瑶山亚种树鼩ISG15蛋白表达及其多克隆抗体制备

[目的] 克隆瑶山亚种树鼩干扰素刺激基因15（interferon stimulating gene 15,ISG15）基因,在大肠杆菌中高效表达并纯化、制备多克隆抗体,为其生物学应用及检测方法的建立奠定基础。[方法] 提取瑶山亚种树鼩外周淋巴细胞总RNA,经RT-PCR扩增出ISG15基因,亚克隆到真核表达载体构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-ISG15,并瞬时转染仓鼠肾细胞（baby hamster syrian kidney,BHK-21）;同时亚克隆到原核表达载体pET-28a（+）构建重组表达质粒pET-28a-ISG15,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达树鼩ISG15蛋白;重组蛋白经镍离子亲和层析法纯化并免疫小鼠,获得鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体,利用Western blotting和间接免疫荧光技术（IFA）检测其反应性。[结果] 成功克隆瑶山亚种树鼩ISG15基因,并构建了其真核和原核表达载体,真核表达载体在BHK-21细胞中能高效表达;原核表达载体在大肠杆菌中30 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h获得重组蛋白（分子质量22 ku）,蛋白以包涵体形式表达,经镍离子亲和层析法得到纯化。乳化后的重组蛋白免疫小鼠,获得抗瑶山亚种树鼩ISG15的多克隆抗体,经Western blotting检测,制备的鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体稀释度在1：8 000时仍能够与0.01 μg ISG15重组蛋白结合。IFA检测发现,多克隆抗体能与真核细胞过表达的蛋白反应,抗体反应性良好。[结论] 构建的原核表达载体在大肠杆菌中高效表达瑶山亚种树鼩ISG15蛋白,重组蛋白纯化复性后具有良好免疫原性,获得的多克隆抗体为进一步研究树鼩抗病毒感染免疫奠定了良好基础。     

鲤春病毒血症病毒核蛋白的原核表达及初步鉴定

为原核表达鲤春病毒血症病毒(SVCV)核(N)蛋白,本研究采用RT-PCR方法扩增SVCV N蛋白基因(SVCV-N),克隆于原核表达载体pET-28a(+)中,并转化到大肠杆菌Rosetta中进行表达.SDS-PAGE分析表明,SVCV-N基因在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物约47 ku,与预期相符.Western blot检测表明,该重组蛋白可以被SVCV阳性血清所识别.     

鸡CD4基因片段原核表达及其单抗制备

将PCR扩增的鸡CD4基因片段克隆到pET-32a原核表达载体,构建获得原核表达重组载体pET-32a-CD4.重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3),经过IPTG诱导表达,Ni-NTA亲和树脂纯化获得融合蛋白His-CD4.以此融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤细胞技术制备了1株能够稳定传代并分泌抗CD4多肽单抗的杂交瘤细胞株,命名为3E12.经检测该抗体亚类为IgG2b,单抗腹水的间接ELISA效价为1:105,Western blot结果显示单抗与CD4多肽能特异性地结合.     

水泡性口炎病毒M基因的克隆表达及多克隆抗体的制备

为制备水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)重组M蛋白的鼠源多克隆抗体,本研究将扩增的VSV-M基因插入到pET-28a载体中,构建了pET-28a-VSV-M原核表达载体,将其转化至大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达;SDS-PAGE和Western blot检测结果发现重组蛋白主要以包涵体形式存在,相对分子质量约为31 000。之后应用His GraviTrap 10prepacked gravity flow columns纯化重组M蛋白,并将其免疫小鼠,制备VSV重组M蛋白的多克隆抗体;间接ELISA方法检测其抗体效价为1∶12 800。将该抗体应用于VSV的检测,在稀释倍数为1∶800时仍可检测到清晰的条带,且大小与预期的一致,证实了其与病毒的特异性结合。结果表明,本研究成功构建了VSV-M蛋白的原核表达载体,将表达纯化后的VSV-M蛋白免疫小鼠成功制备了VSV-M蛋白的多克隆抗体,这为后期检测VSV-M基因的表达分布、功能特性及开发诊断试剂和疫苗的研制奠定了基础。     

猪白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过RT—PCR方法从用PHA和LPS刺激的猪脾脏细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA，克隆到T载体pUCm-T后，序列测定表明，pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474bp，编码157个氨基酸。将该基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a构建重组质粒pETIL18m，转化大肠杆菌BL21(DE3)，并用IPTG诱导。重组菌菌体裂解物SDS—PAGE可检测到相对分子质量为19000的重组蛋白，免疫印迹法证实该重组蛋白可以与人IL-18单抗发生特异性免疫反应。     

泰泽隐孢子虫CP15基因的原核表达及抗血清制备

将泰泽隐孢子虫(Cryptosporidium tyzzeri)CP15基因从pMD18-T-CP15重组质粒中切下,连接至pET-28a(+)原核表达载体,经酶切和测序鉴定正确后,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析,并将纯化的重组蛋白免疫ICR小鼠制备多克隆抗体。结果显示,重组表达载体pET-28a-CP15在大肠杆菌中以可溶形式表达,表达蛋白分子量约为17 kDa。Western blot显示重组蛋白能被泰泽隐孢子虫感染小鼠血清所识别。ELISA结果显示重组蛋白免疫小鼠血清能和泰泽隐孢子虫卵囊可溶性抗原特异性反应,表明获得的重组蛋白具有较好的抗原性。     

布鲁氏菌DnaJ蛋白的表达及功能分析

本试验旨在运用分子生物学与生物信息学方法对布鲁氏菌DnaJ蛋白进行分析;将该蛋白进行原核表达,并检验纯化蛋白在体外或体内诱导Th1和Th2型免疫反应的能力。以布鲁氏菌M5-90为模板成功扩增目的基因DnaJ,构建重组表达载体pET-30a-DnaJ;利用SDS-PAGE检测DnaJ重组蛋白在大肠杆菌中的表达,并对其进行纯化;用DnaJ蛋白刺激RAW 264.7细胞和小鼠脾细胞,并用DnaJ蛋白免疫小鼠;利用ELISA试剂盒检测细胞因子IFN-γ、IL-4及小鼠血清中IgG1和IgG2a抗体水平的变化。结果显示,DnaJ蛋白二级结构以无规则卷曲结构为主,该蛋白有11个抗原决定簇;SDS-PAGE结果显示,重组菌在37.7 kDa大小的位置有特异表达条带,获得了DnaJ纯化蛋白;DnaJ蛋白可诱导宿主细胞和小鼠产生高水平IFN-γ、IL-4、IgG1和IgG2a抗体。鉴于DnaJ蛋白可在体外或体内诱导Th1和Th2型免疫反应,有望成为布鲁氏菌病的候选亚单位疫苗。     

羊传染性脓疱病毒122蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

以提取的羊传染性脓疱病毒(ORFV)基因组为模版,PCR扩增ORFV122基因,并将该基因连接至原核表达载体pET-28a上,构建出pET-28a-122重组表达质粒。然后将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态,经IPTG诱导后成功表达出ORFV122蛋白。利用His标签可与镍离子结合的特性对ORFV122蛋白进行分离纯化。将纯化后的ORFV122蛋白免疫BALB/c小鼠,制备相应的多克隆抗体,并利用Western blot技术检测该抗体的特异性。免疫小鼠获得的抗ORFV122蛋白多克隆抗体经ELISA检测,其效价约为1∶80 000。此外,使用该抗体对ORFV122蛋白的表达规律进行了研究,发现ORFV122蛋白为早期表达蛋白。本试验获得的ORFV122蛋白多克隆抗体为以后ORFV122基因功能的后续研究奠定基础。     

鸡BCLl0基因的克隆与表达

通过电子克隆手段,克隆到大小为959 bp的cDNA序列.然后从鸡的脾脏提取RNA,用RT-PCR方法扩增出目的片段.将该片段连接到原核表达栽体pET-32a和真核表达载体pEGFP-C1中,采用SDS-PAGE检测原核表达载体pET-BCL10在大肠杆菌中的表达,脂质体转染法将真核表达载体pEGFP-BCL10转入vero细胞,Western blotting检测其在细胞中的表达.结果显示,PCR扩增到735 bp的DNA片段,原核表达载体和真核表达栽体经双酶切和核酸测序表明载体构建成功.SDS-PAGE电泳检测到pET-BCL10重组质粒在大肠杆菌中表达.western blotting检测到pEGFP-BCL10重组质粒在veto细胞中表达.结论表明,BCLl0基因在鸡体内存在,该基因的重组质粒能在大肠杆菌和vero细胞中表达.     

鸡BCL10基因的克隆与表达

通过电子克隆手段,克隆到大小为959bp的cDNA序列。然后从鸡的脾脏提取RNA,用RT-PCR方法扩增出目的片段。将该片段连接到原核表达载体pET-32a和真核表达载体pEGFP-C1中,采用SDS-PAGE检测原核表达载体pET-BCL10在大肠杆菌中的表达,脂质体转染法将真核表达载体pEGFP-BCL10转入vero细胞,Western blotting检测其在细胞中的表达。结果显示,PCR扩增到735bp的DNA片段,原核表达载体和真核表达载体经双酶切和核酸测序表明载体构建成功。SDS-PAGE电泳检测到pET-BCL10重组质粒在大肠杆菌中表达。Western blotting检测到pEGFP-BCL10重组质粒在vero细胞中表达。结论表明,BCL10基因在鸡体内存在,该基因的重组质粒能在大肠杆菌和vero细胞中表达。     

牛冠状病毒S蛋白抗原表位基因的串联表达及抗血清制备

为了构建牛冠状病毒(BCoV)抗原表位基因原核表达载体,并制备多克隆抗体,利用基因合成技术获得BCoV S蛋白两段抗原表位(351 aa～403 aa、771 aa～784 aa)的基因串联体R,将其重组到pET-28a(+)质粒中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达抗原表位融合蛋白,用纯化的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了BCoV抗原表位基因重组表达质粒,获得了融合蛋白的抗血清,Western-Blot检测显示,该抗血清可与BCoV的融合蛋白特异性结合。表明成功构建了BCoV抗原表位基因原核表达载体并获得了BCo V抗血清,本研究为BCoV诊断试剂盒的开发和BCoV多表位疫苗的研究奠定了基础。     

猪链球菌2型分解代谢控制蛋白A的克隆和原核表达

原核表达猪链球菌2型分解代谢控制蛋白A(catabolite control protein A,ccpA)并进行纯化,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。采用PCR方法,扩增ccpA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a中,转入大肠杆菌BL21中进行诱导、表达和亲和层析纯化;经Western blotting初步评价ccpA的抗原性。重组原核表达质粒pET-28a-ccpA经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约38000,能被相关抗体所识别。因此,能成功在大肠杆菌中表达猪链球菌2型ccpA,为猪链球菌2型相关调节蛋白的免疫学研究奠定基础。     

非洲猪瘟病毒B438L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒（ASFV）B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1（GenBank登录号：FR682468.1）公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a （+）载体,构建pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16 ℃经1 mmol/L IPTG诱导12 h,通过SDS-PAGE对重组蛋白表达形式进行分析;利用串联质谱技术鉴定重组蛋白是否正确表达;将纯化的p49重组蛋白免疫小鼠制备鼠源抗p49多克隆抗体,利用间接ELISA方法测定该多克隆抗体的效价,并以间接免疫荧光试验及Western blotting检测该多克隆抗体的特异性。结果显示,试验成功构建了pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经诱导表达获得了p49重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;串联质谱技术进一步证实该蛋白为p49。间接ELISA检测制备的鼠源抗p49多克隆抗体效价达1：64 000,间接免疫荧光试验及Western blotting结果表明制备的鼠源抗p49多克隆抗体能特异性识别p49蛋白。以上结果表明,该原核表达的ASFV p49重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的p49重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV p49蛋白的结构与功能、研制相关的ASFV诊断试剂及疫苗提供了生物材料。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp9基因的克隆与原核表达

通过PCR方法从重组质粒pSK-B2扩增得到非结构蛋白Nsp9的基因片段。将基因克隆至原核表达载体pET-28a( ),得到重组表达载体pET-28-Nsp9,转化Escherichia coliBL21(DE3)细胞。经IPTG诱导,Nsp9蛋白以包涵体形式表达,SDS-PAGE分析表明重组蛋白的分子量约为27.3 kD,表达量占菌体蛋白的43.2%。Western-Blotting结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究PRRSV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。     

家兔Ⅰ型肽载体(PepTⅠ)基因的克隆与原核表达

用real-time PCR方法扩增家兔PepTⅠmRNA序列,通过原核表达体外获得家兔PepTⅠ蛋白,旨在制备多克隆抗体。试验通过RT-PCR方法成功扩增出2 001bp的家兔PepTI基因片段,设计特异性引物成功扩增出抗原表位相对集中的1 071bp大小的片段,构建重组表达质粒,获得融合蛋白。结果显示:家兔PepTⅠ基因片段成功的连接到pMD18-T载体上,重组克隆载体双酶切后回收目的片段分别连接到原核表达载体pET-32a、pET-28a,经转化提取质粒测序验证后表明,成功构建原核表达载体pET-32a-P、pET-28a-P,将重组质粒转化至感受态细胞BL21(DE3)后IPTG诱导,成功表达出PepTⅠ融合蛋白,目的蛋白相对分子质量大小约为44 000,与预期试验结果相符。结果表明:本试验成功扩增出家兔PepTⅠmRNA序列,并且通过原核表达获得家兔PepTI融合蛋白。     

新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析

构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段.     

大约克猪SLA-1原核表达载体的构建及表达

为构建大约克猪SLA-1胞外区的原核表达载体及表达目的蛋白,试验设计1对引物,经PCR扩增获得大约克猪SLA-1胞外区基因（命名为SLA-1-DYKe）,将此片段克隆至pMD^®19-T Simple Vector,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切筛选阳性克隆菌并测序,将目的基因插入到原核表达载体pET-28a（+）中,转化至宿主菌BL21（DE3）进行诱导表达,用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况,大量诱导提取包涵体并检测。结果显示,PCR成功扩增SLA-1-DYKe的胞外区,得到大小为837 bp的目的基因,目的基因成功克隆至pMD^®19-T Simple Vector,并获得序列正确的重组质粒。以得到的重组质粒成功构建了SLA-1-DYKe/pET-28a（+）表达载体,目的蛋白大小约为34 ku。本研究成功构建了大约克猪SLA-1原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后研究大约克猪SLA-1的空间结构和基因功能奠定了基础。     

羊种布鲁氏菌Rev.1株VjbR基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

本研究旨在构建表达载体pET-30a-VjbR,进而表达布鲁氏菌VjbR蛋白;利用生物软件分析该蛋白生物信息学信息,为进一步研究该蛋白奠定基础。以布鲁氏菌Rev.1株基因组为模板,扩增VjbR基因序列,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pET-30a-VjbR,并进行原核表达、Western-blot检测及该基因的生物信息学分析。结果显示:本试验成功克隆并表达了VjbR基因;经对表达产物进行SDS-PAGE分析纯化,发现本试验得到较纯蛋白;经Western-blot检测,发现该基因表达蛋白可与布鲁氏菌羊阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性;通过生物信息学系列软件统计分析,发现VjbR蛋白无跨膜区,无信号肽,且该蛋白共有15个抗原决定簇,在二级结构中,α-螺旋的氨基酸有131个,占比为49.81%。布鲁氏菌VjbR基因的成功表达与纯化,为进一步制备该蛋白的单克隆抗体及iELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白多克隆抗体的制备及其中和活性研究

为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9蛋白鼠源多克隆抗体并检验其中和活性,试验采用RT-PCR方法扩增了PRRSV的Nsp9基因保守区域片段,将其克隆至原核表达载体pET-28a中,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达重组Nsp9蛋白;纯化后的重组Nsp9蛋白与弗氏佐剂充分混合乳化,采用皮下多点注射免疫Balb/c小鼠,经3次免疫后获得多克隆抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,以血清中和试验和间接免疫荧光试验检验其中和活性。结果表明:试验成功扩增了大小为951 bp的Nsp9基因片段,经双酶切和序列测定,重组表达质粒pET-28a-Nsp9构建成功;重组Nsp9蛋白的分子质量约为36.0 ku;制备的多克隆抗体效价较高,重组Nsp9蛋白多克隆抗体经2～8倍倍比稀释时,与PBS对照相比荧光数量递增。说明在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达了PRRSV重组Nsp9蛋白,制备的鼠源多克隆抗体有一定的抗PRRSV中和活性。     

绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。【方法】采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu基因中间的TGA密码子突变为TGG,并对测序结果与其他支原体参考株进行相似性比对和遗传进化分析,利用在线软件对其推测的蛋白序列进行生物信息学分析。将突变后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,利用镍柱亲和层析法纯化,以纯化的EF-Tu融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA和Western blotting检测多克隆抗体效价及免疫反应性。【结果】试验成功突变了EF-Tu基因中TGA位点,并构建了融合表达His标签pET-28a-EF-Tu′原核表达载体。生物信息学分析表明,克隆的EF-Tu基因与绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌株相似性最高,亲缘关系最近;编码387个氨基酸,无N-糖基化位点和跨膜区域,存在10...