广东珠三角地区H9亚型禽流感病毒HD株的分离鉴定

在广东珠三角地区某鸡场取样,接种SPF鸡胚后获得1株病毒HD株,经HA和HI检测为H9亚型禽流感病毒阳性。HA基因分析显示,HD株HA基因核苷酸序列和氨基酸序列均与近年来国内流行的GX55等4.2.5分支H9亚型禽流感病毒相似性高,分别为94.1%~97.6%和95.8%~98.2%,而与国内常用疫苗株F、SS、SD696等4.2.3分支病毒相似性较低,分别为88.9%~89.8%和91%~91.6%。试验表明HD分离株属于4.2.5分支,与近年来国内H9流行株类似,而与常用疫苗株存在一定差异。     

1株广西鸡H_9亚型禽流感病毒的分离鉴定和HA基因分析

从广西某鸡场的发病鸡群中采样病料,接种10日龄SPF鸡胚后分离得到1株病毒,并命名为GL株,经微量血凝和微量血凝抑制检验为H9亚型禽流感病毒。测序结果分析显示,HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为RSSR↓GLF,与低致病性禽流感病毒的基序一致。HA基因分型结果表明,GL株属于4.2.5分支。BLAST结果显示,HA基因序列与BJ0309株相似性最高,达99%。相似性比较结果表明,HA基因、蛋白与近年来国内流行的GX55等4.2.5分支H9亚型禽流感病毒相似性较高,分别为94.1%~98.8%和96.4%~99.3%,而与国内常用疫苗株SS、F、SD696等4.2.3分支H9亚型禽流感病毒相似性较低,分别为88.8%~89.8%和91.2%~92%。由此可见,分离的GL株属于4.2.5分支,与近年来国内流行株类似,并与常用疫苗株存在了一定的差异。     

1株鸡H9亚型禽流感病毒的分离鉴定和HA基因序列分析

从广东珠三角地区某鸡场采样,接种SPF鸡胚后分离到一株病毒,经HA和HI检验为禽流感病毒H9亚型阳性,命名为A/chicken/Guangdong/JL/2014(简称为JL)。HA基因测序后分析显示,JL株HA基因、蛋白与近年来国内流行的GX55等4.2.5分支H9亚型禽流感病毒相似性高,分别为90.9%~97%和93.4%~99.5%,而与国内常用疫苗株SS、F、SD696等4.2.3分支病毒相似性较低,分别为85.8%~88.1%和88.4%~89.1%,其中与RZ853株相似性最高,达97%。试验表明,分离的JL株属于4.2.5分支,与近年来国内流行株类似,与常用疫苗株存在一定差异。     

H9亚型禽流感病毒山西株的分离鉴定及其HA基因的遗传进化分析

从山西省某些鸡场采集疑似病料,接种SPF鸡胚后分离病毒,采用A型流感病毒通用引物进行HA基因的扩增,并连接T载体克隆后进行序列测序和遗传进化分析。结果显示:获得4株H9亚型禽流感病毒完整HA序列,开放阅读框1 683nt,编码560个氨基酸,各自之间核苷酸同源性较高,达95.5%~99.6%,且推导的氨基酸同源性介于92.0%~99.6%之间;遗传进化分析结果显示该4株属4.2.5分支,与国内常用疫苗株4.2.3分支存在一定差异,但仍属于4.2大分支;HA蛋白的裂解位点氨基酸顺序为RSSR↓GLF,为低致病性禽流感病毒,并且含有7个潜在的N-糖基化位点以及8个受体结合位点。结果表明:本试验分离的H9亚型禽流感病毒与近年来流行毒株HA基因同源性及蛋白关键位点相似性较高。     

2022年山东地区商品肉鸡15株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传演化分析

为了解2022年商品肉鸡H9N2亚型禽流感病毒在山东地区的流行情况,选取了15株分离鉴定的H9N2亚型禽流感毒株,对其HA基因进行序列测定和分子特征分析,并应用软件Mega6.0绘制HA基因进化树,进行遗传进化分析。结果表明,15株H9N2分离毒的HA裂解位点氨基酸均为RSSR/GLF,具有典型低致病性AIV HA基因的特征;其第234位氨基酸均为亮氨酸（L）,因此就具有了结合人流感受体的分子特性。进化树分析表明,2022年山东地区15株H9N2流行毒株HA基因属于4.2.5分支,细分为近几年在中国鸡群中流行的4.2.5a和4.2.5.c亚分支。     

2株H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

本试验于广东省珠三角地区取样,接种SPF鸡胚纯化后分离到了2株禽流感病毒93株和101株,经过HA和HI试验鉴定均为H9亚型禽流感病毒阳性。对其HA基因进行分析后发现,此两株H9亚型禽流感病毒属于目前国内流行的H9.4.2.5分支,与近年来国内的流行毒株的核苷酸和氨基酸同源性较高。但是,其序列与国内常用的疫苗株F株SS株和SD696株存在差异,同源性较低。分子特征分析发现此2株病毒对人类受体的结合能力增强,潜在糖基化位点分布发生了改变。本试验结果证明H9毒株正在持续地进化,值得我们进一步地关注。     

13株H9N2亚型禽流感病毒HA基因变异分析

为了从分子水平上掌握我国H9亚型禽流感的病原变异情况和流行规律,本研究汇集近年来从我国部分省市养殖场分离的13株H9N2亚型禽流感毒株,采用RT-PCR技术对其HA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得全序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,13株病毒的HA基因在遗传进化树中均属于欧亚分支中的类Y280-like亚分支,与A/DK/HK/Y280/97的HA基因核苷酸序列同源性为92.2%～97.6%,与中国最早的分离株A/Chicken/Beijing/1/94(简称BJ94)相距较远,初步说明H9亚型禽流感病毒随着流行时间而发生了遗传分化。推测的HA糖基化位点的氨基酸序列12株病毒均与上述亚系相似,但有一株病毒由于一个核苷酸的变异,缺失了HA上218～220位的一个潜在的糖基化位点。     

1株HA蛋白S145变异H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定与HA基因序列分析

从山东某发病养殖场采集疑似病料,经RT-PCR检测为H9N2亚型禽流感阳性,采用鸡胚尿囊腔接种法分离病毒(SD089),并进行HA、HI试验和HA基因扩增、测序以及序列的同源性和遗传进化分析。结果显示,分离的SD089株具有血凝特性但不能被H9亚型禽流感标准阳性血清所抑制,其HA基因推导的氨基酸序列与参考毒株相比,第145位由S漂变为N,导致增加糖基化位点NGT,表明S145是血凝抑制抗体结合位点。SD089株属于BJ94分支,与2010―2014年大部分山东流行毒株的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为88.9%~97.5%和89.9%~99.6%,而与疫苗株SD696分别降至88.0%和89.1%。试验表明,分离的SD089株HA基因在分子水平上发生了变异,S145位点的突变提示低致病性禽流感的防制面临新的挑战。     

H9N2亚型禽流感流行分析及疫苗毒株的筛选

本研究旨在筛选新型免疫原性好、广谱的优秀 H9亚型禽流感病毒疫苗株。通过 H9N2分子流行病学调查对分离得到的37株禽流感 H9N2亚型病毒进行 HA 基因分子遗传进化及其关键位点分析,利用交叉 HI 效价及鸡胚中和试验分析毒株间毒力及其相关性,制备疫苗用毒株进行免疫攻毒保护试验。结果显示,从37株病毒中选出12株病毒作为代表,分为3个分支,同分支之间交叉 HI 效价及中和效价最高。HI 试验及鸡胚中和试验均显示同分支毒株间的相关系数高。免疫攻毒保护试验显示同分支疫苗株安全性高。表明我国禽流感 H9N2亚型情况复杂,且疫苗保护效果与疫苗株的抗原匹配性密切相关,生产多种分支 H9疫苗株联合更有利于控制 H9型禽流感,     

2株云南H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因序列分析

在2019年1月-2019年6月对云南出现呼吸道疫病的57个鸡场进行H9亚型禽流感检测的基础上,选取石林和楚雄2个H9亚型禽流感阳性样品进行病毒分离。从分离的H9N2亚型禽流感病毒感染鸡胚尿囊液中提取总RNA,采用特异性引物经反转录PCR分别扩增HA和NA基因,PCR产物纯化后进行测序。序列比对及系统发育分析结果表明,云南2株H9N2毒株HA基因核苷酸序列同源性为94.2%,NA基因核苷酸序列同源性为93.6%,系统进化分析表明云南H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因均属于欧亚谱系中的类ADKHKY28097分支(Y280-like),ACKYN12019和ACKYN72019 HA基因之间的同源性为94.3%,与参考毒株ACKJX2448的同源性最高,为95.6%～98.5%,与中国流行的H9N2代表株和疫苗株同源性较低。HA蛋白333-340位裂解位点为PSRSSR↓GLF,具有低致病性禽流感病毒分子特征,受体结合位点均发生E198T和Q234L的突变,具有人样受体结合特征,在29、141、298、305、313、492位氨基酸有6个糖基化位点。ACKYN12019和ACKYN72019 NA基因同源性为93.6%,与Y280-like代表毒株的同源性分别为97.1%～97.5%和93.7%～94.6%,NA蛋白缺失63、64、65位氨基酸,在44、69、86、146、200、234位氨基酸处存在6个潜在的糖基化位点,NA蛋白红细胞结合(HB)位点分析发现,368-369、399-403、432位氨基酸处存在变异。研究结果显示,H9N2亚型禽流感病毒一直处于不断的变异之中,故应加强其监测与防控。     

6株H9N2亚型禽流感病毒的分子演化和抗原变异分析

H9N2亚型禽流感持续在我国鸡群中广泛流行,为了明确2017年山东省聊城市一肉鸡场H9N2亚型禽流感病毒的分子演化和抗原变异情况,对6株H9N2亚型病毒分离株进行了基因扩增、序列测定和进化分析,并分别使用病毒分离株和疫苗株抗原进行血凝抑制试验,比较免疫鸡血清的抗体效价差异。结果如下:NCBI Blastn分析表明,与各分离株基因同源性最高的序列分别来源于山东、河北、上海、江苏、浙江、江西、湖南、广东和日本等地的分离株,表明H9N2亚型禽流感病毒传播范围广,基因重排活跃。各基因的系统进化分析表明,分离株的8个基因片段分别与禽流感病毒欧亚分支的A/duck/HongKong/Y280亚系、A/quail/HongKong/G1/97亚系以及A/chicken/Shanghai/F/98亚系进化关系密切。从病毒基因型上来分析,6株病毒均隶属于2010年以来在国内鸡群中广泛流行的G57基因型。与耐药性相关的氨基酸位点分析表明,病毒M2蛋白存在S31N变异,表明病毒对离子通道蛋白抑制剂耐药。对1 000份疫苗免疫鸡血清进行血凝抑制抗体效价的检测,发现H9N2亚型禽流感分离株抗原与疫苗用标准抗原相比,所测得的血凝抑制抗体滴度平均低1~2log2,表明二者HA抗原性略有差异。总之,2017年在该肉鸡场流行的这6株H9N2亚型禽流感病毒仍然为G57基因型,分离株的HA抗原反应性与疫苗株略有差异。     

3株H9亚型禽流感病毒的分离与遗传进化分析

2011年1月至3月,从江苏地区免疫蛋鸡群中分离出了3株H9亚型禽流感病毒(AIV),为了了解H9亚型禽流感在免疫鸡群中发生与流行的原因,研究采用RT-PCR技术对该病毒HA和NA基因进行扩增和测序,并对所得全序列进行同源性和遗传进化分析。研究结果显示:分离株与近期华东地区H9亚型AIV分离株关系最近;3株毒株之间的HA和NA基因均具有很近的亲缘关系,但在遗传发生树上与疫苗株具有较远的遗传距离,分离株与疫苗株之间的同源性在91%左右。     

两株H6N2亚型鸡源禽流感病毒的分离鉴定

本研究利用血凝抑制试验(HI)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因测序等方法,对广东省某活禽交易市场进行流行病学调查时获得的两株非H5、H9亚型禽流感病毒65株和C7株进行了亚型鉴定。结果表明这两株病毒均具有血凝活性,且能被抗H6亚型禽流感病毒标准阳性血清特异性抑制。用针对禽流感病毒的M基因、H6亚型禽流感病毒HA基因、N2亚型禽流感病毒NA基因特异性鉴定引物对65株和C7株进行RT-PCR扩增,分别获得特异性目的片段。测序及BLAST分析表明两株分离株与H6N2亚型禽流感广东分离株的HA基因和NA基因核苷酸序列相似性均高达95%以上。将该两分离株鉴定为H6N2亚型禽流感病毒,并命名为A/Chicken/Guangdong/65/2009、A/Chicken/Guangdong/C7/2009。     

山东部分地区H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及HA和NA基因的遗传进化分析

为了解山东省H9亚型禽流感病毒变异情况和流行规律,于2013年从山东省潍坊、淄博、青岛、临沂、济南、滨州和烟台等地区疑似禽流感病鸡病料中分离到14株病毒,通过病毒分离培养、血凝与血凝抑制试验、RT-PCR技术进行了鉴定,并对获得病毒的HA基因和NA基因序列进行了同源性和遗传进化分析。结果显示,分离病毒均能凝集鸡的红细胞并能被禽流感病毒H9标准阳性血清抑制,RT-PCR方法从分离株中扩增出HA基因和NA基因保守片段,序列比对表明分离株与山东日照分离株A/Chicken/Rizhao/853/2013(H9N2)具有较高同源性,达94.4%以上,证实分离毒株为H9N2亚型禽流感病毒。HA裂解位点处的氨基酸序列为-PSRSSR/GL-,符合低致病性禽流感病毒的分子特征。HA、NA基因遗传进化分析表明,分离株与代表株DK/Y280/97亲缘关系最近,核苷酸同源性分别达90.3%和93.6%以上,属于国内常见的CK/BJ/94分支中的Y280-like亚分支。     

我国部分地区H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传进化分析

于2008～2013年从江苏、山东、河南、河北等地分离鉴定出45株H9N2亚型禽流感病毒,采用PCR扩增分离株HA基因,并进行HA基因测序、核苷酸同源性分析及遗传进化分析.同源性比较结果显示:45个毒株的HA基因与我国现有疫苗株的HA基因核苷酸同源性为89.1％～94.4％,其中与HP株和F98株的HA基因核苷酸同源性分别为91.3％～94.4％和89.1％～92.0％.遗传进化分析结果显示,分离株的HA基因均属于欧亚谱系A/DK/HK/Y280/97-like分支亚系,证明当前我国大部分地区的H9N2亚型禽流感病毒在同源疫苗的免疫选择压力下,其HA基因与现有疫苗株相比已发生了较大的遗传漂变.     

2016-2021年广西H9亚型禽流感病毒HA和NA基因遗传进化动态分析

【目的】研究H9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)广西毒株的遗传进化动态,以期掌握其地域流行新特点,为及时优化调整有效防控措施提供数据支持。【方法】采集2016-2021年广西各地的家禽喉头、泄殖腔及环境拭子样品3 600份,接种9～11日龄SPF鸡胚分离病毒,并结合血凝和血凝抑制试验及实时荧光定量RT-PCR方法鉴定AIV亚型,根据毒株检测年限和来源地选取部分H9亚型AIV核酸阳性样品进行HA、NA基因扩增、测序及进化动态分析。【结果】共获得46株H9亚型AIV广西毒株的HA、NA基因序列,其中HA基因全长1 683 bp,编码560个氨基酸;4株NA基因全长1 410 bp,编码469个氨基酸,42株缺失3个氨基酸,编码466个氨基酸。BLAST分析结果显示,越南及国内多个省份的毒株与本研究获得的广西毒株HA、NA基因相似性最高,分别为97.62%～99.88%和93.13%～99.79%,宿主源也不尽相同,表现遗传多样性特征。广西毒株之间HA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为93.0%～99.1%和94.6%～99.1%,NA基因核苷酸和氨基酸...     

H9N2亚型禽流感病毒河南分离株的全基因克隆及序列分析

为了研究H9N2亚型禽流感病毒的基因组变异情况,试验以一株2015年在河南省分离的H9N2亚型Ck/HN/12/15为研究对象,用RT-PCR方法扩增病毒基因组的8个基因片段并进行克隆和测序,将测序结果与Gen Bank公布的H9N2参考毒株序列进行比对分析,绘制各基因片段的进化树。结果表明:分离株的PB1、PA、NP、NS基因与1998年中国上海鸡源毒株Ck/SH/F/98(H9N2)归于同一进化分支,核苷酸序列同源性分别为93.57%、90.48%、87.66%和86.64%。分离株的HA、NA基因与1997年中国香港鸭源毒株Dk/HK/Y280/97(H9N2)属同一个进化分支,核苷酸序列同源性分别为87.62%和85.32%。该毒株裂解位点处的序列是PSRSSR,符合低致病性禽流感病毒的分子特点。该株HA基因的226位(对应H3亚型位置)氨基酸为Leu,更易与哺乳动物唾液酸受体结合。说明应该做好对此类H9N2亚型禽流感病毒免疫防控工作,避免在人和禽类之间传播。     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组新城疫病毒的拯救

对现地分离的4株H9亚型禽流感病毒HA基因进行序列测定,选取其中1株在新城疫病毒 La Sota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的基础上,构建了表达H9亚型禽流感病毒野生型HA基因的重组新城疫病毒基因组cDNA克隆,经间接免疫荧光和RT-PCR鉴定,结果表明:拯救重组病毒为rL-H9HA;重组病毒MDT≥168 h,ICPI和IVPI均为0,与亲本疫苗株La Sota具有相似的生长特性;重组病毒保持了La Sota弱毒疫苗亲本毒株对鸡胚良好的高滴度生长适应和低致病特性,具有作为同时预防H9亚型禽流感和新城疫的双价苗的应用前景.     

2013—2014年H7亚型禽流感病毒遗传进化分析

对2013—2014年15株不同来源的H7亚型禽流感病毒国内分离株进行了基因组测序与遗传进化分析。结果显示,15株H7亚型禽流感病毒具有遗传多样性,可分为2种亚型:13株为H7N9亚型,2株为H7N3亚型。HA蛋白裂解位点附近氨基酸分析显示所有H7亚型流感分离株均为低致病性毒株。基因组遗传进化分析显示,13株H7N9亚型禽流感病毒均与2013年人源分离株同源性较高,但具有2种遗传学特性,13株病毒的PB2、PA、HA、NP、NA、M和NS基因高度同源,而PB1基因来源于2个不同分支。2株H7N3亚型流感病毒与国内鸭源分离株同源性较高。15株H7亚型禽流感病毒PB2蛋白均未出现627K、701N等与哺乳动物适应性相关的氨基酸变异。13株H7N9亚型禽流感病毒HA裂解位点附近氨基酸(EIPKGR/GL)与人源H7N9病毒一致,且HA蛋白和M2蛋白分别具有与哺乳动物适应性和金刚烷胺耐药性相关的标志性变异,而2株H7N3亚型禽流感病毒未出现上述氨基酸变异。     

33株H9N2亚型禽流感病毒分离株分子流行特点的研究

在1998至2007年期间,采集了我国不同地区、不同宿主来源的H9N2亚型禽流感病毒株,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HA基因,获得33株H9N2亚型禽流感病毒的核苷酸序列。结合GenBank中公开发表的其他国内H9亚型禽流感HA基因序列共65株,应用计算机软件绘制进化树,进行H9亚型禽流感病毒谱系全景分析,探索H9亚型禽流感的流行趋势。分析结果表明:这65株的基因进化树主要分为三个系列,每个系列毒株均呈现全国性流行分布;三个系列毒株可在同一时间段内、同一地区发生流行;不同时间的流行毒株虽有变异,但大部分归属于三个系列中。无论从时间的推移上还是地域的转变中,病毒均没有表现出明显的时间演变与地理分布特征,进一步显示了H9亚型禽流感的复杂性和多样性。