人工雌性激素己烯雌酚单克隆抗体的制备及表征

合成了己烯雌酚的半抗原CP-DES,并将半抗原与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共价偶联制备免疫原和包被原。将免疫好的Balb/c小鼠脾脏细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选出了1株能稳定分泌己烯雌酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D87C412C7。分析该杂交瘤细胞的染色体,并以间接酶联免疫吸附分析法(iELISA)检测了单克隆抗体免疫球蛋白的类型。获得的杂交瘤细胞的平均染色体数目为45-50对左右,它分泌IgG1亚类的单克隆抗体。该细胞株体外传代和冻存复苏后抗体分泌稳定,细胞上清效价大于640,诱导腹水效价大于108,该单克隆抗体的检测限IC20=2.3ng/ml,与己烯雌酚结构类似物存在一定的交叉反应,与两种载体蛋白(BSA,OVA)无交叉反应。本研究为己烯雌酚ELISA检测方法的建立提供了条件。     

松材线虫单克隆抗体的研制

利用松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)匀浆液免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合获得一株能稳定传代并分泌抗松材线虫单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为1D3，经ELISA检测其特异性好、效价达到1∶5.12×105，抗体类型为IgG1亚类。Western blot 分析表明，1D3 单克隆抗体株与松材线虫匀浆液有明显反应。单克隆抗体的制备成功为准确地鉴定松材线虫提供了一种快速、灵敏和有效的诊断方法。     

庆大霉素单克隆抗体的研制及ELISA分析方法的建立

用与牛血清蛋白(BSA)交联的庆大霉素人工抗原(GM-BSA)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选、克隆,得到1株能稳定分泌抗庆大霉素单抗的杂交瘤细胞株(6H8),经鉴定6H8的抗体类型及亚类均为IgG1,其轻链为κ链.制备单克隆抗体腹水,腹水的间接ELISA效价在1×10-7以上.该单克隆抗体与庆大霉素结构类似物均无交叉反应,具有高度特异性.以制备的单抗建立间接竞争ELISA方法,其线性回归方程为y=16.122ln(x)-2.0143(R2=0.9934),抑制中浓度IC50为25.2μg·L-1,最低检测限IC20为3.9μg·L-1.竞争ELISA方法检测鲜奶中的庆大霉素平均回收率在92％～110％之间.抗庆大霉素单抗的制备和竞争ELISA方法的建立为庆大霉素快速检测奠定了基础.     

兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白A(OmpA)重组蛋白单克隆抗体的制备及潜在应用

制备兔多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)外膜蛋白A(OmpA)重组蛋白单抗,为兔多杀性巴氏杆菌病的诊断提供特异性强,灵敏度高的单克隆抗体。本研究选取并扩增Pm外膜蛋白基因OmpA,原核表达获得了的大小为37.6kD的OmpA重组蛋白,以纯化复性的兔多杀性巴氏杆菌OmpA重组蛋白作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),取其脾细胞与SP2/0细胞融合,ELISA筛选出了4株分泌Pm OmpA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为5D2、BC11、2A2和6A4。其中2A2细胞培养液效价为1∶256,5D2、BC11和6A4效价为1∶128;2A2腹水效价为1∶12800,其余3株达1∶6400。杂交瘤细胞经反复冻存、复苏及多次传代,仍能稳定分泌高效价抗体。Western blot显示,4株单克隆抗体均能与Pm OmpA重组蛋白重组发生特异性反应。用ELISA方法鉴定2A2单克隆抗体亚型为IgG2b,Protein A亲和纯化2A2腹水抗体,获得的单抗浓度为130μg/mL。选取纯化的2A2单克隆抗体进行潜在应用研究,Western blot与间接免疫荧光结果显示,单克隆抗体能与兔多杀性巴氏杆菌分离菌株发生特异性反应。表明利用体外重组表达兔多杀性巴氏杆菌OmpA融合蛋白制成的杂交瘤能够稳定分泌效价高、特异性强的单克隆抗体,可用于兔多杀性巴氏杆菌诊断,本研究结果为兔多杀性巴氏杆菌诊断试剂盒的研制提供技术参数。     

用合成多肽为半抗原制备Bt Cry1Ab的单克隆抗体

由于Bt Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac晶体蛋白之间具有很高的同源性(82%~90%),采用常规的单抗制备方法很难制取特异性强的Bt Cry1Ab单抗,为了制备抗Bt Cry1Ab蛋白的特异性单克隆抗体(MAB),本研究从NCBI获得了Bt Cry1Ab蛋白的氨基酸序列,根据ANTHEPORT和DNAStar软件对其抗原性、亲水性和表位性分析结果选定BtCry1Ab特异性肽段进行人工合成,并将其偶联于匙孔血蓝蛋白(KLH)免疫动物,应用细胞融合技术制备了抗该肽段的杂交瘤细胞22株。通过ELISA试验从中筛选出与Bt Cry1Ab天然蛋白产生特异性反应的单克隆抗体杂交瘤细胞株一株(3A10)。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG1型;轻链属κ型;杂交瘤细胞株染色体数目为89~108条;用其制作的腹水对Bt Cry1Ab合成肽的反应效价为1∶1×107;对Bt Cry1Ab天然蛋白的反应效价为1∶1×104;纯化后的抗体对Bt Cry1Ab合成肽的效价为1∶1×108;对Bt Cry1Ab天然蛋白的效价为1∶2×104。抗体的相对亲和力为0.5μg/mL,对Bt Cry1Ab蛋白的最低可检测值为10ng/mL。ELISA结果显示,3A10杂交瘤细胞株所分泌的MAB能特异性识别合成肽和Bt Cry1Ab蛋白,而对同源的Cry1Ac和Cry1Aa蛋白无交叉反应;本研究所制备的Bt Cry1Ab单克隆抗体能够对常规棉和抗虫棉(Gossypium hirsutumL.)进行有效的区分,并且能特异性的识别其中的Bt Cry1Ab蛋白。     

马γ-干扰素单克隆抗体的制备及其特性的鉴定

摘要：将原核表达的重组马-干扰素成熟蛋白（mEIFN-）免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以昆虫杆状病毒表达系统获得的重组马-干扰素作为检测抗原进行间接ELISA检测,共筛选到15个阳性细胞株。分别经过3轮亚克隆后,最终得到了12株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用间接免疫荧光（IFA）实验对12株单克隆抗体进行鉴定,结果证实所获得的12株细胞分泌的抗体均为针对马-干扰素的特异性抗体。单克隆抗体亚型鉴定结果显示,4株为IgG1、2株为IgG2a、3株为IgG2b、3株为IgM,而且所有单克隆抗体的轻链均为链。将此12株单克隆抗体分别与用原核系统分节段表达的重组马-干扰素GST-mEIFN-(1-84)、GST-mEIFN-(80-146)蛋白进行特异性ELISA检测,结果表明有7株单克隆抗体识别GST-mEIFN-(1-84),而另5株单克隆抗体与GST-mEIFN-(80-146)发生反应,说明所获得的12株单克隆抗体至少针对两个或两个以上不同的抗原表位。这将为今后建立马-干扰素检测方法、监测机体免疫状态和研究机体免疫机制奠定了基础。     

马白细胞介素-18单克隆抗体的制备及其特性的初步鉴定

摘要：利用纯化的用原核系统表达的重组马白细胞介素-18成熟蛋白(pET-mEIL-18)抗原免疫BALB/c 小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，同时以昆虫杆状病毒表达系统获得的马白细胞介素-18成熟蛋白(mEIL-18)作为抗原进行间接ELISA检测，筛选并最终得到了9株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用IFA试验对9株单克隆抗体进行鉴定，结果证实所获得的9株细胞分泌的抗体都是针对mEIL-18的特异性抗体。将此9株单克隆抗体分别与用原核系统分段表达的重组马白细胞介素-18成熟蛋白pET-mEIL-18-(1)(mEIL-18 1～78位氨基酸残基)和pET-mEIL-18-(2)(mEIL-18 79～157位氨基酸残基)蛋白进行特异性ELISA检测，结果表明，9株单克隆抗体有5株识别表达的pET-mEIL-18-(1)(mEIL-18 1～78位氨基酸残基)，而另外4株单克隆抗体与pET-mEIL-18-(2)(mEIL-18 79～157位氨基酸残基)发生反应，说明所获得的9株单克隆抗体至少针对pET-mEIL-18 2个或2个以上不同的抗原表位。单克隆抗体亚型鉴定试剂盒的鉴定结果显示，除M1F11、M3A11和N7D9为IgM，其余的单克隆抗体均为IgG1，而且所有单克隆抗体的轻链均为?资链。     

小反刍兽疫N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA方法的建立

小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种危害严重的急性接触性传染病。为了检测血清中存在的抗PPRV的抗体,本研究利用纯化后的真核表达的PPRVN蛋白重组蛋白(rBacmid-PPRN)作为免疫原免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),并使用原核表达的PPRVN蛋白重组蛋白(rpET-PPRN)作为间接ELISA检测抗原,共筛选得到8株抗PPRVN蛋白的单克隆抗体(mAb)。其中1D5单抗腹水效价达1∶106,分泌单抗亚类为IgG2b。以1D5作为竞争抗体、纯化后的rpET-PPRN蛋白作为包被抗原,建立了检测小反刍兽疫血清抗体的单抗竞争性ELISA(c-ELISA)方法。所建立的c-ELISA方法能够特异性的区分牛瘟阳性血清和小反刍兽疫阳性血清,并具有较高的灵敏度和特异性。应用建立c-ELISA检测方法检测共129份山羊(Capra hircus)血清样品,与标准c-ELISA试剂盒的符合率为96.9%。本研究成功地建立了可特异性检测动物血清中抗PPRV抗体的竞争性ELISA方法,对小反刍兽疫的诊断、疫苗免疫水平的监控及控制其流行具有重要意义。     

抗鸡贫血病毒结构蛋白单克隆抗体制备及其对应抗原表位分析

以纯化的原核表达的鸡贫血病毒结构蛋白为抗原，免疫6-8w的雌性Balb/c鼠, 经过三次免疫后，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，以纯化的蛋白为抗原进行ELISA检测，将阳性细胞孔经过三次有限稀释，共获得6株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株。间接免疫荧光试验证实6株单抗可以与鸡贫血病毒感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应，Western blot结果显示单抗与杆状病毒表达的VP1重组蛋白可以发生特异性反应。利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行亚型鉴定，结果表明6株单抗均为IgG1亚型，且所有单抗的轻链均为κ链。用单克隆抗体对分段表达的VP1蛋白进行免疫印迹分析，初步鉴定了筛选出的单抗所对应的抗原表位，其中有四株单抗识别的表位位于VP1 218-274位氨基酸之间，另外两株单抗识别的表位分别位于275-301位、324-369位氨基酸之间。     

抗CPV-2a单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

犬细小病毒病是危害养犬业的重要传染病之一,患病犬难以治愈。单克隆抗体治疗此病效果明显,本文介绍了制备抗CPV-2a单克隆抗体的方法。用纯化的犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）2a型分离株免疫新西兰大白兔和Balb/c小鼠制备抗CPV-2a多克隆抗体及单克隆抗体。经亚克隆得到1H9、2B5、2B7和2C7共4株单抗,Western blotting鉴定单抗的免疫反应性;间接ELISA方法检测单抗的特异性。为了快速对犬细小病毒病作出诊断,建立了CPV-2a双抗夹心ELISA方法。兔多抗作为捕获抗体,鼠单抗作为示踪抗体,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG作为检测系统;捕获抗体和示踪抗体最佳稀释度分别为1：800和1：2000;检测系统最佳稀释度为1：4000。结果表明：所得4株单抗与pET-32a-VP2蛋白发生特异性反应,且与狂犬病毒（RV）、犬温热病毒（CDV）不交叉反应;建立的双抗夹心ELISA方法对病毒的最低检出量为4.375μg/mL,与美国RB试剂盒相比,符合率为95%。单抗制备为犬细小病毒病的治疗奠定了基础;双抗夹心ELISA方法的建立为疑似粪便样本提供了简单、快速和可靠的检测手段。     

Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for the organophosphorus insecticide bromophos-ethyl

A competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed for the quantitative detection of the organophosphorus insecticide bromophos-ethyl. Four bromophos-ethyl derivatives (haptens) were synthesized and were coupled to carrier proteins through the pesticide thiophosphate group to use as an immunogen or as a coating antigen. Rabbits were immunized with either one of two haptens coupled to bovine serum albumin for production of polyclonal antibodies, and the sera were screened against one of the haptens coupled to ovalbumin. Using the serum with highest titer, an antigen-coated ELISA was developed, which showed an IC(50) of 3.9 ng/mL with a detection limit of 0.3 ng/mL (20% inhibition). An antibody-coated ELISA using an enzyme tracer was also developed, which showed an IC(50) of 6.5 ng/mL with a detection limit of 1.0 ng/mL (20% inhibition). The antibodies showed negligible cross-reactivity with other organophosphorus pesticides except with the insecticides bromophos-methyl and chlorpyrifos in the antibody-coated assay only. Recoveries of bromophos-ethyl from fortified crop and water samples ranged from 82 to 128% and from 95 to 127%, respectively.     

抗二氟沙星单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR技术,从抗二氟沙星单克隆抗体X1杂交瘤细胞株总RNA中扩增VH和VL基因片段,克隆入pUC18载体,测序进行（X1）可变区基因的克隆及序列分析。通过互联网检索发现VH和VL基因与Ig同源,分别符合小鼠IgVH和Igκ基因特征。VH基因全长363bp,编码121个氨基酸;VL基因全长为348bp,编码11...     

毒死蜱对棉花根际土细菌群落多样性和结构的影响

通过室内盆栽试验模拟自然环境条件,采用高效液相色谱(HPLC)和末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术,研究了土壤使用推荐剂量(5 mg·kg~(-1))及推荐剂量的2倍、3倍和4倍(10 mg·kg~(-1)、15 mg·kg~(-1)、20 mg·kg~(-1))毒死蜱对棉花根际土壤细菌群落多样性和结构的影响,以不施用毒死蜱的土壤为对照。结果表明,5 mg·kg~(-1)、10 mg·kg~(-1)、15 mg·kg~(-1)和20 mg·kg~(-1)毒死蜱在土壤中的半衰期分别为10.04 d、11.36 d、11.55 d和12.16 d,60 d时基本完全降解。毒死蜱处理60 d后,棉花生物量显著降低;毒死蜱浓度越高,棉花生物量越低。无毒死蜱条件下不同取样时间根际细菌多样性无显著差异,毒死蜱处理组前30 d细菌多样性均显著降低,60 d时毒死蜱处理组细菌多样性恢复到正常水平。研究发现毒死蜱浓度越高对细菌多样性抑制作用越显著,恢复越缓慢。主成分分析结果发现,第10 d、30 d和60 d毒死蜱处理组与对照组细菌群落结构差异显著,其中60 d时20 mg·kg~(-1)毒死蜱处理组差异最显著,即使土壤中毒死蜱完全降解,根际细菌群落结构仍不会恢复到正常水平。60 d时,被毒死蜱抑制的细菌有硝化刺菌属(Nitrospina sp.)和Cellulophaga sp.等,被激活的有芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和链霉菌属(Streptomyces sp.)等。可见,毒死蜱的引入,重新构建了土壤细菌群落结构,显著影响棉花生长,对棉花根际土壤微生态环境冲击较大,应对其生态安全性予以重视。     

海藻酸钠固定化细菌对毒死蜱的降解特性

毒死蜱的生产和使用日趋广泛,由其造成的环境污染和危害不容忽视。微生物是影响有机磷农药在环境中降解的最主要因素,也被认为是降解有机磷农药最可靠而高效的途径。固定化技术是提高微生物降解农药效率的有效方法之一。本研究以海藻酸钠为载体,采用注射器滴定法将蜡状芽孢杆菌(Bacillus cer-eus)HY-1用海藻酸钠溶胶包埋,研究了反应时间、固定化菌接入量、pH和毒死蜱初始浓度对毒死蜱降解的影响以及固定化菌的重复使用效果。结果表明:海藻酸钠固定化菌能够高效降解基础培养基中的毒死蜱,制备固定化小球海藻酸钠溶胶的最适浓度为2.5%(w/v),小球的平均粒径为3 mm。在培养时间为60 h时,固定化菌对100 mg·L-1毒死蜱的降解率达到最大。固定化小球接入量为160 g·L-1时,对100 mg·L-1毒死蜱的降解率最高。固定化菌对毒死蜱的降解有着较宽泛的pH适应范围,碱性环境更有利于其对毒死蜱的有效降解。当毒死蜱初始浓度为80 mg·L-1和100 mg·L-1时,固定化菌对毒死蜱的降解率较高,达90%左右。固定化菌可重复利用降解毒死蜱,当利用4次后,固定化小球虽已发生崩解,但对100 mg·L-1毒死蜱的降解率仍高达47%。因此,海藻酸钠固定化蜡状芽孢杆菌对水体中毒死蜱的降解率较高,环境适应性较强,固定化菌可在毒死蜱污染的净化去毒方面发挥重要作用。     

Evolution of chlorpyrifos, fenarimol, metalaxyl, penconazole, and vinclozolin in red wines elaborated by carbonic maceration of Monastrell grapes

The influence of the different steps involved in the wine-making process on the disappearance of chlorpyrifos, fenarimol, metalaxyl, penconazole, and vinclozolin in red wines elaborated by carbonic maceration of Monastrell grapes was studied. The initial levels of the residues in grapes ranged from 0.28 mg/kg (penconazole) to 1 mg/kg (chlorpyrifos). Ten days after the beginning of maceration, the compound that had decreased least was chlorpyrifos (83% of initial value remaining), whereas metalaxyl, the least persistent of the residues, had decreased to 49% of its initial value. In the free-run juice, on the other hand, the highest percentage remaining corresponded to metalaxyl (10%) and the lowest to chlorpyrifos (0. 1%). After pressing, the percentages of initial values eliminated in pomace varied from 82.7% for chlorpyrifos to 17.7% for metalaxyl, whereas in the press juice the opposite was the case (37% metalaxyl and 2% chlorpyrifos remaining). In finished wine, there were residues of all the pesticides, with the exception of chlorpyrifos, metalaxyl (21%) being the most persistent. The percentages eliminated in the lees varied from 1.5 to 2.5% of the initial value.     

不同污染条件下毒死蜱在蚯蚓体内的蓄积特征及其生长影响

以皮质远盲蚓(Amynthas corticis)为试验生物,采用一次、叠加的污染方式,研究了毒死蜱在土壤中的残留、蚯蚓体内的累积特征及对蚯蚓生长的影响.结果显示:相同实验浓度条件下,以叠加污染方式进入土壤的毒死蜱残留量低于一次污染方式的残留量.当土壤毒死蜱浓度为12～20 mg kg-1,暴露55d时,一次污染条件下...     

两株蜡状芽孢杆菌对毒死蜱的降解动力学研究

利用微生物消除农药污染是一项安全、经济、有效的方法,降解动力学模型的构建有助于理解污染物的生物降解行为和估测系统中特征污染物的浓度变化,菌株对高浓度污染物的降解效果是降解菌在受污染水体中实际应用的关键。本研究采用基础培养基中定量添加毒死蜱和定时取样分析毒死蜱残留浓度的方法,探讨两株蜡状芽孢杆菌(HY-1和HY-2)的接种体培养时间、接种量和降解菌对毒死蜱的降解动力学,同时研究了降解菌对高浓度毒死蜱的降解率。结果表明:HY-1和HY-2最适接种体培养时间分别为10 h和19 h,接种体培养时间对菌株降解毒死蜱的影响较大。两菌株最适接菌量为8%(v/v),接种量从4%增至8%时,接种量对HY-1降解毒死蜱的影响大于HY-2。当毒死蜱的初始浓度为40 mg.L 1、80 mg.L 1、100 mg.L 1和120 mg.L 1时,一级动力学方程ln(C0/Ct)=kt可以用来拟合两菌株对毒死蜱的降解动力学及确定降解动力学参数,当毒死蜱初始浓度再次增加时,仅HY-2对毒死蜱的降解符合一级动力学方程。当毒死蜱初始浓度为40~120 mg.L 1时,菌株HY-1对毒死蜱的降解速率常数分布在0.013 5~0.015 7;当毒死蜱初始浓度为40~200 mg.L 1时,菌株HY-2的降解速率常数分布在0.008 0~0.015 3。菌株HY-2比HY-1可以在较高的毒死蜱浓度下发挥降解作用,且降解率较高。因此,两菌株在毒死蜱污染水体的净化去毒方面具有重要意义。     

两种叶菜类蔬菜对毒死蜱的吸收转移规律

采用水培方法,研究了毒死蜱对两种叶菜类蔬菜菠菜和生菜生长的影响、在不同培养液中的降解速度以及在蔬菜中的吸收和转移规律。结果表明,低浓度毒死蜱（1.0和10.0mg·L^-1）对两种供试蔬菜的生长没有明显影响,但高浓度毒死蜱（100.0mg·L^-1）对两种蔬菜的生长均有一定的影响,而且生菜对毒死蜱较菠菜更为敏感。两种蔬菜均能明显促进毒死蜱在溶液中的降解,在不同溶液中的降解速度如下：菠菜-培养液〉生菜-培养液〉塘水〉培养液。两种供试蔬菜对毒死蜱均有很强的吸收能力,而且具有相似的吸收规律。毒死蜱在菠菜根中达到最大吸收值所需的时间比生菜根所需的时间短,但在茎和叶中所需的时间两种蔬菜相同。     

两种不同剂型毒死蜱对四种环境生物的毒性评价

按照化学农药环境安全评价试验准则方法,测定了40%毒死蜱乳油和30%毒死蜱微囊悬浮剂对鱼类、鸟类、家蚕和蜜蜂4种环境生物的毒性。结果表明,毒死蜱乳油对斑马鱼LC50值（96 h）为0.68 mg.L^-1,毒死蜱微囊悬浮剂的LC50为47.30 mg.L^-1;毒死蜱乳油对鹌鹑的毒性LD50为7.45 mg.kg^-1,毒死蜱微囊悬浮剂的LD50为56.97 mg.kg^-1。食下毒叶法结果表明,毒死蜱乳油对2-4龄家蚕幼虫LC50值（48 h,25℃）分别为0.82、1.87 mg.L^-1与4.35 mg.L^-1,毒死蜱微囊悬浮剂为2.48、4.22 mg.L-1与8.35 mg.L^-1;家蚕幼虫在药膜上爬行1、10、30 min与60 min后,毒死蜱乳油对3龄家蚕幼虫的LD50值（48 h,25℃）分别为3.18、0.68、0.41μg.cm^-2与0.38μg.cm^-2,其微囊悬浮剂LD50值分别为6.92、1.58、1.18μg.cm^-2与0.48μg.cm^-2;毒死蜱乳油和微囊悬浮剂对蜜蜂48 h的LC50分别为0.53 mg.L^-1和2.32 mg.L^-1。上述结果表明,毒死蜱微囊悬浮剂对4种环境生物的安全性明显高于乳油。