研究旨在克隆山羊Sox2基因,构建pGEX-Sox2原核表达重组质粒,从大肠杆菌中获得纯化的GST-Sox2融合蛋白.应用RT-PCR方法从6周龄胎山羊生殖嵴扩增Sox2基因编码全序列,将其克隆到pMD18-T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体.重组质粒pGEX-Sox2转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,用SDS-PAGE电泳及Western blotting检测GST-Sox2融合蛋白表达,用谷胱甘肽Sepharose 4B介质分离纯化该融合蛋白.结果表明,山羊Sox2基因编码序列全长为960 bp;在优化的表达条件(1 mmo|·L-1 IPTG,22℃诱导16h)下,重组质粒(pGEX-Sox2)在大肠杆菌得到了高效表达;谷胱甘肽Sepharose 4B颗粒纯化蛋白得到预期大小的融合蛋白(约60 ku).结论,本研究克隆了山羊Sox2基因,获得了纯化的GST-Sox2融合蛋白,为制备其多克隆抗体奠定了基础,为进一步研究山羊iPS细胞(Induced pluripotent stem cells)创造了条件.     

广西巴马小型猪Oct4基因克隆及其在成纤维细胞中的表达

根据GenBank中公布的猪Oct4核苷酸序列设计合成1对引物,采用RT-PCR方法从巴马小型猪睾丸组织扩增Oct4基因编码全序列。然后将该基因重组于含有绿色荧光报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建成pEGFP-Oct4重组质粒,通过酶切电泳鉴定和DNA测序证明重组质粒构建成功。使用脂质体2000将pEGFP-Oct4转染巴马小型猪肾脏成纤维细胞,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,转染细胞株中可检测到Oct4的转录。结果表明,成功构建了真核表达载体pEGFP-Oct4,并可在巴马小型猪肾脏成纤维细胞中表达,为进一步研究Oct4基因生物学功能奠定了基础。     

细胞因子IL-2和IL-4对病毒保护性抗原基因真核表达影响的研究

如何提高和改善疫苗的免疫效果是目前疫苗研究的热点,近年来许多研究发现与DNA疫苗联合应用的细胞因子可通过不同的环节调节和增强DNA疫苗免疫效应,白细胞介素作为免疫佐剂能协同DNA疫苗能取得较好的免疫效果。细胞因子是动物体内特异高效调控免疫细胞和协调免疫应答重要的信号分子,它主要包括淋巴毒素(LT)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(INF)、白细胞介素(IL,如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12)和集落刺激因子(GM-CSF)等。其中IL-2和IL-4对病毒保护性抗原基因真核表达影响的研究较多。主要综述了IL-2和IL-4作为免疫佐剂对病毒保护性抗原基因真核表达的影响,以期为更深入地进行IL-2和IL-4对DNA疫苗免疫增强作用的深入研究提供参考。     

带有GFP的小鼠Sox2基因逆转录病毒载体的构建及其检测

为了建立体细胞重编程过程中检测Sox2基因表达变化的方法,本研究利用克隆获得的小鼠Sox2基因与逆转录病毒载体pMX—IRES—GFP连接,构建带有报告基因GFP的逆转录病毒载体,将其转染293GP细胞后获得假病毒上清。将获得假病毒上清侵染小鼠成纤维细胞（NIH3T3细胞）后观察GFP的表达和检测Sox2转录量的变化。其结果,成功构建带有GFP的Sox2基因逆转录病毒载体pMX—Sox2-IRES—GFP;将构建的载体转染后293细胞后获得能侵染NIH3T3细胞的假病毒上清,且与未侵染的NIH3T3细胞相比,侵染后的NIH3T3细胞的Sox2表达量提高近10倍。本研究为开展在体细胞重编程过程中Sox2表达与重编程效率的相关性提供依据．     

Construction of Eukaryotic Expression Vector of Sox2 Gene and Establishment of Sheep Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Lines Transfected with Sox2 Gene

Sox2 is one important marker of pluripotent stem cells, a study found that neural stem cells with high expression of Sox2 as donor cells showed higher reprogramming ability in nuclear transplantation.In this study, through enhancing exogenous Sox 2 gene expression of sheep bone marrow mesenchymal stem cells, in order to raise their reprogramming ability, and improve the efficiency of somatic cell cloning in animal.Total RNA was extracted from sheep testicular tissue, and with this template, Sox2 cDNA sequence was amplified and inserted into the eukaryotic expression vector pEGFP-N1 to build a recombinant vector pEGFP-N1-Sox2.The vector was transfected into the sheep bone marrow mesenchymal stem cells by liposome method, and through G418 and fluorescence screening to obtain and amplify monoclone.DNA sequencing showed that sheep Sox 2 gene CDS sequence was obtained, and recombinant plasmid was successfully constructed.Identification of fluorescence confirmed that stable sheep bone marrow mesenchymal stem cell lines transfected with Sox2 were established.This study obtained the sheep bone marrow mesenchymal stem cell lines with high expression of Sox2, and provided a new idea for raising reprogramming efficiency in the process of somatic cell cloning.     

绵羊Sox2基因逆转录病毒载体的构建与检测

为建立利用内源诱导因子诱导绵羊体细胞为多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)的方法,对绵羊Sox2基因进行克隆,并与pMXs连接构建逆转录病毒载体,将构建的载体转染293GP细胞以获得假病毒上清,利用假病毒上清侵染绵羊胎儿成纤维细胞以检测细胞中的Sox2表达变化。PCR和酶切鉴定结果显示,成功构建了pMXs-Sox2重组质粒,该质粒具有转染293GP细胞的能力,所获得的假病毒上清侵染绵羊胎儿成纤维细胞后,可诱导细胞表达Sox2基因。本研究为开展绵羊iPS的相关研究提供依据。     

神经干细胞的研究进展

近年来的研究表明胚胎期和成年期动物的神经组织及人脑中可以分离出神经干细胞。神经干细胞具有增殖并分化成神经元及神经胶质细胞的潜能。本文综述了神经干细胞的分布、生物学特性、识别及其在治疗中枢神经系统疾病中的应用前景。     

家禽胚胎干细胞分离培养的影响因素及其细胞生物学特性鉴定

家禽的胚胎干细胞与遗传工程，转基因技术相结合的综合性研究具有重大的理论意义与实践价值。文章就家禽胚胎干细胞、胚胎生殖细胞研究背景，分离培养的影响因素。生物学特性的检测方法进行了阐述，较为详细地分析了分离培养的影响因素及细胞生物学特性鉴定，并对家禽胚胎干细胞的前景进行了展望。     

影响胚胎干细胞分离克隆的因素分析

本文就胚胎质量和胚胎类型、分化抑制物、培养基、传代时间和消化液等方面对胚胎干细胞分离克隆的影响进行了讨论。     

干细胞的研究和利用

干细胞是指分化程度低、多潜能的细胞 ,主要指胚胎细胞和幼稚细胞。人们对干细胞的研究和利用是基于细胞发育的全能性以及干细胞分化多潜能的特性。目前 ,对干细胞的研究引起各方面的强烈关注。有关胚胎干细胞及干细胞疗法得到了普遍重视 ,其中 ,造血干细胞被成功应用于临床疾病治疗。在对干细胞的研究和利用中取得了实质性突破的同时 ,也暴露出一些有关道德和伦理方面的社会问题。但是 ,随着对干细胞研究的深入 ,对干细胞的利用已展现出广阔的前景和产业化的可能。