小桐子基因组DNA的提取及ISSR-PCR反应体系的优化

为从小桐子嫩叶中提取高质量的基因组DNA.采用改良CTAB法提取的基因组DNA通过OD260/OD280比值测定,琼脂糖凝胶电泳和ISSR-PCR扩增检测,结果表明改良CTAB法提取的DNA纯度高.可作为ISSR分子标记的模板.同时,采用正交设计的方法,对影响小桐子ISSR-PCR反应体系中的4个因素(引物、Taq DNA Polymerase、10xBuffer(含Mg2 )、dNTPs)在3个水平上进行优化试验.建立了适合小桐子的既稳定又能扩出最多数量谱带的ISSR最优反应体系,即20μl的反应体系中含有30ng模板DNA、0.2mmol/L dNTP、0.3 U Taq酶Polymerase、0.8μmol/L Primer、3.0hanoi/L10×Buffer(含Mg2 ).     

石斛属植物ISSR扩增体系的建立与优化

旨在建立并优化石斛属植物的ISSR-PCR反应体系。通过对ISSR-PCR反应体系中主要影响因子模板DNA、dNTP、10×PCR Buffer、引物以及Taq DNA聚合酶分别进行单因素优化,最终建立一套适用于石斛属植物的扩增多态性高、稳定性强、带型清晰的ISSR最佳反应体系。20μL反应体系的适宜浓度及用量分别为：模板DNA 10 ng/μL 3μL,dNTP 2.5 mmol/L 1.5μL,10×PCR Buffer 3.0μL,引物4μmol/L 3.5μL,TaqDNA聚合酶5 U 0.2μL。这一优化体系适用于石斛ISSR分析,为今后遗传多样性与亲缘关系分析、连锁图谱构建、QTL定位、基因定位与克隆等方面的研究提供了技术支撑。     

百合属ISSR反应条件优化的研究

建立一个稳定性高、重现性好,适合百合ISSR遗传差异分析的PCR反应体系。设定反应体系中各因子的不同浓度并进行PCR扩增,依据稳定性高、重现性好的原则,对该反应体系进行调整与优化,最终建立稳定可靠的ISSR反应体系。适于百合ISSR-PCR反应的最佳体系(25μL)为：40 ng模板DNA,2.0 mmol/L Mg²⁺,1.5 U TaqDNA聚合酶,0.8μmol/L引物,200μmol/L dNTPs;扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性1 min,51.8℃退火1 min,72℃延伸2 min,共35个循环;最后72℃延伸8 min。所建立的百合ISSR反应体系具有稳定性高、重现性好、检测多态性能力强等特点,为应用ISSR标记技术进行百合属植物遗传多样性分析和品种分子鉴别等研究奠定了技术基础。     

适合于狗尾草属遗传分析的ISSR标记筛选及反应体系优化研究

利用公共数据库已有的ISSR序列信息,检验了29条ISSR引物在谷子等狗尾草属植物基因组的扩增性,其中14条在狗尾草属中有良好扩增,其余15条在狗尾草属中无任何扩增。能稳定扩增的14条引物全为3'-锚定引物,6条5'-锚定引物在狗尾草属中得不到扩增。研究发现AG,GA和CA重复的引物在狗尾草属植物有较好扩增,且多态性强。利用正交试验设计,从Mg2 、dNTP、引物、Taq酶4种因素、4个水平对狗尾草属谷子ISSR反应体系进行优化,确定了适合谷子的ISSR反应体系,在20μL体系中,含1×PCR buffer、Mg2 浓度2.0 mmol/L,dNTP浓度0.25 mmol/L,Taq酶0.4μL,引物浓度0.25μmol/L,50 ng模板,通过梯度PCR确定了引物的退火温度。本研究筛选的ISSR引物及建立的优化反应体系可用于谷子等狗尾草属植物遗传多样性和基因组研究,并对其他近缘作物有指导意义。     

龙眼ISSR反应体系的建立和优化

对影响龙眼ISSR－PCR扩增反应的各个参数进行优化,建立适合龙眼的ISSR反应体系：PCR反应体积为20μl,其中模板DNA 25ng,引物0.2μmol/L,dNTP 100μmol/L,Taq DNA聚合酶0.5U,MgCl2 2.5mmol/L,10×PCR缓冲液2.0μl;扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性1min,退火温度1min,72℃延伸90s,40个循环;72℃延伸7min     

丝瓜ISSR反应体系的优化

以丝瓜基因组DNA为模板,对ISSR反应中主要5个影响因素Mg~(2+)浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、引物浓度和DNA模板浓度,建立丝瓜ISSR-PCR反应的体系。根据实验确定的最佳反应体系为:25μL ISSR体系:50 ng DNA,0.2 mmol/L dNTP,1 U Taq酶,0.4μmol/L的单条引物,2.5μL 10×Buffer,2.0 mmol/L Mg~(2+)。在此基础上,对12个引物的退火温度进行优化。最终选用60份丝瓜品种对所确定的扩增体系及扩增程序进行验证,检测结果表现为扩增产物条带清晰明亮、亮度高和重复性好,表明本试验所确定的反应体系及反应程序适用于丝瓜的ISSR分子标记为丝瓜种质资源的鉴定、分类和丝瓜的杂交育种提供参考依据。     

枫香ISSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为探索最适的枫香叶片DNA提取方法、最优ISSR引物和最佳ISSR-PCR扩增反应体系,本试验采用改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、十二烷基硫酸钠(SDS)法、高盐低pH法和试剂盒法提取枫香叶片DNA;采用三因素五水平(DNA模板用量,2×Taq Master Mix用量引物浓度)正交试验构建并优化枫香的ISSR-PCR反应体系;对100条ISSR引物进行筛选及其退火温度优化。结果表明：改良CTAB方法提取的DNA浓度高,且电泳条带清晰无污染;SDS和试剂盒方法提取DNA的浓度低,电泳条带亮度低;高盐低pH值法提取的DNA的电泳条带模糊且降解拖尾现象严重。DNA模板浓度为20 ng、Taq Master Mix用量为10μL、引物浓度为0.6μmol/L、ddH₂O为7.8μL时扩增程序的条带最清晰、多态性最好。筛选出17条重复性强、条带清晰明亮、多态性高的ISSR引物及其最适退火温度,其中扩增位点数最多的为引物UBC-834、UBC-836和UBC-853,扩增位点均为13个,以UBC-878为ISSR引物时的扩增反应中,当退火温度在46.9℃的时候能够扩...     

基于SRAP分析的盘龙参DNA提取

以盘龙参为材料,采用CTAB法提取基因组DNA,探讨SRAP-PCR反应体系中模板DNA浓度对扩增的影响。结果表明:该CTAB法提取基因组DNA的OD260/OD280为1.81,浓度为4.35μg/μL。该CTAB法提取的基因组DNA纯度好,片段完整,无降解;在20μL反应体系中,模板DNA浓度为3.0 ng/μL时,重复性和稳定性较好,适于SRAP-PCR技术。     

黄皮ISSR－PCR反应体系的优化

摘 要：采用单因素和正交试验对ISSR-PCR扩增黄皮基因组DNA的主要影响因子进行筛选和分析,建立了适宜于黄皮ISSR分析的扩增体系：20 μL的反应体系中含30 ng的模板DNA、1.5 U TaqDNA聚合酶、0.4 μmol/L引物、0.3mmol/L dNTPs以及引物(gA)8C的最佳退火温度为52.4℃。     

杏ISSR反应体系的建立

为建立杏适宜的ISSR反应体系,以红玉杏为试材,探讨影响ISSR扩增的主要因素包括模板浓度、MgCl2浓度、dNTPs浓度、引物浓度及循环次数。通过筛选及优化,确定杏ISSR的适宜扩增条件。结果表明,在25 μl PCR反应体系中,各组分的适宜浓度配比为：模板1 μl（40 ng）、dNTPS 2.5 μl（2.5 mmol/L）、Taq DNA聚合酶0.5 μl（2.5 U）、引物1 μl（20 μmmol/L）、10×PCR Buffer 2.5 μl、MgCl2 2.5 μl（2.5 mmol/L）、ddH2O 15 μl,反应循环次数40次。同时利用建立的ISSR反应体系对3种普通杏品种进行扩增,证明该体系完全适合此标记对杏不同品种的遗传分析,从而为下一步杏资源遗传多样性的研究提供理论依据和参考价值。     

芒草ISSR分子标记体系的确定及引物的筛选

为建立并优化适用于芒草的ISSR-PCR扩增反应体系,进一步研究野生芒草群体的遗传多样性水平。以吉林省采集的芒草(Miscanthus sinensis)为材料,采用单因子试验的方法研究模板DNA、TaqDNA聚合酶的用量及引物浓度和退火温度对PCR扩增的影响。结果显示：在20 μL反应体系中,含有模板DNA 40 ng,dNTPs 0.4 mmol/L,引物0.6 μmol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U。此外,筛选到10 条扩增稳定、条带丰富的候选引物,并确定了各自的最佳退火温度。     

砂仁及其混伪品益智仁的ISSR分子鉴别

为创建砂仁及其主要混伪品益智仁的ISSR分子鉴别方法,以UBC818为引物,对影响ISSR-PCR反应体系的引物、dNTPs、DNA模板、Taq DNA聚合酶和Mg2+浓度进行5因素4水平正交优化试验,并在此基础上筛选阳春砂ISSR引物及砂仁正伪品的鉴别引物。结果表明,20μL阳春砂ISSR-PCR最佳反应体系包括引物0.5μmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、DNA模板40 ng、Taq DNA聚合酶1.2 U、Mg^2+2.0 mmol/L;从52条ISSR引物中筛选出10条阳春砂ISSR引物,从6条阳春砂和益智的共同引物中,筛选出扩增条带清晰、多态性强的砂仁正伪品的鉴别引物UBC808,利用UBC808对15份样品进行验证试验,结果表明鉴别体系稳定性好,可用于砂仁与益智仁的快速、准确鉴别。     

新疆野生欧洲李ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立适合新疆野生欧洲李的ISSR-PCR反应体系,本研究以野生欧洲李为供试材料,采用L₁₆(4⁵)正交试验设计和单因素试验设计相结合的方法,对影响野生欧洲李ISSR-PCR反应体系的5个因素(DNA模板,Taq酶,dNTPs,引物,Mg²⁺)进行筛选与优化,对16条引物的退火温度进行筛选。结果表明,Taq酶对PCR扩增反应的影响最大,野生欧洲李ISSR-PCR最佳反应体系为:总体积20μL,5 U Taq酶0.10μL,10 mmol/L引物1.00μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.50μL,10×Buffer(含Mg²⁺)2.00μL,50 ng/μL DNA模板1.00μL,双蒸水14.40μL。建立的ISSR-PCR反应体系经过22份野生欧洲李样品验证,表明反应体系稳定可靠,可用于后续遗传多样性研究,为野生欧洲李种质资源的保护和利用提供理论参考。     

长柄石杉ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

长柄石杉ISSR反应体系的建立能为利用ISSR标记技术进行长柄石杉品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定良好基础。利用正交试验设计的方法,从dNTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度和Mg2+浓度4种因素,对长柄石杉ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度进行梯度检测。结果表明,20 μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为1×PCR buffer、300 μmol/L dNTP、0.2 μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、1.75 U Taq DNA聚合酶、40 ng模板DNA。该优化体系的建立为下一步进行长柄石杉ISSR分子标记奠定了基础。     

冬虫夏草RAPD反应体系的建立及优化

为建立并优化冬虫夏草RAPD反应体系,通过改变RAPD反应体系中Mg2+、dNTP、引物、模板等主要成分的浓度,结合RAPD扩增效果,建立冬虫夏草RAPD反应体系,然后通过改变主要热循环参数,优化冬虫夏草RAPD反应体系。结果表明：适合冬虫夏草的RAPD反应体系为25 μL体系中内含1×PCR缓冲液、1.5 μmol/μL Mg2+、320 μmol/L dNTP、24 ng引物、20 ng模板、1 U Taq酶;扩增程序的优化结果为：95℃预变性5 min,然后35个循环（94℃变性45 s,36℃复性1 min,72℃延伸2 min）,循环结束后72℃延伸7 min。综上,RAPD技术可用于冬虫夏草的鉴定、评价分析。     

苦瓜基因组DNA的提取及ISSR扩增体系的优化

为了快速获取高质量的苦瓜基因组DNA,以便进行苦瓜白粉病抗性基因分子标记研究,比较了不同的DNA提取方法、不同部位的苦瓜叶片提取基因组DNA的产量和质量,探究了苦瓜基因组DNA提取的最佳方法和叶片的最适部位;研究了ISSR-PCR的退火温度,并采用正交设计法对影响ISSR-PCR的Mg²⁺、dNTPs、Taq酶、模板DNA以及引物浓度等5个因素进行了优化。结果表明,采用改良CTAB法从苦瓜顶端嫩叶中提取的基因组DNA OD260/OD280值在1.8~1.9之间,OD260/OD230值为2.0左右,对DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测,主带清晰,降解较少,产量和纯度均较高,效果较好。优化后的ISSR-PCR反应体系为：2.5μL 10×PCR buffer,2.5 mmol/L MgCl₂,250μmol/L dNTPs,10 ng模板DNA,0.75 U Taq酶,引物浓度0.7μmol/L,反应总体积为25μL,引物UBC826最佳退火温度为53℃。该体系在多次重复中均能获得良好的扩增结果。苦瓜基因组DNA提取的最佳方法为改良CTAB法,最适合的部位为顶端嫩叶。     

梨ISSR-PCR反应体系的优化及在SRAP、SSR标记中的通用性研究

为获得最佳的梨ISSR-PCR反应体系,以及验证在其他标记上具有通用型,以‘新世纪梨’ב崇化大梨’杂交F1代为试验材料,采用L₂₅(5⁶)试验正交设计法及单因素方法,对反应体系中的模板DNA量、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶这4个单因素进行优化。结果表明,梨ISSR-PCR最优的20μL体积的反应体系中,含模板DNA 3 ng/μL,dNTPs 0.20 mmol/L,引物0.5μmol/L,TaqDNA聚合酶0.03 U/μL。采用优化后的反应体系对试验材料进行了SRAP、SSR标记方法的扩增,结果显示该反应体系也适用于梨属的SRAP、SSR分析。为梨属在以后的多标记的遗传多样性分析、种质资源评价和遗传图谱的构建等提供理论基础,并在试验中减少费用和提高效率。     

萝卜ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

本研究利用正交设计L16(45)对萝卜ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化试验。研究结果表明,获得了最佳的反应体系,在10μL反应体系中,含TaqDNA聚合酶0.6U﹑Mg2+2.0mmo/L﹑模板DNA 40ng﹑dNTP 250μmol/L﹑引物0.25μmol/L﹑10×PCRBuffer,不足部分以ddH2O补足。确立了以UBC876为引物的最优反应条件,退火温度为48℃,总循环数为40次。新优化的萝卜ISSR-PCR的反应体系和程序有很好的重复性和稳定性好。此研究为今后利用ISSR技术对萝卜进行种质资源分类﹑遗传图谱构建和基因定位奠定了基础。