桑原生质体分离技术的研究

用桑子叶、桑幼叶、悬浮培养细胞、愈伤组织四种材料，分别进行了原生质体的分离方法及有关条件的研究。结果在适宜酶溶液浓度下，桑原生质体的释放速度和产量顺序为，桑子叶＞幼叶＞悬浮培养细胞＞愈伤组织。酶液最适渗透剂浓度为０．５－０．６Ｍ的甘露醇。经预培养处理的材料，原生质体产量比对照提高１２．９倍。     

桑树原生质体培养再生植株

以桑籽经无菌继代培养的无性繁殖系叶片为材料，酶解分离得到原生质体；在Ｋ８ｐ液体培养基中，进行黑暗、静止、浅层培养，第４天细胞开始分裂，１０天以后形成细胞团；转移到弱光下培养，每隔１０天添加Ｋ８ｐ新鲜低渗培养液，经５－６周培养后形成大小不一的细胞团和小愈伤组织，转到含６－ＢＡ、ＮＡＡ的ＭＳＢ固体培养基上增殖培养，选取其中结构紧密、呈米黄色的愈伤组织在附加６－ＢＡ和ＮＡＡ的ＭＳＢ培养基上进行器管分化；在１／２ＭＳ附加ＩＢＡ的培养基上进行根的诱导，获得桑原生质体再生植株。     

桑树原生质体分离条件的优化试验

为了分离获取高产量、高活力的桑树原生质体,分别以桑树的组培苗细切叶片、胚性悬浮培养细胞、粗切愈伤组织和细切愈伤组织等为材料,采用正交试验和单因素试验的方法对桑树原生质体酶解分离条件中的分离酶液组合、渗透压调节剂、酶解温度、酶解时间等因素进行优化。最佳分离酶液组合为100 U/mL纤维素酶R-10+150 U/mL果胶酶Y-23+6 U/mL离析酶R-10+细胞-原生质体洗液(1 480 mg/L CaCl2.2H2O,27.2 mg/L KH2PO4),以0.6 mol/L甘露醇为渗透压调节剂,在28℃酶解温度条件下酶解6 h,用桑树胚性悬浮培养细胞作分离材料可获得7.8×106个/g的原生质体产量,且原生质体活力达91.4%。研究结果显示,选择合适的分离材料以及酶解分离条件是高效获取高活力桑树原生质体的关键。     

桑树原生质体产量与酶解时间和纤维素酶用量的关系调查

<正> 近十多年来,在生物科学方面,逐渐建立起植物原生质体培养的新技术,它是生物科学新成就之一。植物原生质体可以再生植株,可以吸收外源遗传物质,异源原生质体可融合并长成杂种植株,它将成为育种的新途径。原生质体也是细胞生物学、植物生理学、遗传学、病毒学和分子生物学基础研究的很好的实验材料,因而开展原生质体的研究,将有广阔的前景。桑原生质体的研究,在日本始于80年代初,我国近年来也开始研究。笔者对提取桑叶原生质体的酶解时间、纤维素酶的用量进行了初步研究,简报如后。     

桑树原生质体游离与培养

原生质体作为一种细胞水平的研究系统,由于原生质体没有细胞壁的特点,相对于组织、器官或个体水平有其特别之处。①可以排除细胞之间的相互影响,单独考察1个细胞的全能性(totipotency);②原生质体是1个均一性程度很好的群体,并且在短时间内就有可能获得大量的原生质体,如每1g叶片可以产生100万个原生质体。因此,是一个理想的实验系统,特别适合进行细胞定量的研究工作;③便于开展那些因细胞壁存在而难以进行研究的问题,如质膜的表面特性、细胞壁再生与细胞骨架、离子的吸收与转运(膜转运)、细胞周期、气孔开关机理(用保卫细胞原生质体可研究…     

高效碳铵对桑树的施用效果

<正>普通碳酸氢铵（以下简称普碳）多年来一直是我国农业生产的氮肥当家品种,约占氮肥总施用量的50～60％。普碳的物理性质差,氨挥发性大,氮素利用率低,在农业生产上浪费很大。长期以来,国内不少土肥科学工作者为提高氮肥利用率和施肥效益,在其施肥方法上进行了大量卓有成效的研究,但改进生产工艺方面的研究较少。为此,衢州化学工业公司研制了一种高效型氮肥——高效碳铵（以下简称高碳）,衢县农业局于1992年、1993年两年在多种作物上对其进行了应用试验,现将其在桑树上应用试验的初步结果总结于后。     

应用流式细胞技术鉴定桑树倍性的样品选择

利用流式细胞仪对桑树不同叶位的叶片、同一叶位的不同部位、叶芽和种子胚根等进行倍性测定,筛选合适的桑树倍性鉴定材料。结果表明,未完全展开幼叶的检测效果优于第1叶位叶和第2叶位叶,第1叶位叶的检测效果优于第2叶位叶;同一叶位幼叶叶基部分的检测效果优于叶尾部分;叶芽的检测效果最好,而且制备样品的杂质较少,是用于流式细胞术研究的最佳材料。胚根也可以作为流式细胞仪检测的材料,这为更早检测桑树的倍性提供了候选材料。研究结果为选取不同时间段的不同材料进行桑树倍性检测提供了依据,也为其他植物倍性鉴定取材提供了参考。     

桑悬浮细胞原生质体培养的研究

采用继代培养三个月后的桑子叶悬浮细胞为材料,进行了原生质体的分离和培养。桑悬浮细胞在纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶的混合溶液中,酶解获得产量高、活力强的原生质体。原生质体在K8p(附加6—BA、NAA、2,4—D、LH)液体培养基中,再生细胞经多次分裂,得到肉眼可见的小愈伤组织。再通过增殖继代培养,获得浅黄色、具有明显颗粒结构的愈伤组织,转至各种激素含量的MSB固体培养基中,尚未获得绿苗分化。     

桑树大豆带状套种绿色高效种植技术研究

在桑树夏伐后,开展大豆带状套种,到秋季成熟采收时大豆株高74.249 cm,单株总生物量0.218 kg,单株豆荚数81.332个,单株豆荚质量0.104 kg,总生物量2.677 kg/m2,豆荚数999.500个/m2,豆荚质量1.265 kg/m2,百粒鲜重0.500 kg/m2,总苗数12.833棵/m2,鲜大豆总重0.548 kg/m2,干大豆总重0.269 kg/m2。以鲜食大豆进行采收,单位面积（666.67 m2）桑园可产出大豆总生物量1176.165 kg,豆荚454.730 kg;以成熟大豆进行采收,大豆总生物量892.458 kg,鲜大豆182.392 kg,干大豆89.680 kg。     

桑树高效扦插育苗技术的研究进展

从影响扦插发根的环境条件、插穗内在品质、扦插基质、内源物质、生根剂等方面综述国内外桑树扦插育苗技术的研究进展,分析桑树扦插快繁育苗存在的问题,提出相应的对策及桑树育苗规模化、工厂化生产技术的研究方向。     

桑树内生真菌Macrophomina phaseolina MOD-1原生质体制备条件的优化试验

为了应用原生质体技术改良桑树内生产油真菌Macrophomina phaseolina MOD-1的产油性能,对影响MOD-1原生质体制备的酶液组分、菌龄、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂种类等因素进行优化。通过正交试验得到最佳酶液组合为:20mg/mL纤维素酶+20 mg/mL溶菌酶+5 mg/mL蜗牛酶。在此基础上应用响应面分析法获得影响MOD-1原生质体产量的显著因素有菌龄和渗透压稳定剂浓度,且均产生负效应。以此作为中心点进一步优化原生质体制备条件为:培养44.58 h的MOD-1菌丝,用0.66 mol/L KCl作渗透压稳定剂,30℃条件下酶解4 h。在此优化条件下,获得的MOD-1菌株原生质体产量可达7.06×106个/mL,优化条件具有实用价值。     

华南象草原生质体分离及基因瞬时表达研究

以华南象草(Pennisetum purpureum)幼叶鞘为材料,采用L₁₆(4⁵)正交试验设计,对分离原生质体过程中的纤维素酶浓度、离析酶浓度、酶解液pH、甘露醇浓度、酶解时间5个因素进行筛选,建立了高效的象草叶鞘原生质体分离体系,并进行目标基因的瞬时转化,以期为象草基因功能研究奠定基础。结果表明:叶鞘在含有1.5%纤维素酶R-10,0.75%离析酶R-10,0.5 mol·L^-1 甘露醇,pH为5.8的酶解液中酶解4 h,原生质体产量达5.11×10⁶个·g FW^-1,活力达91.08%,酶解时间对象草原生质体产量和活力的影响最大。用PEG介导法将2个分别带有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的载体转入原生质体中,转化效率最高可达77.47%,共转化效率为8.79%。所分离的原生质体可用于基因的瞬时表达研究。     

家蚕病原白僵菌原生质体分离条件的研究

调查研究了家蚕病原白僵菌（Beauveriabassiana）原生质体的分离制备条件。以6mg／mLDriselase液为酶解液，以0.7mol／LNaCl液（pH5．8）为渗透压稳定剂，在30℃下轻轻振荡处理1．5h，能从家蚕病原白但菌嫩菌丝中分离出2～4×107个／mL原生质体，这是家蚕病原白鹰菌原生质体的最适分离条件。     

利用流式细胞术鉴定桑树染色体倍性的方法

利用流式细胞术可以快速、准确地鉴定植物染色体倍性,但需要针对不同植物样本的制备及具体操作对应用方法进行选择和优化。为了建立适合桑树染色体倍性快速鉴定的流式细胞术应用方法,以桑树幼叶为材料,比较以不同解离液及机械解离方法和不同离心漂洗次数制作样本用流式细胞术检测的效果,并用不同染色体倍性桑品种的幼叶为材料,以效果最佳的方法进行验证试验。优化的样本制备方案为:采集0.2 g桑树幼叶,置于预冷的平面玻璃上,加入Mg SO4解离液后,用双面刀片快速切碎,转移至培养皿中静置3~5 min,用300目细胞筛网过滤至1.5 m L离心管中,得到500μL单细胞核悬浮液,再加入PI溶液(最终质量浓度为50μg/m L)和RNase A溶液(最终质量浓度为30μg/m L),4℃避光环境下染色30 min,经300目细胞筛网过滤后用流式细胞仪检测。如果采集叶片后不能立即进行检测,可在-80℃下保存待测。试验结果还表明,用在-80℃保存10 d和40 d的冷冻幼叶与用新鲜幼叶制备的样本所得到的检测效果相似。初步建立的适合桑树染色体倍性鉴定的流式细胞术应用方法效果最佳,具有细胞碎片少、主峰清晰、杂峰少等优点。     

植物原生质体分离及培养早期阶段损伤和修复机理的研究

作者首次提出植物原生质体早期阶段培养的本质是遭受损伤的植物细胞完成其自身修复的过程。并从自由基代谢、次生物质(包括植物防御因子、丹宁、酚类物质等)的代谢、蛋白酶的合成和分解、及基因表达的调控等不同层次阐述植物原生质体培养早期阶段损伤和修复的过程。及其这些过程发生变化对植物原生质体培养产生的影响作用。作者展望。藉以这些方面研究的深入,可为建立针对性较强的培养技术和方法提供实验依据,这对增强植物原生质体培养技术实验的稳定性,发展和应用该技术进行作物和牧草的遗传改良,都具有重要的意义。     

桑树多倍体诱导方法的探讨

<正> 1819年,Pelletier 和Caventon发现秋水仙碱后一百多年,Dixon和Malden(1908年)发现秋水仙碱能搅乱细胞的正常分裂。1937年,Dustin 等以小麦、葱等作材料,用秋水仙碱处理后,发现能抑制纺缍丝的形成。同年,Blakaslee 和 Avery 便开始用秋水仙碱创造多倍体的研究。1948年,关博夫首先将该项技术应用于桑的多倍体诱导。70年代末,我国杨今后等也进行了研究,并培育出一些具有优良性状的多倍体桑。近两年来,笔者对多倍体的诱导也进行了一些试验,现结合本人的实践,谈几点体会和看法。     

小鼠胚胎计数方法的研究及应用

胚胎细胞计数是评定胚胎活力,检验胚胎体外操作方案和培养效果的常用方法。实验以昆明小鼠体内发育胚胎和体外聚合囊胚为实验材料,对几种细胞的计数方法及应用进行了详细的研究。结果表明:（1）低渗压片法的实验效果最佳。（2）根据形态学观察,结合细胞计数,可以把小鼠8-细胞以后胚胎划分为:8-细胞晚期[细胞数目为（11.9±0.65）个];同一时间收集的桑椹胚和早期囊胚细胞数目相似;不同时间收集的囊胚细胞有明显差异。（3）细胞计数分析表明:8-细胞聚合胚发育形成聚合囊胚时,其细胞数目未发生调整。